Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis / Leishmaniasis is a group of diseases with a wide spectrum of clinical manifestations, which range from self-limited skin lesions to severe visceral involvement that can lead to death. Leishmaniasis is still a neglected disease, and it is among the priorities of the research program on diseases of poverty of World Health Organization (TDR/WHO). There is no available vaccine and the treatment is based on drugs that cause serious side effects, and are unaffordable in several endemic countries. Metal-based drugs represent a novel antimicrobial and anti-cancer therapeutics arsenal. Peptidase inhibitors/chelating agents such as 1,10-phenanthroline and its substituted derivatives, either the metal-free state or as ligands coordinated to transition metals, interfere with crucial functions of several biological systems. In previous works, our group described that L. braziliensis produced gp63 molecules sensible to 1,10-phenanthroline. Herein, we initially studied the cellular distribution of gp63 in a virulent strain of L. braziliensis by biochemical and immunocytochemical analyses. After that, we reported the inhibitory effects of three 1,10-phenanthroline derivative compounds, 1,10-phenanthroline-5,6-dione (phendio), [Cu(phendio)2]and [Ag(phendio)2], on both cellular and extracellular metallopeptidase activities produced by L. braziliensis promastigotes as well as their actions on the parasite viability and on the interaction with murine macrophage cells. The gp63 molecules were detected in several parasite compartments, including cytoplasm, membrane lining the cell body and flagellum, and flagellar pocket. The treatment of L. braziliensis promastigotes for 1 hour with 1,10-phenanthroline and its derivatives resulted in a significant inhibition of cell viability and showed an irreversible mechanism of action. These metallopeptidase inhibitors induced apoptosis in L. braziliensis promastigotes as judged by annexin/propidium iodide staining and TUNEL assays. The pre-treatment of promastigotes with metallopeptidase inhibitors induced a reduction on the expression of surface gp63 as well as a significant reduction on the association index with macrophages. In parallel, the treatment of L. braziliensis-infected macrophages with the 1,10-phenanthroline and its derivatives promoted a powerful reduction on the number of intracellular amastigotes. The treatment of macrophage cells with 1,10-phenantroline and its derivatives did not induce nitric oxide production. A synergistic inhibition on the growth ability was observed when 1,10-phenanthroline derivative compounds and Glucantime were used at sub-inhibitory concentrations. In vivos the compounds 1,10-phenanthroline derivatives and its were able to control the lesions size from the third week of treatment on, when compared to untreated control infected hamsters. The animals treated with the compounds showed greater response to the intradermal antigens of L. braziliensis. Collectively, the 1,10-phenanthroline and its metal-based drugs present a good perspective for prospective studies to the development of new anti-L. braziliensis drugs

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis / Leishmaniasis is a group of diseases with a wide spectrum of clinical manifestations, which range from self-limited skin lesions to severe visceral involvement that can lead to death. Leishmaniasis is still a neglected disease, and it is among the priorities of the research program on diseases of poverty of World Health Organization (TDR/WHO). There is no available vaccine and the treatment is based on drugs that cause serious side effects, and are unaffordable in several endemic countries. Metal-based drugs represent a novel antimicrobial and anti-cancer therapeutics arsenal. Peptidase inhibitors/chelating agents such as 1,10-phenanthroline and its substituted derivatives, either the metal-free state or as ligands coordinated to transition metals, interfere with crucial functions of several biological systems. In previous works, our group described that L. braziliensis produced gp63 molecules sensible to 1,10-phenanthroline. Herein, we initially studied the cellular distribution of gp63 in a virulent strain of L. braziliensis by biochemical and immunocytochemical analyses. After that, we reported the inhibitory effects of three 1,10-phenanthroline derivative compounds, 1,10-phenanthroline-5,6-dione (phendio), [Cu(phendio)2]and [Ag(phendio)2], on both cellular and extracellular metallopeptidase activities produced by L. braziliensis promastigotes as well as their actions on the parasite viability and on the interaction with murine macrophage cells. The gp63 molecules were detected in several parasite compartments, including cytoplasm, membrane lining the cell body and flagellum, and flagellar pocket. The treatment of L. braziliensis promastigotes for 1 hour with 1,10-phenanthroline and its derivatives resulted in a significant inhibition of cell viability and showed an irreversible mechanism of action. These metallopeptidase inhibitors induced apoptosis in L. braziliensis promastigotes as judged by annexin/propidium iodide staining and TUNEL assays. The pre-treatment of promastigotes with metallopeptidase inhibitors induced a reduction on the expression of surface gp63 as well as a significant reduction on the association index with macrophages. In parallel, the treatment of L. braziliensis-infected macrophages with the 1,10-phenanthroline and its derivatives promoted a powerful reduction on the number of intracellular amastigotes. The treatment of macrophage cells with 1,10-phenantroline and its derivatives did not induce nitric oxide production. A synergistic inhibition on the growth ability was observed when 1,10-phenanthroline derivative compounds and Glucantime were used at sub-inhibitory concentrations. In vivos the compounds 1,10-phenanthroline derivatives and its were able to control the lesions size from the third week of treatment on, when compared to untreated control infected hamsters. The animals treated with the compounds showed greater response to the intradermal antigens of L. braziliensis. Collectively, the 1,10-phenanthroline and its metal-based drugs present a good perspective for prospective studies to the development of new anti-L. braziliensis drugs

A descoberta de aminopeptidase regulada por insulina (IRAP), a qual hidrolisa peptídeos como ocitocina e vasopressina e é receptora de angiotensina IV, destaca a importância do estudo do envolvimento de peptidases na função endócrina do adipócito. Estudos recentes detectaram alterações das atividades de aminopeptidase neutra e de dipeptidil peptidase IV (DPPIV) no plasma e no hipotálamo e hipocampo na obesidade induzida por glutamato monossódico (MSG). A presente tese propôs (i) a existência de atividades aminopeptidásicas ácida (APA), básica (APB), neutra insensível (APM) e sensível à puromicina (PSA), metionil (MetAP) e DPPIV, além da já conhecida (leucil (LAP)/cistil (CAP)/IRAP), nas frações de membrana plasmática (FM) e de alta (HDM) e baixa (LDM) densidade microssomal de adipócitos isolados do depósito de gordura retroperitoneal; (ii) que suas atividades catalíticas, expressões gênicas e tráfego subcelular seriam diferenciados entre obesos induzidos por MSG, submetidos ou não à privação alimentar e em animais controle sadios, submetidos ou não a privação alimentar; (iii) e influenciadas por insulina, angiotensina II, angiotensina IV e vasopressina. A existência de todas essas aminopeptidases no adipócito foi demonstrada, sendo a APM a que apresenta maior Vmax e maior eficiência catalítica e a APA a maior afinidade. Os animais obesos apresentaram aumento do diâmetro médio dos adipócitos e aumento do lipócrito, caracterizando hipertrofia adipocítica, enquanto os controles privados de alimento tiveram um aumento no número de adipócitos e aumento no lipócrito, caracterizando hiperplasia adipocítica. Pela primeira vez, um perfil variado de atividades aminopeptidásicas distribuídas em diferentes compartimentos subcelulares do adipócito é evidenciado juntamente com a demonstração de diferenças no padrão de distribuição destas atividades entre os ratos obesos e sadios, privados ou não de alimento. Dentre as novas aminopeptidases detectadas no adipócito não há nenhuma com a característica clássica de IRAP. No geral, as alterações das atividades catalíticas nas diferentes situações sob estudo mostram o envolvimento dessas novas aminopeptidases na regulação endócrina do balanço energético (provavelmente via ação hidrolítica sobre angiotensina II e vasopressina) sob modulação por angiotensina IV (APB, APM, DPPIV, LAP/IRAP, MetAP e PSA em animais controle sadios e APB em animais controle privados de alimento), angiotensina II (APB e PSA nos animais obesos) e vasopressina (APB nos animais obesos privados de alimento; e influenciadas em seu tráfego subcelular por angiotensina II (CAP, DPPIV e LAP/IRAP) e angiotensina IV (LAP/IRAP). O tráfego subcelular da conhecida atividade CAP/IRAP mostrou-se suscetível à insulina e vasopressina / The discovery of insulin-regulated aminopeptidase (IRAP), which hydrolyzes peptides such as oxytocin and vasopressin and is an angiotensin IV receptor, highlights the importance of the involvement of peptidases in the endocrine function of adipocyte. Recent studies have detected changes in aminopeptidase activities of neutral aminopeptidase and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) in the plasma and in the hypothalamus and hippocampus of rats with obesity induced by monosodium glutamate (MSG). The present thesis proposes (i) the existence of acid (APA), basic (APB), neutral insensitive (APM) and puromycin sensitive (PSA) aminopeptidases, methionyl aminopeptidase (MetAP) and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), besides the well-known cystyl (CAP) / leucine aminopeptidase (LAP) / IRAP) in plasma membrane (MF) and in high (HDM) and low (LDM) density microsomes of isolated adipocytes from retroperitoneal fat pad; (ii) that their catalytic activities, gene expression and subcellular trafficking were different among MSG-induced obese and healthy control rats (food deprived or not); (iii) and influenced by insulin, angiotensin II and IV, and vasopressin. The existence of all these adypocite aminopeptidases was demonstrated. APM has a highest Vmax and catalytic efficiency, while APA has a highest substrate affinity. The obese animals have increased mean diameter of adipocytes and lipocrit, characterizing hypertrophy, while the food deprived rats had an increased number of adipocytes and lipocrit, characterizing hyperplasia. For the first time, a profile of varied aminopeptidases activities distributed in different subcellular compartments of adipocyte is evidenced together with the demonstration of differences in the distribution pattern of these activities among the obese and healthy rats, food deprived or not. Among these novel aminopeptidases detected in adipocytes there is no one with the classical characteristic of IRAP. In general, changes on catalytic activities in these different situations show the involvement of these novel aminopeptidases in the endocrine regulation of energy balance (probably via hydrolytic action on angiotensin II and vasopressin) under modulation by angiotensin IV (APB, APM, DPPIV, LAP/IRAP, MetAP and PSA in healthy animals and APB in food deprived healthy animals), by angiotensin II (APB and PSA in obese) and by vasopressin (APB in food deprived obese animais); and under influence of by angiotensin II (CAP, DPPIV, LAP/IRAP) and angiotensin IV (LAP/IRAP) on their subcellular trafficking. Subcellular trafficking of the well-known CAP/IRAP was susceptible to insulin and vasopressin

The family of human kallikrein-related peptidases (KLKs) numbers 15 serine proteinases implicated in tumour progression. Despite the wide tissue distribution of KLKs and the numerous reports of their differential expression in pathological settings, the signalling mechanism(s) whereby these enzymes regulate tissue function are not yet known. Further, knowledge of the levels of their activity, as well as of their potential endogenous targets, has only been extracted from in vitro studies and cell culture systems. We hypothesized that KLKs can trigger tumour signalling via proteinase-activated receptors (PARs), a family of G-protein-coupled receptors. To test our hypothesis, we evaluated the ability of KLKs 5, 6, and 14: to activate or prevent signalling via PARs 1, 2, and 4 in cells and tissues expressing these receptors. Further, we used a novel activity-based probe approach, coupled with conventional immunoassay (ELISA), to determine the abundance of active KLK6 relative to total immunoreactive KLK6 in cancer-related biological fluids. We concluded that KLKs can regulate multiple signalling pathways triggered by PARs 1, 2, and 4, resulting in calcium release, platelet aggregation and vascular relaxation, and they can cause murine inflammation. Further, our activity-based ELISA demonstrated the presence of active KLK6 in ovarian cancer ascites fluids and cancer cell supernatants. We, therefore, suggest that tumours can produce active KLKs, which can potentially control tumour behaviour by regulating PAR activity.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Our experimental organism Fascioloides magna is a digenetic liver fluke from Fasciolidae family which parasitizes in domestic and free-living ruminants of North America and Central Europe including Czech Republic. In Czech Republic this highly pathogenic worm causes a severe liver damage to cervids and bovids and the prevalence locally reaches up to 95%. The biology of F. magna including e.g. the characteristics of host-parasite molecular interaction and the functions of particular molecules produced by the parasite are not fully understood. According to results of our previous research the excretory-secretory products of F. magna adults contain number of molecules which play the crucial role in host tissue invasion, digestion and evasion of the host immune response. One of the most abundant is cysteine peptidase cathepsin L (FmCL). FmCL is supposed to play various key roles in biological processes of all stages during a life cycle and therefore we can suppose its different expression level in particular life stages. In order to define the expression level of FmCL we performed the pilot study with miracidia and adults where the qPCR method was applied. The results of this experiment revealed much higher expression level of FmCL1 in adults than in miracidia. The attempt to in situ localize the mRNA...

Thèse de Doctorat en Sciences Vétérinaires Résumé Orientation: Médecine Vétérinaire Titre de la thèse en français: Contribution à létude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis » Titre de la thèse en anglais: Contribution to the functional study of dipeptidyl peptidases and MEP3 metalloprotease secreted by Microsporum canis Candidat: Sandy Vermout Promoteur: Dr Bernard Mignon Co-promoteur: Prof. Bertrand Losson Département et Service: Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires, service de Parasitologie et de Pathologie des Maladies Parasitaires Date de la défense publique: Composition du Jury: Description du sujet de recherche abordé: Les dermatophytes sont des champignons filamenteux responsables de mycoses superficielles contagieuses, souvent appelées « teignes », et couramment rencontrées tant en dermatologie humaine que vétérinaire. Parmi eux, Microsporum canis est lagent isolé dans la majorité des cas de dermatophytose chez le chat et le chien. Le chat peut être considéré comme le réservoir de cette infection, quil transmet à différentes espèces animales mais aussi à lhomme. La relation hôte-parasite caractérisant les dermatophytoses est particulière. Les dermatophytes se nourrissent aux dépens même de la barrière kératinisée destinée à la protection de lorganisme contre les agressions extérieures. Ils y restent confinés et sont généralement incapables de provoquer des infections profondes. Les dermatophytes sont des parasites obligatoires, qui affectent des hôtes immunocompétents. Par ailleurs, lexpression clinique des dermatophytoses est très variable selon lhôte et lespèce fongique impliqués : linfection peut être aiguë et rapidement éliminée, ou au contraire persistante et accompagnée de symptômes ténus. Par exemple, les lésions causées par M. canis sont généralement plus inflammatoires chez lhomme que chez le chat, son hôte naturel, et certains chats développent des teignes chroniques peu apparentes, jouant un rôle important dans la transmission de linfection. Les mécanismes qui président à ces divers aspects de la pathogenèse des dermatophytoses, et en particulier de linfection par M. canis, restent très mal connus. La majeure partie des recherches effectuées jusquà ce jour concernent les nombreuses protéases sécrétées par les dermatophytes et potentiellement impliquées dans le dégradation de la kératine, si bien quun grand nombre dentre elles ont été caractérisées dun point de vue moléculaire et enzymatique. Chez M. canis, deux familles de gènes, codant respectivement pour des subtilases (SUBs) et des métalloprotéases (MEPs), ont été isolées (Brouta et al., 2002 ; Descamps et al., 2002 ; Jousson et al., 2004). Parmi leurs membres, SUB3 et MEP3 sont considérées comme de probables facteurs de virulence ; en effet, elles sont induites sur un milieu à base de poils de chats, exprimées in vivo, fortement kératinolytiques, et également immunogènes (Descamps et al., 2003a ; Brouta et al., 2003). Le premier objectif de ce travail est dévaluer limmunogénicité et le pouvoir protecteur de MEP3 sous forme recombinante, dans le cadre dun essai de vaccination chez le cobaye. Le second est didentifier et de caractériser chez M. canis une autre classe de protéases, les dipeptidyl peptidases (DPPs). Les gènes correspondants seront isolés et séquencés, ce qui permettra létude de leur expression in vivo et sur différents milieux in vitro. Les protéines encodées seront produites sous forme recombinante, afin de pouvoir entamer lanalyse de leurs propriétés enzymatiques et immunologiques. Enfin, étant donné que chaque facteur étudié ne peut être formellement impliqué dans la virulence du champignon quen passant par la construction de souches déficientes, le troisième but de ce doctorat est de mettre au point chez M. canis une technique dinactivation génique par lintermédiaire dARNs en épingle à cheveux, en utilisant comme cibles des gènes codant pour des protéases sécrétées. Résultats: Un vaccin expérimental anti-M. canis a été préparé en associant MEP3, obtenue sous forme recombinante dans la levure Pichia pastoris (rMEP3), à ladjuvant de Freund. Le vaccin a été administré à des cobayes, par voie sous-cutanée, trois fois à 15 jours dintervalle. La vaccination a induit une forte réponse en anticorps spécifiques, ainsi quune réponse lymphoproliférative envers MEP3. Toutefois, cette dernière est apparue comme transitoire, puisquelle nétait plus significative au moment de lépreuve dinfection. Celle-ci a eu lieu 7 semaines après la dernière vaccination. Lévolution clinique de linfection, ainsi que la persistance du champignon, ont été suivies de façon régulière et exprimées sous forme de scores clinique et mycologique attribués à chaque animal. Aucune différence significative na pu être mise en évidence entre les scores des animaux vaccinés et non vaccinés. La réponse en anticorps induite par linfection chez les animaux non vaccinés sest révélée nettement plus faible que celle induite par la vaccination ; la réponse lymphoproliférative observée après linfection était dintensité comparable entre animaux vaccinés et non vaccinés. Le vaccin à base de rMEP3 na donc pas été protecteur, malgré linduction dune importante réponse humorale et le recrutement de cellules T spécifiques. Dans le but didentifier de nouveaux immunogènes potentiels, et de compléter dans le même temps les connaissances relatives aux protéases sécrétées par M. canis, les gènes codant pour des dipeptidyl peptidases ont été isolés. Il sagit dexoprotéases libérant des dipeptides au niveau de lextrémité N-terminale des protéines et réparties en différentes classes suivant la nature de ce dipeptide et suivant leur localisation cellulaire. Deux gènes uniques, codant respectivement pour une DPPIV et une DPPV, ont pu être isolés, séquencés et caractérisés. Ils encodent des protéases de la famille S9 de protéases à sérine, possédant un peptide signal de sécrétion mais pas de séquence pro-, et possédant des sites de glycosylation. Les deux protéases sont à 90% identiques à leurs paralogues isolés chez Trichophyton rubrum (Monod et al., 2005), un dermatophyte fréquemment isolé lors de dermatophytose humaine. Elles sont également homologues aux DPPs dAspergillus fumigatus, qui ont été proposées comme facteurs de virulence potentiels (Beauvais et al., 1997a,b). La DPPIV de M. canis présente également un degré dhomologie élevé avec la DPPIV de la bactérie pathogène Porphyromonas gingivalis, qui est un facteur de virulence avéré (Kumagai et al., 2003), ainsi quavec le marqueur mammalien CD26, qui est une molécule multifonctionnelle participant à de nombreux processus biologiques et immunologiques (Boonacker et Van Noorden, 2003). Grâce à une technique de RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) en temps réel, une importante augmentation de lexpression des deux DPPs de M. canis a été mise en évidence lorsque le champignon est cultivé sur des milieux constitués de protéines de matrice extracellulaire, parmi lesquelles la kératine. Lexpression des DPPs a également été détectée in vivo, chez le chat et le cobaye, par RT-PCR nichée. Les deux protéases ont été produites sous forme recombinante dans la levure P. pastoris, et y sont enzymatiquement actives. Les DPPs recombinantes apparaissent sous forme dune bande à 83 kDa (DPPV) et dun doublet à 95 et 98 kDa (DPPIV), dont respectivement 5 kDa et 9 ou 12 kDa de glycosylation. Elles clivent les substrats préférentiels de leurs sous-familles enzymatiques, ce qui correspond dans le cas de la DPPIV aux liens de type Proline-X ; cette spécificité est très rarement rencontrée parmi les protéases. Alors quaucune des deux DPPs de M. canis nest à elle seule kératinolytique, limplication de la DPPIV dans la digestion du réseau de kératine a été testée en utilisant le substrat Keratin Azure (Sigma) et des surnageants de cultures de M. canis montrant une forte activité kératinolytique. La préincubation de ces surnageants avec un inhibiteur spécifique de DPPIV na eu aucun effet sur le niveau de solubilisation du substrat kératinisé. Ce résultat indique que lintervention potentielle de la DPPIV dans cette digestion a lieu uniquement en aval de la digestion par les endoprotéases. Ensuite, dans le but dévaluer la capacité de la DPPV dinduire une réponse cutanée de type DTH (Delayed Type Hypersensitivity), sa forme recombinante a été utilisée dans le cadre de tests dintradermoréaction chez des cobayes précédemment infectés par M. canis. La réaction sest avérée négative, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de la DPPV de Trichophyton tonsurans chez lhomme. Toutefois, cette dernière a été utilisée sous sa forme native. Enfin, une technique dinactivation génique via lARN a été mise au point chez M. canis, en utilisant comme cibles les gènes codant pour SUB3 et DPPIV. Il sagit de la première mise en uvre de cette méthodologie chez les dermatophytes. La technique employée dérive du phénomène d « interférence à lARN » (RNA interference, RNAi), qui a lieu à proprement parler dans les cellules animales, mais équivaut à des voies similaires chez les autres types dorganismes, y compris les champignons (Nakayashiki, 2005). Linterférence à lARN a pour élément déclencheur un ARN double brin, qui entraîne la destruction enzymatique des ARN messagers de séquence identique. Chez les champignons filamenteux, cette voie est activée efficacement par un ARN en épingle à cheveux dune taille de 500 à 1000 bp. Nous avons donc conçu deux constructions codant pour de telles épingles à cheveux, dont les séquences correspondent respectivement à un fragment des gènes SUB3 et DPPIV. M. canis a ensuite été transformé, séparément, par chacune de ces constructions. Pour chaque gène cible, les souches fongiques générées ont présenté des degrés dinhibition variables, évalués par RT-PCR en temps réel et par mesure de lactivité enzymatique des protéines cibles dans les surnageants de culture des transformants. Les taux dactivité enzymatique résiduelle et dARN messager obtenus étaient respectivement de 3,3% et 2% pour SUB3, et de 45,6% et 1,5% pour DPPIV. La distribution des taux dinhibition génique entre 0% et plus de 95% est compatible avec les résultats détudes similaires chez dautres champignons filamenteux. En outre, dans le cas de latténuation de lexpression de SUB3, une analyse par électrophorèse SDS-PAGE du surnageant de culture dune souche fortement inhibée montre la disparition de la bande correspondant à SUB3, mais aussi de celle correspondant à SUB4, ce qui indique que le seul fragment interférant utilisé est potentiellement capable dinhiber plusieurs gènes de la même famille. Conclusions et perspectives: Aucune atténuation des symptômes de linfection par M. canis, ni de linvasion par le champignon, nest obtenue en vaccinant des cobayes avec rMEP3 associée à ladjuvant de Freund selon le protocole utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus avec deux autres protéases recombinantes, SUB3 chez M. canis (Descamps et al., 2003b) et la hsp60 de T. rubrum (Raska et al., 2004). Or, le succès dun vaccin résulte à la fois des propriétés intrinsèques du ou des immunogènes quil contient, et de la stimulation sélective par son adjuvant des acteurs efficaces de la réponse immune. Deux options sont donc offertes pour de nouvelles recherches dans le domaine de la vaccination anti-M. canis et anti-dermatophytes. La première consiste à poursuivre la dissection de la réponse immune spécifique en étudiant les propriétés immunogènes de composants particuliers. Même si lélimination naturelle dune infection fongique relève généralement dune réponse effectrice cellulaire de type Th1, cette perspective va bien au-delà de la recherche dun facteur activant des lymphocytes Th1, ou rappelant une réponse de type DTH au niveau cutané. En effet, il est actuellement démontré que des anticorps de spécificité bien choisie peuvent être totalement protecteurs contre une infection fongique (Casadevall et al., 2002 ; Cassone, 2007). En outre, il ne faut pas perdre de vue que lélément fongique de base déterminant une réponse immune adéquate est lépitope (Woodfolk et al., 2000). Le répertoire dépitopes générés à partir dune protéase recombinante peut dailleurs être modifié par rapport à son homologue native (Engelhard et al., 2006), comme cela est suspecté pour rDPPV chez M. canis. Ce phénomène peut engendrer une altération des propriétés immunogènes natives, mais a contrario, une protéase recombinante ainsi modifiée peut devenir un outil pour identifier des motifs antigéniques dintérêt. La seconde voie possible vers lélaboration dun vaccin sûr et pleinement efficace est lutilisation de nouveaux adjuvants orientant la réponse immune de la même façon quune infection naturelle protectrice. Chez A. fumigatus, des oligonucléotides CpG associés à une protéine recombinante ont permis de protéger des souris contre une aspergillose invasive, en stimulant plusieurs composants de la réponse cellulaire de type Th1 (Bozza et al., 2002). La vaccination à base de cellules dendritiques polarisées par un contact avec A. fumigatus sest également montrée prometteuse dans un modèle murin daspergillose invasive (Bozza et al., 2004), cette technique pouvant être assimilée à lemploi dun adjuvant de nouvelle génération. Il est bien entendu que ces deux voies de recherche ne sexcluent pas mutuellement, et quun travail mené dans les deux directions sera sans doute nécessaire pour atteindre le but recherché. Les DPPIV et V de M. canis ont été caractérisées au niveau moléculaire, et exprimées sous forme recombinante active. Leurs propriétés ainsi que celles de différentes protéases homologues laissent supposer quelles jouent un rôle universel dans la digestion de substrats protéiques complexes, y compris les structures kératinisées, mais quelles pourraient en plus avoir acquis une ou plusieurs fonctions spécialisées dans le cadre de la relation hôte-parasite. Lune de ces fonctions pourrait être la modulation de la réponse immune, par exemple via le clivage de cytokines ou de chémokines, étant donné notamment sa similitude avec la DPPIV mammalienne ou CD26. Parallèlement, les DPPs sont peut-être aussi des immunogènes importants. Enfin, la DPPIV sécrétée par M. canis pourrait intervenir dans ladhérence aux protéines de matrice extracellulaire, ou encore dans la dégradation des tissus via lactivation de protéases de lhôte, comme cela a été démontré chez P. gingivalis (Kumagai et al., 2005). Plusieurs perspectives sont donc ouvertes quant à linvestigation de la fonction des DPPs des dermatophytes, et certaines pourront êtres rencontrées grâce aux formes recombinantes de ces protéines. Cependant, pour elles comme pour tous les autres facteurs fongiques susceptibles de contribuer à la pathogenèse des dermatophytoses, la construction de souches déficientes est un passage obligé vers la démonstration formelle de cette contribution. Ceci est maintenant réalisable rapidement, au moyen de constructions exprimant des ARN double brin interférants, même si de nombreuses améliorations peuvent sans doute être apportées à cette technique. Les souches déficientes au niveau de SUB3 et potentiellement des autres SUBs, ainsi que celles déficientes au niveau de DPPIV, seront prochainement évaluées quant à leur comportement dans un modèle dépiderme félin reconstitué mis au point dans notre laboratoire (Tabart et al., sous presse). 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Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Peptidases regulate important physiological processes by controlling levels of bioactive peptides and occasionally through noncatalytic processes. This thesis presents a study of prolyl endopeptidase-like (PREPL), which is a peptidase involved in several human deletion syndromes, including hypotonia-cystinuria syndrome (HCS). Phenotypes tentatively attributed to PREPL deletion include hypotonia and decreased growth hormone (GH) levels. However, little is known about the mechanisms by which PREPL deletion causes these phenotypes. To better understand PREPL catalytic activity, we used an activity-based protein profiling fluorescence polarization screen to identify the first specific PREPL inhibitors. We proceeded to demonstrate the activity of these inhibitors in cells and discovered several classes of cell-active PREPL inhibitors. Further, one of these inhibitors, 1-isobutyl-3-oxo-3,5,6,7-tetrahydro-2H-cyclopenta[c]pyridine-4-carbonitrile, was able to enter mouse brains. To characterize PREPL substrate specificity, we performed several substrate profiling experiments, but no substrates could be identified, in line with reports from other groups who used related approaches to attempt to identify PREPL substrates. To characterize any noncatalytic functions of PREPL, we used an affinity purification-mass spectrometry approach (AP-MS) to search for any protein-protein interactions of PREPL. We identified brain-expressed X-linked 2 (BEX2) as a novel interactor of PREPL, and confirmed this interaction by immunoblot. Several other proteins identified in the AP-MS experiment, including several members of the STRIPAK complex are being further investigated for possible PREPL interaction. To determine whether HCS phenotypes are in fact due to PREPL deletion and to delineate the molecular pathways involved, we generated a conditional PREPL knockout mouse. These mice were visibly smaller than wildtypes and growth curve analysis verified that from week three of life, there was a significant difference in weight between wildtype and knockout mice. Initial surface righting task experiments also indicate that PREPL knockout pups may have a hypotonia phenotype. In summary, we have developed several new tools for studying PREPL catalytic and noncatalytic function, demonstrated that PREPL deletion causes a GH-related growth deficiency and possible hypotonia and thus moved several steps closer to understanding the molecular mechanisms underlying PREPL deletion phenotypes. / Chemistry and Chemical Biology

The family of human kallikrein-related peptidases (KLKs) numbers 15 serine proteinases implicated in tumour progression. Despite the wide tissue distribution of KLKs and the numerous reports of their differential expression in pathological settings, the signalling mechanism(s) whereby these enzymes regulate tissue function are not yet known. Further, knowledge of the levels of their activity, as well as of their potential endogenous targets, has only been extracted from in vitro studies and cell culture systems. We hypothesized that KLKs can trigger tumour signalling via proteinase-activated receptors (PARs), a family of G-protein-coupled receptors. To test our hypothesis, we evaluated the ability of KLKs 5, 6, and 14: to activate or prevent signalling via PARs 1, 2, and 4 in cells and tissues expressing these receptors. Further, we used a novel activity-based probe approach, coupled with conventional immunoassay (ELISA), to determine the abundance of active KLK6 relative to total immunoreactive KLK6 in cancer-related biological fluids. We concluded that KLKs can regulate multiple signalling pathways triggered by PARs 1, 2, and 4, resulting in calcium release, platelet aggregation and vascular relaxation, and they can cause murine inflammation. Further, our activity-based ELISA demonstrated the presence of active KLK6 in ovarian cancer ascites fluids and cancer cell supernatants. We, therefore, suggest that tumours can produce active KLKs, which can potentially control tumour behaviour by regulating PAR activity.