Plusieurs études montrent que les acides gras (AG) oméga-3 sont bénéfiques pour la santé cardiovasculaire. Une étude antérieure dans notre laboratoire a montré que l’administration des acides gras oméga-3 réduit la taille de l'infarctus du myocarde (IM). Cependant, la question demeure de savoir si les deux principaux acides gras oméga-3 à longue chaîne, l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide docosahexaénoïque (DHA) possèdent la même efficacité à réduire la taille de l'infarctus. Le but de ce projet sera de déterminer l’efficacité relative de chacun de ces acides gras oméga-3 à protéger le cœur dans un modèle d’ischémie/reperfusion et d’étudier certaines voies de cardioprotection. Des rats mâles adultes Sprague-Dawley ont été nourris pendant 14 jours avec une diète comprenant l'un: 1- aucun AG oméga-3; 2- 5 g d'EPA / kg de nourriture; 3- 5 g de DHA / kg de nourriture; 4- 2,5 g de chaque oméga-3 AG / kg de nourriture; 5- 5 g chaque AG oméga-3 / kg de nourriture. Par la suite, les animaux ont été soumis à une ischémie pendant 40 minutes, causée par l'occlusion de l'artère coronaire gauche descendante. Au bout de 24 heures de reperfusion, la taille de l'infarctus est déterminée. Dans un sous-groupe d'animaux, l'activité d’Akt et des caspase-3 sont mesurées dans la région ischémique après 30 minutes de reperfusion. Finalement, à 15 minutes de reperfusion, l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale mPTP est déterminée dans un autre sous-groupe. Les résultats indiquent que les diètes EPA ou DHA réduisent de manière significative la taille de l'infarctus par rapport à la diète sans AG oméga-3, tandis que la combinaison de deux acides gras oméga-3 n'a pas montré de diminution de la taille de l'infarctus. L'activité de la caspase-3 est réduite pour le groupe DHA puis, l'activité d'Akt est augmentée avec les diètes EPA et DHA seules. Finalement, en présence d’une diète enrichie uniquement de DHA, l'ouverture des mPTP est retardée comparativement aux autres diètes. / Several studies show that fatty acids (FA) Omega-3 are beneficial for cardiovascular health. A previous study in our laboratory has shown that omega-3 intake AG reduced the size of the myocardial infarction. However the question remains whether the two main omega-3 long chain eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) are also effective in reducing infarct size. The purpose of this project is to determine the mechanisms by which one or other of the FA Omega-3 act to protect the myocardium. For this purpose, Sprague-Dawley adult male rats were fed for 14 days with diets comprising one of: 1- Any FA omega-3; 2- 5 mg EPA / kg diet; 3- 5 mg DHA / kg feed; 4- 2.5 mg of each omega-3 AG / kg diet; 5- 5 mg each AG omega-3 / kg of feed. Thereafter, the animals were subjected to ischemia for 40 minutes, caused by occlusion of the left coronary artery descending. At 24 hours of reperfusion, the infarct size is determined. In a subgroup of animals, the activity of caspase-3 and the activation levels of Akt are measured in the ischemic region to 30 minutes of reperfusion. And finally at 15 minutes of reperfusion, the opening of the permeability transition pore mitochondrial mPTP is determined. The results indicate that diets EPA or DHA significantly reduce the infarct size compared to the diet without FA omega-3 while the combination of two FA omega-3 did not show reduction of the infarct size. The activity of caspase-3 is reduced to the DHA group, then AKT activity is increased with EPA and DHA diets and DHA individually confers a resistance to the opening of the pore mPTP. EPA and DHA are individually effective in reducing infarct size while the combination of 2 FA is not at low concentrations.

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR. / The small GTPase ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) has been well described for its role in regulating transport within the Golgi. Recently, in breast cancer cells, we have characterized ARF1 as important mediator of epidermal growth factor receptor (EGFR) signals leading to cell proliferation, migration and invasion. However, the mechanisms regulating ARF1 activity downstream of the EGFR had yet to be defined. Here, we aim to characterize these mechanisms of ARF1 activation in invasive breast cancer cells and demonstrate that activated ARF1 plays an essential role in mediating the resistance of breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors. We show that the adaptor proteins Grb2 and p66Shc regulate EGF-dependent ARF1 activation. While Grb2 was shown to be essential in the recruitment of ARF1 to the EGFR as well as the activation of this small GTPase, p66Shc blocked the recruitment of this Grb2-ARF1 complex to the receptor and thus suppressed EGF-induced ARF1 activation. Additionally, we demonstrate that ARF1 promotes EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance in invasive breast cancer cells. Indeed, the depletion of ARF1 was associated with an increased sensitivity to EGFR inhibition. We show that ARF1 promotes resistance by enhancing survival and proliferative signals through Erk1/2, Src and AKT, while blocking the apoptotic p38MAPK and JNK pathways. Furthermore, ARF1 was shown to stabilize EGFR dynamics (Expression, activation, dimerization and down-regulation) in response to treatment with EGFR inhibitors. Finally, we highlight the role of ARF1 in mediating mitochondrial-dependent apoptosis in response to EGFR tyrosine kinase inhibitor treatment. The depletion of ARF1 was shown to promote gefitinib-induced cell death as measured by increase expression of pro-apoptotic factors(p66Shc, Bax), altered mitochondrial membrane potential and cytochrome C release. Together, our results delineate a novel mechanism of ARF1 activation in breast cancer cells and implicate ARF1 activity as an important mediator of EGFR inhibitor resistance further supporting the importance of targeting this GTPase in breast cancer patients.

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Introduction : La dystonie est définie comme un syndrome de cocontractions musculaires soutenues aboutissant à des mouvements répétitifs et des postures anormales. Cependant la physiopathologie des dystonies reste mal comprise. Les études menées chez l’homme soulignent le rôle crucial des ganglions de la base dans la physiopathologie des dystonies. Des données récentes obtenues chez le rongeur suggèrent l’implication d’un désordre de la transmission cholinergique striatale mais es modèles qu’ils soient génétiques ou pharmacologiques n’aboutissent pas toujours à un phénotype de dystonie. C’est pourquoi il était important de proposer une étude chez le primate non humain, visant à vérifier notre hypothèse de travail, à savoir : est-ce qu’une augmentation de la transmission cholinergique dans le putamen est capable d’induire un phénotype clinique de dystonie similaire à celui rencontré chez l’homme.Méthodes : Nous avons réalisé des infusions chroniques d’un agoniste muscarinique non sélectif (Oxotremorine) au sein du territoire sensori-moteur du striatum chez le primate non-humain. Les symptômes cliniques induits par ce produit ont été évalués à l’aide de l’échelle de Burke-Fahn-Marsden (BFM) adaptée à l’animal. Nous avons également utilisé une approche électromyographique pour caractériser l’activité musculaire en lien avec la clinique ainsi que des enregistrements de l’activité Multi-Unitaire et Unitaire au sein des ganglions de la base afin d’établir des corrélations électro-cliniques.Résultats : Les infusions d’Oxotremorine nous ont permis d’observer : (i) des postures et des mouvements anormaux similaires aux mouvements dystoniques rencontrés en pathologie humaine ; (ii) une fréquence de décharge neuronale anormalement basse dans le GPi (13,5Hz) et un pattern de décharge de type « bursty » principalement lorsque les symptômes sont sévères ; (iii) une activité oscillatoire (28-30Hz) au sein du putamen, du GPe et du GPi; (iv) l’absence de cohérence de l’activité oscillatoire entre ces structures ; (v) que le GPi est la seule structure à présenter une cohérence de l’activité oscillatoire.Conclusion : Nos travaux démontrent pour la première fois qu’un modèle de dystonie chronique peut être obtenu chez le primate non humain par augmentation du tonus cholinergique dans le putamen. Ce travail valide l’hypothèse de l’implication des interneurones cholinergiques dans la physiopathologie des dystonies. Ils confortent l’idée qu’une augmentation du tonus cholinergique peu à elle seule induire un phénotype de dystonie. / Introduction: Dystonia is defined as a syndrome of sustained muscular cocontractions leading to repetitive movements and abnormal postures. However, the pathophysiology of dystonia remains poorly understood. Studies in humans emphasize the crucial role of basal ganglia in the pathophysiology of dystonia. Recent data in rodents suggest the involvement of a disorder in the striatal cholinergic transmission. But these genetic or pharmacological rodent models do not always express the phenotype of dystonia. Therefore, it was important to propose a primate study to test whether an increase of cholinergic transmission within the putamen is able to induce a clinical phenotype of dystonia similar to that seen in humans.Methods: To verify our hypothesis, we chronically infused non-selective muscarinic agonist (Oxotremorine) in the sensory-motor striatum in non-human primates. Dystonic clinical symptoms induced by this drug were assessed using the Burke-Fahn-Marsden (BFM) scale adapted to animals. We used electromyographic approach to characterize muscular activity linked to clinical symptoms, and we recorded Multi-Unit and Single-Unit neuronal activity in basal ganglia to establish electro-clinical correlations.Results: The infusions of Oxotremorine allowed us to observe: (i) abnormal postures and movements similar to the dystonic movements encountered in human pathology; (ii) an abnormally low neuronal firing frequency in the GPi (13.5Hz) and a bursty firing pattern mainly when the symptoms where severe; (iii) oscillatory activity (28-30Hz) within the putamen, GPe and GPi; (iv) the lack of coherence of the oscillatory activity between these structures; (v) that the GPi is the only structure to present a coherence of the oscillatory activity.Conclusion: We have demonstrated for the first time that a model of chronic dystonia can be obtained in non-human primates by increasing cholinergic tone in the putamen. This work validates the hypothesis of an involvement of cholinergic interneurons and striatal acetylcholine levels in the pathophysiology of dystonia.

Malgré les progrès évidents sur la compréhension de la carcinogénèse, l’incidence des cancers est toujours en augmentation. C’est pourquoi les besoins en nouveaux traitements sont importants. Notre travail de thèse a porté sur l’évaluation pharmacologique d’une nouvelle molécule anticancéreuse, l’OTX015. Cette petite molécule de synthèse a la propriété d’inhiber les protéines bromodomaines (famille des BET) qui jouent un rôle clé dans les mécanismes épigénétiques et dont la dérégulation favorise l’apparition de cancers en particulier des hémopathies malignes. Des études précliniques in vitro sur plusieurs lignées cellulaires d’hémopathies malignes et in vivo sur des souris xénogreffées ont permis de mettre en évidence les propriétés antitumorales de l’OTX015. Une méthode de dosage des concentrations plasmatiques d’OTX015 par UPLC-MS/MS a été développée et validée afin d’évaluer sa pharmacocinétique chez les patients inclus dans un protocole d’escalade de doses de phase I. Dans un premier temps, la PK de l’OTX015 a été modélisée par une approche de population et dans un second temps un modèle PK-PD a été construit pour pouvoir évaluer le profil de la tolérance (nombreuses thrombopénies) de cette nouvelle molécule. / Despite obvious progress in carcinogenesis understanding, the incidence of cancer is still increasing. Therefore, the need of new treatments remains important. Our thesis focused on the pharmacological evaluation of a new anticancer drug, OTX015. This small synthetic molecule inhibits the bromodomain proteins (BET) that play a key role in epigenetic mechanisms. Downregulation of BRDs promotes cancer occurrence including hematological malignancies. Preclinical evidences obtained from in vitro and in vivo studies in xenograft mice, suggest that OTX015 has antitumor properties. An ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection method was developed and validated in order to measure OTX015 plasma concentrations. Its pharmacokinetics in patients enrolled in a phase I dose-escalation study was then evaluated. The OTX015 PK parameters were estimated by a population approach and PK-PD modeling was developed in order to evaluate the tolerance and safety (thrombocytopenia) of this new drug.

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L’homéostasie énergétique ou ‘balance énergétique’ est l’équilibre qui s’établit chez l’Homme et l’animal adulte entre la prise quotidienne de nutriments sous la forme de glucides, de lipides ou de protéines et leur oxydation pour ne produire que la quantité énergétique strictement nécessaire. Pour maintenir cette balance l’organisme doit recueillir en permanence des signaux nerveux, métaboliques ou hormonaux de la part de cellules spécifiques. Ces senseurs des besoins énergétiques transmettent alors à des centres régulateurs leurs informations qui en retour, par voie hormonale ou nerveuse, informent les organes effecteurs des mesures à prendre pour stocker, produire ou consommer l’énergie. Les trois principaux centres de cette balance sont 1/ le cerveau, centre intégrateur de l’information ; 2/ un groupe d’organes effecteurs parmi lesquels le foie, le tissu adipeux, les muscles squelettiques, le pancréas et 3/ un centre senseur de la qualité et de la quantité des aliments, le tractus gastrointestinal (Migrenne 2006). En plus d’être la source d’énergie nécessaire à la vie des cellules, les nutriments tels que les acides gras, le cholestérol ou encore le glucose sont aussi des molécules de signalisation cellulaire à la fois par leur fixation à des récepteurs membranaires mais aussi via des récepteurs nucléaires. Un déséquilibre dans l’homéostasie énergétique dû à une alimentation déséquilibrée, à un manque d’exercice physique ou à des facteurs génétiques est une caractéristique de l’obésité et de complications telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires (Hill, 2006). Au cours de ma thèse je me suis intéressé à l’intestin pour son rôle de régulateur de l’homéostasie énergétique dans un contexte physiologique ou physiopathologique d’obésité via sa capacité à sécréter l’incrétine Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) en réponse au glucose et aux acides biliaires. J’ai étudié plus particulièrement le rôle du récepteur nucléaire en tant que senseurs moléculaires des acides biliaires FXR dans les cellules sécrétrices de cette incrétine car à l’heure actuelle rien n’était connu quant à son rôle ni même quant à son expression dans la cellule L. Pour cela, j’ai utilisé des lignées cellulaires murines et humaines où j’ai mis au point les conditions expérimentales pour répondre aux questions posées. Grâce à des ARN d’intestins issus de différents modèles de souris la relevance chez le rongeur a été testée. La relevance de ces résultats sur des biopsies intestinales humaine a également été testée. Grâce à ces outils, j'ai pu montré que FXR dans les cellules L était fonctionnel et que son activation interférait avec la voie de la glycolyse entrainant moins de synthèse et de sécrétion de GLP-1. Cela nous a permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire par lequel les séquestrants des acides biliaires exercent leur effets bénéfiques chez des patients atteints de diabète de type 2. / Originally identified as dietary lipid detergents, bile acids (BA) are now recognized as signaling molecules which bind to the transmembrane receptor TGR5 and the nuclear receptor FXR (Farnesoid X Receptor). Upon binding to TGR5 at the surface of enteroendocrine L cells, bile acids (BA) promote the secretion of the incretin GLP-1 which potentiates the glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta-cells. More than 50% of the insulin secretion in response to glucose is mediated by GLP-1 and the other incretin Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP). Once secreted, GLP-1 is rapidly (2-3 minutes) degraded by the endothelial enzyme Dipeptydil Peptidase 4 (DPP4). GLP-1 analogues and DPP4 inhibitors are successfully used for the treatment of T2D. FXR is a ligand-activated nuclear receptor highly expressed in the liver and in the distal intestine. FXR controls BA, lipid and glucose metabolism. Whether FXR is expressed, functional in intestinal enteroendocrine L cells and in which extend its activation affects GLP-1 production are not yet reported. Encouraging data were obtained during my M2 training course. The aim of my thesis was thus to assess whether FXR in enteroendocrines cells could participate in the control of the deregulation of glucose homeostasis. Multiple in vitro, ex vivo and in vivo human and murine models allowed us to show that FXR is present and functional in L cells. FXR activation decreases GLP-1 production and secretion in L cells by inhibiting glycolysis pathway through an interference with the carbohydrate responsive transcription factor ChREBP. Finally, I identified an additional mechanism of action of the bile acid sequestrant Colesevelam, a molecule currently successfully used in USA for treating type 2 diabetic patients.

L’amygdale est une structure du système nerveux central impliquée dans l’intégration des émotions comme la peur et l’anxiété. Des études ont également montré que l’amygdale peut moduler de façon positive ou négative la douleur par le biais des projections de son noyau de sortie, le noyau central de l’amygdale (CeA), sur les structures impliquées dans les contrôles nociceptifs descendants. Le complexe basolatéral de l’amygdale (BLA), placé en amont du noyau central, est intimement connecté à ce dernier et peut ainsi réguler son fonctionnement. Les données obtenues au cours de ma thèse ont montré l’existence d’un contrôle tonique amygdalien de la nociception et de la douleur, directement dépendant de l’équilibre entre l’excitation et l’inhibition au sein de la structure. Ainsi la modulation de l’une ou l’autre des neurotransmission influence directement la sortie douloureuse, chez des animaux sains ou neuropathiques. Par ailleurs, nous nous sommes également intéressés à l’étude précise du mode d’action d’une molécule anxiolytique non benzodiazépinique, l’étifoxine (EFX), et à son effet sur le comportement douloureux. Les résultats des injections d’EFX dans le BLA indiquent qu’elle induit une action analgésique chez les animaux neuropathiques, mais ne modifie pas les seuils de sensibilité des animaux sains. Cette action analgésique est dépendante de l’effet indirect neurostéroïdogène de l’EFX. Ceci, associé au fait que l’EFX ne présente pas ou peu d’effets secondaires, en fait une molécule particulièrement intéressante pour un traitement alternatif des douleurs neuropathiques. Dans une dernière partie, nous avons cherché à observer les mécanismes en jeu au niveau cellulaire lorsque l’EFX est appliquée sur les neurones du BLA. Ainsi, nous avons montré que l’EFX potentialise l’inhibition au sein de la structure, via trois mécanismes indépendants ; l’augmentation de la fréquence des courants post-synaptiques inhibiteurs miniatures (mCPSIs), l’augmentation de leur amplitude, et l’augmentation de leur constante de déactivation. Ces deux derniers effets sont dépendants de l’action neurostéroïdogène de l’EFX, tandis que l’effet sur la fréquence des mCPSIs est du à l’action de l’EFX sur le récepteur GABAA. Les résultats de ma thèse ont ainsi permis de montrer l’existence d’un contrôle tonique amygdalien de la douleur, dans le cadre d’animaux neuropathiques, mais également de la nociception, chez des animaux sains. Par ailleurs, la place du complexe basolatéral de l’amygdale, souvent peu prise en compte dans les études sur la douleur, a été redéfinie. Ce complexe doit être pris en considération dans le circuit de la douleur et son rôle de pilote du noyau central de l’amygdale ne doit pas être négligé. / The amygdala is a major control center of the emotions, but also integrates sensory, especially nociceptive information. Cortical afferents to the amygdala largely target its basolateral complex. The basolateral amygdala (BLA) then projects to the central amygdala nucleus, which in turn projects densely to the periaqueductal gray and thus can drive a behavioural output via the spinal cord. Data obtained during my thesis have shown that the balance between excitation and inhibition in the BLA triggers an tonic control of pain. Therefore modulating one of the neurotransmission directly influences the pain threshold of control or nociceptive mice. My thesis work also focused on the functioning of an anxiolytic and non benzodiazepinic drug ; Etifoxin (EFX). This molecule as a positive modulator of GABAA receptors and indirectly by increasing the synthesis of neurosteroids, also known as strong modulator of these receptors. In our team, we already showed that EFX has anti-nociceptive effects when injected intraperitonealy in rats. Here we wanted to determine the action of EFX on pain descending control drive by BLA. We showed that EFX infusion in the BLA seems to be anti-nociceptive, inducing a recover of the pre-cuff mechanical threshold level. We also used a patch-clamp approach to study directly in vitro the modulation of the inhibitory synaptic transmission produced by EFX. We showed that EFX potentiate the inhibition in BLA neurons via different and complementary mechanisms. These potentiating effects are mostly dependent of a neurosteroidogenesis increase.

Nous nous sommes intéressés à l'activité antipaludique du bleu de méthylène (BM), qui fut la première molécule de synthèse utilisée dans le traitement des accès palustres. Nous avons montré que le BM est actif sur des souches cultivées de Plasmodium falciparum d'origines géographiques et de chloroquino-sensibilités différentes (CI50<10nM). Il est aussi actif sur le cycle sanguin de Plasmodium murin (DE50<15mg/Kg), mais pas sur la phase hépatique. Les stades érythrocytaires les plus sensibles sont les stades jeunes. Les associations avec les traitements classiques sont de type : antagoniste avec amodiaquine ; antagonisme-additif avec atovaquone, doxycycline, pyrimethamine ; additive-pas d'interaction avec artemether, chloroquine, mefloquine, primaquine et synergique avec la quinine. Nous avons montré par spectrométrie UV, CCM et spectrométrie de masse, qu'il n'y a pas de liaison entre le BM et l'hème. Nous avons également mis au point une nouvelle technique pour mesurer la transformation de l'hème par le glutathion et mesurer ainsi l'activité des drogues sur cette transformation.

L'abeille en contention peut associer une récompense sucrée au scan antennaire d'une plaque métallique. Pour étudier le rôle des récepteurs nicotiniques dans cet apprentissage, des antagonistes nicotiniques (mécamylamine, MLA ou α-bungarotoxine) ou un inhibiteur de la NO-synthase (le L-NAME) ont été injectés dans l'hémolymphe à des doses sans effet sur la perception ou la motricité. La mécamylamine a bloqué le rappel de la trace mnésique et l'apprentissage en un essai sans affecter la formation de la mémoire à long terme (MLT) qui se produit spécifiquement durant l'apprentissage en plusieurs essais. Par contre, le L-NAME, l'α- bungarotoxine et le MLA ne bloquent que la formation de la MLT. Cette dissociation pharmacologique indique l'existence de plusieurs types fonctionnels de récepteurs nicotiniques. Ceux qui sont sensibles au MLA et à l'α-bungarotoxine seraient couplés à la NO-synthase.