Plants are sessile organisms adapted to cope with dynamic changes in their environment. Abiotic stresses, such as heat, drought, or nutrient deficiency must be overcome simultaneously with biotic threats such as pathogens and herbivores. Oomycete pathogens represent a significant threat to global food production and natural ecosystems. Novel modes of oomycete disease control could increase crop yield and reduce pesticide application. Overlaps between the plant response to iron deficiency and pathogens have been documented, but the impact of simultaneous imposition of both stresses on the plant have not been studied. Additionally, nothing is known about the impact of iron deficiency on oomycete infection, or mechanisms of oomycete iron uptake. We adapted a hydroponic system to simultaneously impose iron deficiency and monitor pathogen infection. The oomycete pathogens Hyaloperonospora arabidopsidis, and Phytophthora capsici grew less well on iron-deficient Arabidopsis thaliana, at least in part because of observed activation of immunity due to iron stress. We screened A. thaliana T-DNA insertion mutants defective in iron metabolism and transport and identified potential mechanisms of H. arabidopsidis iron acquisition. We conducted RNA sequencing to understand how A. thaliana responds to iron deficiency and root infection of P. capsici. 323 genes were differentially upregulated in iron-starved plants over three days, irrespective of pathogen infection, representing a core iron deficiency response. This group of core genes included the primary A. thaliana iron uptake pathway and genes for coumarin biosynthesis. Salicylic acid responsive genes were observed in both treatments consistent with this defense hormone's previously identified role in iron deficiency. Genes related to glucosinolate production – shown to be important in defense against P. capsici – were down regulated during infection, potentially due to the activity of virulence effectors. Our work demonstrates crosstalk between the iron deficiency response and plant immunity, and that iron acquisition remains important to the plant even after pathogen invasion. These new insights provide a first step in developing novel resistance strategies to control oomycetes in agronomically important crops. / Doctor of Philosophy / Oomycetes can cause diseases in plants resulting in loss of crops and requiring application of chemical pesticides. Better understanding of how oomycetes interact with plants will lead to new strategies to control them and more efficient agriculture. In this study, we investigated the role of iron in plant-oomycete interactions, to see what this important metal nutrient might be doing to help or hurt the plants response to infection. We developed a growth system to limit iron to the plant and simultaneously observe oomycete infection. We studied the leaf pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis or downy mildew, and Phytophthora capsici, a root pathogen that infects many types of vegetable crops. In rice, iron restriction hurt the plant's ability to fight off disease, but we observed the opposite: iron limitation caused the plant to be more resistant to both oomycete pathogens. Microscopic observation revealed that the plants ability to fight off downy mildew was not compromised by iron deficiency. Our results suggest that iron limitation triggers an immune response in the plant, which limits pathogen growth. We performed RNA sequencing on iron-deficient roots also infected with the root pathogen. This allowed us to observe how the plant responded to both stresses. The plant balances the response to iron deficiency and infection. Again, we found that iron deficiency triggers immune activation, and observed that iron-deficient plants are more resistant to infection.

L'utilisation de lignées de soya possédant différents gènes Rps (« Resistant to Phytophthorasojae ») demeure la meilleure méthode de lutte pour combattre la pourriture phytophthoréenne. La résistance conférée par les gènes Rps repose sur le concept gène-pour-gène où une relation existe entre un gène de résistance (gène Rps) chez la plante et un facteur d'avirulence correspondant (gène Avr) chez l'agent pathogène. Sept gènes Rps ont été introduits avec succès dans les cultivars commerciaux, soit les gènes Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps3a et Rps6. À long terme, l'agent pathogène arrive à contourner la résistance conférée par ces différents gènes Rps par la diversification génétique de ces gènes d'avirulence, entraînant la complexification des pathotypes de P. sojae. Afin d'exploiter efficacement ce type de résistance, il devient donc primordial de pouvoir identifier ces pathotypes pour connaître l'interaction des différentes souches de P. sojae avec les gènes Rps utilisés. Ce projet de doctorat avait donc comme objectif une meilleure compréhension de la diversité haplotypique des populations de P. sojae, concernant l'interaction avec les gènes Rps d'intérêt commercial, afin de permettre aux producteurs de faire un choix éclairé qu and vient le temps de choisir des lignées résistantes à la maladie. Dans un premier volet de recherche, notre hypothèse stipulait que l'analyse des variations nucléotidiques et structurales associées aux sept principaux gènes d'avirulence de P. sojae permettrait d'identifier le spectre des haplotypes associés aux phénotypes des isolats, relativement à leur compatibilité avec les gènes de résistance Rps correspondants. Le séquençage du génome complet de 31 isolats représentant la diversité des pathotypes canadiens a permis d'identifier les différents haplotypes des sept principaux gènes d'avirulence (1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 3a et 6) et d'y associer un profil de virulence pour chaque gène Rps correspondant. L'utilisation d'une méthode de phénotypage en bassin hydroponique a permis de constater que le test traditionnel d'inoculation de l'hypocotyle menait à une proportion importante de faux positifs, ce qui a pu nuire à la compréhension de certaines interactions Rps-Avr par le passé. Notre étude a révélé que l'utilisation unique des signatures génomiques permettait de prédire 99,5 % des interactions possibles et que ces dernières pouvaient donc être utilisées pour prédire précisément le profil de virulence des isolats de P.sojae. Ces résultats ont mené à notre deuxième volet de recherche qui visait à démontrer que les marqueurs discriminants identifiés dans le premier volet de l'étude permettraient de s'affranchir du test de phénotypage, par le développement d'un outil moléculaire de type multiplex PCR, capable de prédire le pathotype des isolats de P. sojae. Des amorces spécifiques permettant d'amplifier les allèles associés à l'avirulence envers chaque gène Rps ont été conçues et multiplexées. Le multiplex PCR développé a démontré une efficacité de 97 % lorsque testé sur un panel d'isolats au profil inconnu de virulence. Le troisième volet de recherche visait à mieux comprendre l'interaction de P. sojae avec le gène de résistance Rps8. Notre hypothèse suggérait que l'avirulence de P. sojae envers le produit du gène de résistance Rps8 était déterminée par un effecteur RXLR, codé par un gène d'avirulence correspondant. L'analyse d'une descendance F2 en ségrégation par génotypage par séquençage couplée à l'utilisation des données de séquençage des 31 isolats de P. sojae a permis de cibler Avr3a comme le meilleur gène candidat. En utilisant la méthode d'édition de génome médiée par CRISPR/Cas9, nous avons démontré que le knock-out complet du gène Avr3a chez P. sojae induisait un gain de virulence envers Rps8. Nous avons aussi démontré qu'un allèle spécifique d'Avr3a était reconnu de façon différentielle par Rps3a et Rps8, ce qui représente la première distinction nette entre ces deux gènes de résistance. L'ensemble de ce projet de doctorat a permis de fournir de nouvelles informations sur la complexité des gènes Avr en plus de démontrer que leurs signatures génomiques pouvaient être utilisées pour prédire précisément l'interaction de l'agent pathogène avec les différents gène Rps du soya. Le développement d'un test moléculaire simple et précis offre aux producteurs et sélectionneurs une solution concrète afin d'exploiter efficacement l'utilisation des gènes Rps. L'identification du gène d'avirulence reconnu par Rps8 permet également d'avoir une longueur d'avance dans la gestion de la maladie, en prévision de l'apparition inévitable de nouveaux pathotypes dans le futur. / The use of soybean lines with different Rps ("Resistant to Phytophthora sojae") genes remains the best control method to control Phytophthora root rot. The resistance conferred by Rps genes is based on the gene-for-gene concept where a relationship exists between a resistance gene (Rps gene) in the plant and a corresponding avirulence factor (Avr gene) in the pathogen. Seven Rps genes have been successfully introduced into commercial cultivars, namely Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps3a and Rps6. In the long term, the pathogen manages to by pass the resistance conferred by these different Rps genes by the genetic diversification of its avirulence genes, leading to the complexification of P. sojae pathotypes. To effectively exploit this type of resistance, it is therefore essential to be able to identify those pathotypes in order to know the interaction of the different strains of P. sojae with the Rps genes in use. This doctoral project aims to have a better understanding of the haplotypic diversity of P. sojae populations, concerning their interaction with the Rps genes of commercial interest, in order to allow producers to make an informed choice when the time comes to choose soybean lines resistant to the disease. In a first approach, our hypothesis stipulated that the analysis of the nucleotide and structural variations associated with the seven main avirulence genes of P. sojae would allow the identification of the spectrum of haplotypes associated with the phenotypes of the isolates, relative to their compatibility with the corresponding Rps resistance genes. The whole-genome-sequencing of 31 isolates representing the diversity of Canadian pathotypes made it possible to identify the different haplotypes of the seven main avirulence genes (1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 3a and 6) and to associate a virulence profile for each corresponding Rps gene. The use of a hydroponic phenotyping method showed that the traditional hypocotyl inoculation test leads to a high proportion of false positives, which could have hampered the understanding of certain Rps-Avr interactions in the past. Our study found that the unique use of genomic signatures predicted 99.5% of the possible interactions and that these could therefore be used to accurately predict the virulence profile of P. sojae isolates. These results led to the second part of this doctoral project, which aimed to demonstrate that the discriminating markers identified in the first part of the study would make it possible to bypass the cumbersome phenotyping method by the development of a molecular tool capable of predicting the pathotype of P. sojae isolates. Specific primers for amplifying the alleles associated with avirulence towards each Rps gene were designed and multiplexed. The multiplex PCR developed demonstrated an efficiency of 97% when tested on a panel of isolates with an unknown virulence profile. The third objective of this project was to understand the interaction of P. sojae with the resistance gene Rps8. Our hypothesis suggested that the avirulence of P. sojae towards the Rps8 resistance gene product was determined by an RXLR effector encoded by a corresponding avirulence gene. Analysis of a segregating F2 progeny by using a genotyping-by-sequencing method coupled with the use of sequencing data from the 31 P. sojae isolates led to the identification of Avr3a as the best candidate gene. Using the CRISPR/Cas9-mediated genome editing method, we demonstrated that the complete knockout of the Avr3a gene in P. sojae induced a gain of virulence towards Rps8. We also demonstrated that a specific Avr3a allele is differentially recognized by Rps3a and Rps8, which results in the first clear distinction between those two resistance genes. This doctoral project provided new information about the complexity of Avr genes and demonstrated that their genomic signatures could be used to precisely predict the interaction of the pathogen with the various Rps genes in soybean. The development of a simple and precise molecular test offers to producers and breeders a concrete solution to effectively exploit the use of Rps genes. Identifying the avirulence gene recognized by Rps8 also provides a head start in disease management, in anticipation of the inevitable emergence of new pathotypes in the future.

L'introduction d'espèces exotiques dans un nouvel environnement constitue l'une des principales causes d'émergence d'agents pathogènes des plantes, à l'origine d'invasions biologiques. C'est le cas de la pourriture brune des cabosses causée par Phytophthora megakarya, à la suite de l'introduction du cacaoyer en Afrique. Cet agent pathogène est endémique à l'Afrique et l'hypothèse la plus probable est celle d'un saut d'hôte à partir d'une plante native africaine. Dans le but de réaliser une étude populationnelle et d'identifier son centre d'origine, nous avons mis au point 12 marqueurs microsatellites. Un total de 727 souches anciennes et récentes, provenant de toute la zone de production cacaoyère en Afrique (Cameroun, Gabon, Sao-Tomé, Nigeria, Togo, Ghana et Côte d'Ivoire) a été analysé. Un mode de reproduction de type clonal a été mis en évidence dans l'ensemble des zones étudiées. Des méthodes de structuration et d'assignation ont permis d'identifier 5 groupes génétiques : 3 groupes Afrique Centrale (AC1, AC2 et AC3), un groupe Afrique de l'Ouest (AO) et un groupe hybride (MC) au Cameroun. Les 5 groupes étaient représentés au Cameroun, suggérant une origine camerounaise de P. megakarya. Au Cameroun, 3 zones géographiques ont montré une forte diversité génétique, mais la zone Ouest qui abrite les zones refuge à Sterculiacées et où ont été implantées les premières cacaoyères serait la zone d'origine et de diversification potentielle de P. megakarya. Le deuxième chapitre de la thèse a porté sur la dynamique spatio-temporelle de P. megakarya en champ, afin d'apporter des informations biologiques complémentaires sur la survie et la dispersion de l'agent pathogène. Une étude épidémiologique a ainsi été menée pendant 2 années consécutives dans 2 zones agroécologiques contrastées au Cameroun (savane et forêt). Les résultats ont montré une diminution significative de l'incidence de la pourriture brune entre les 2 années, en relation certainement avec une variable climatique. Une surdispersion de l'incidence de la maladie a été détectée à la fin de chaque campagne dans les 2 zones, mais l'analyse des semivariogrammes tout au long des 2 campagnes de production a mis en évidence une dépendance spatiale des arbres infectés dans la seule zone forestière. Des foyers d'infection ont été mis en évidence à travers l'analyse de cartes de distribution de la maladie au cours des 2 années successives (GéoStat-R). Nous avons par ailleurs étudié la variabilité génétique entre les souches du sol et celles isolées sur cabosses. Une plus grande diversité génétique a été trouvée dans le sol par rapport aux cabosses infectées, confirmant ainsi que le sol est bien la source d'inoculum primaire de P. megakarya. Mots-clés : Pourriture brune des cabosses, Phytophthora megakarya, émergence, centre d'origine, marqueurs microsatellites, méthodes d'assignation, reproduction clonale, dynamique spatio-temporelle, foyers d'infection. / The introduction of exotic species in a new environment is at the origin of most of the biological invasions. Black pod disease of cacao is an emerging disease caused by Phytophthora megakarya, since the introduction of the cacao in Africa. P. megakarya is endemic in Africa and had most likely emerged on cacao following a host jump from an African native plant. In order to achieve a population study and to identify the center of origin of this pathogen, we selected 12 novel microsatellite markers. A total of 727 strains from all the cacao production zones in Africa (Cameroon, Gabon, Sao-Tomé, Nigeria, Togo, Ghana and Ivory Coast) were analyzed. A clonal mode of reproduction was detected. Structuring and assignment analysis allowed us to identify 5 genetic groups: 3 groups in Central Africa (AC1, AC2 and AC3), one group western Africa (AO) and a hybrid group (MC) in Cameroon. The 5 groups were represented in Cameroon, suggesting a Cameroonian origin of P. megakarya. Three zones in Cameroon showed a strong genetic diversity, but the West would be the potential zone of origin and diversification of P. megakarya. The second chapter of the thesis concerned the spatiotemporal dynamics of P. megakarya in the field, in order to bring additional biological information on the survival and the dispersal of the pathogen. We conducted an epidemiological survey during 2 consecutive years in 2 agroécological zones in Cameroon (savanna and forest). The results showed a significant decrease of the incidence of the desease between 2 years, in relation certainly with a climatic variable. A overdispersion of the incidence of the disease was detected at the end of each campaign in the 2 zones, but the analysis of semivariogrammes throughout 2 production campaigns enlighted a spatial dependence of infected trees in the forest zone only. Infection hot spots were detected through the analysis of disease maps (GéoStat-R). The genetic variability of soil and infected pods isolates was assessed. A higher genetic diversity was found in the soil, suggesting that soil is the primary inoculums sources of P. megakarya. Key-words : Black pod disease, Phytophthora megakarya, emerging disease, center of origin, microsatellite markers, assignation analysis, clonal reproduction, spatiotemporal dynamics, infection hot spots.

In this thesis, I set out to investigate the nature of nonhost resistance responses of Nicotianae sylvestris against Phytophthora capsici and P. infestans. Schulze-Lefert and Panstruga (2011) proposed that the inability of a pathogen to establish infection in nonhost plants could be a feature of the phylogenetic distance between host and nonhost plants. In distantly related plants PAMP triggered immunity is thought to be the major contribution to resistance as effectors are inappropriately attuned to perturb their orthologous plant targets. In contrast, effector triggered immunity (ETI) could be the major contributor to resistance in nonhost plants that are more closely related to the host plants. P. capsici and P. infestans can both infect Solanaceae plants including Solanum lycopersicum and N. benthamiana but both fail to cause disease or complete their life-cycle in N. sylvestris. Based on the hypothesis of Schulze-Lefert and Panstruga (2011), ETI should be contributing towards effective nonhost resistance responses in N. sylvestris against both pathogens. In addition, it is tempting to speculate that N. sylvestris, with a limited availability of functional resistance genes including Nucleotid binding-Leucine rich repeats (NB-LRRs), could be setup to recognise and responds to sequence-related effectors from P. infestans and P. capsici, rather than to have resistance genes that are specifically attuned to either pathogen. I conducted three research strands to test this theory. In Chapter 3 I used MCL clustering to classify 563 P. infestans and 515 P. capsici RXLR effector genes and defined families on the basis of sequence similarity. I found that the P. infestans and P. capsici RXLR complements are mostly species-specific. To investigate the role of ETI in nonhost resistance, 48 P. capsici and 82 P. infestans RXLR were screened for recognition by the nonhost plant N. sylvestris. Using this approach I identified 4 P. infestans and 8 P. capsici effectors that are consistently recognised in N. sylvestris (Chapter 4). Surprisingly, most of the recognised effectors are part of species-specific clusters. In Chapter 5 I established and implemented PathSeq, an enrichment and sequencing tool that facilitates the massively parallel study of naturally occurring diversity of pathogen effectors, including those that are recognised in N. sylvestris. In the same chapter I also used PathSeq and de novo prediction to expand the P. infestans RXLR complement from 563 to 1220 putative effectors. In this thesis I have shown that P. infestans and P. capsici effector set are diversifying at the sequence level. My data also suggests that ETI might play a part in nonhost resistance of N. sylvestris to P. capsici and P. infestans. Finally I have presented PathSeq, a tool that allows the study of the effectors set in multiple isolates at the time, and this, for a fraction of the cost of a full genome sequencing experiment.

Vieni iš pastaruoju metu sparčiai plintančių augalų patogenų – Phytophthora genties patogenai. Šios genties patogenai pažeidžia vertingus vietinius ir iš svetimų kraštų kilusius augalus, augančius natūraliose augavietėse, miestų želdynuose ir medelynuose. Labai svarbu Phytophthora genties įvairių rūšių patogenų sukeliamas ligas kuo greičiau diagnozuoti, nustatyti šių grybų sąveiką su kitų rūšių patogeniniais organizmais bei pažeidžiamomis augalų rūšimis. Šio darbo tikslas – įvertinti juodalksnių (Alnus glutinosa (L.) Gaetrn.), augančių VDU Kauno botanikos sode, pažeistumą Phytophthora genties organizmais: iš infekuotų audinių išauginti ir morfologiškai apibūdinti grynas patogenų kultūras, identifikuoti patogenus naudojant ekspres testą ALERTTM bei išskirti DNR iš infekuotos medienos, lapų ir dirvožemio. Patogenais infekuoti ėminiai buvo auginami 12-oje Petri lėkštelių su morkų gabalėlių terpe ir 11-oje Petri lėkštelių su salyklo ekstrakto su chloramfenikoliu mitybine terpe. Greituoju testu buvo tikrinami 6 dirvožemio pavyzdžiai. Patogenų DNR buvo išskiriama iš infekuotos medienos, lapų ir dirvožemio. Phytophthora genties kolonijų augimo nepastebėta. Ištyrus dirvožemio ėminius buvo gauti teigiami testų rezultatai. Genominės DNR, išskirtos iš medienos bei lapų, koncentracija svyravo nuo 0,64 iki 22,66 ng/ml, o DNR, išskirtos iš dirvožemio, koncentracija svyravo nuo 5,78 iki 10,2 ng/ml. / Pathogens of Phytophthora genus, are very rapidly spreading plant pathogens, recently. Pathogens of this genus negatively effect valuable local plants and those, which are brought from foreign lands ang grow in natural habitats, urban green plantations and arboretums. It is very important to identify diseases, which are caused by this species or other Phytophthora‘s genus pathogens and to identify interaction of these fungi and other pathogenic organisms species, negatively effected plant species. The aim of the study is to assess the damage done by Phytophthora genus organisms to black alders (Alnus glutinosa), growing in VMU Kaunas botanical garden: to morphologically characterize pure culturs of pathogens and grow them from infected tussues, identify pathogens using Express ALERTTM test and extract DNA from infected wood, leaves and soil. Pathogen-infected samples were grown in 12 Petri dishes with carrot medium and in 11 Petri dishes with malt extract and chloramphenicol medium. High-speed test was used for 6 samples of the soil. Pathogen‘s DNA was extracted from infected wood, leaves and soil.Growth of Phytophthora genus polony was not observed. After the analysis of soil-positive test result was obtained. Concentration of genomic DNA from the wood and leaves was 0,64-22,66 ng/ml from leaves and 5,78-10,2 ng/ml from soil.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007. / Full text release at OhioLINK's ETD Center delayed at author's request

L'agriculture mondiale a connu de profonds changements qui lui ont permis de faire face à l'augmentation constante de la demande alimentaire. Cependant, les conséquences de ces nouvelles pratiques agricoles sur l'environnement et la santé humaine font l'objet de préoccupations croissantes. Notamment, les politiques sanitaires actuelles visent à réduire l'utilisation des produits phytosanitaires. Aussi de nouvelles stratégies de protection des cultures doivent-elles être développées. Une meilleure compréhension des échanges moléculaires qui contribuent au succès des bioagresseurs est nécessaire. Ces échanges impliquent notamment la sécrétion de protéines qui interfèrent avec le métabolisme de l'hôte : les effecteurs. Certains d'entre elles sont accumulés au cours de la pénétration des premières cellules végétales, une étape décisive pour le succès de la tentative d'infection. Les travaux menés au cours de cette thèse se sont concentrés sur 3 de ces effecteurs, sécrétés par l'oomycète Phytophthora parasitica. L'analyse des lignées de surexpression chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence des perturbations du développement et de la physiologie de certaines hormones végétales en réponse à l'accumulation de ces effecteurs. Ces données confirment l'importance de la manipulation des voies hormonales dans le cadre des interactions plantes-pathogènes et soutiennent l'hypothèse récente selon laquelle des effecteurs sécrétés par les agents pathogènes interfèrent avec un petit nombre de cibles clefs du métabolisme de l'hôte. Ces cibles constituent des candidats de choix pour développer des variétés plus résistantes. / Agriculture has undergone deep changes that have allowed to cope with the ever-increasing demand for food. However, the consequences of the new agricultural practices on the environment and human health are the subject of increasing concern. Notably, current health policies aimed at reducing the use of pesticides in agriculture. Thus, new strategies need to be developed for efficient crop protection. In particular, a better understanding of molecular exchanges that contribute to the success of pathogens is required. These exchanges include the secretion of proteins that interfere with host metabolism : the effectors. Some of them are accumulated during the penetration of the first plant cells, a crucial step for the success of the infection attempt. This thesis work focused on three of these effectors, secreted by the oomycete Phytophthora parasitica. The analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines highlighted perturbations of plant development and hormone physiology in response to the accumulation of these effectors. These data confirm the pivotal role of hormonal balance during plant-pathogen interactions and support the recent hypothesis that effectors secreted by evolutionarily distant plant pathogens interfere with a small number of key target host metabolism. These targets are good candidates to develop varieties that are more resistant to infection.

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:57:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5948.pdf: 2099671 bytes, checksum: a2a82b16af89dab4eb5f364794eebc2f (MD5) Previous issue date: 2014-05-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The species of fungi belonging to the genus Trichoderma can be found in many environments, especially in the rhizosphere, as colonizers of roots and plant growth promoters, for their ability in facilitating the absorption of nutrients and protecting them against attack by pathogens. Thus, this study aimed to test isolates of Trichoderma spp. for application as growth promoting agents and inducers of resistance to Phytophthora nicotianae in citrus rootstocks. First, eighteen isolates of Trichoderma were tested in vitro for their ability in inhibiting mycelial growth of P. nicotianae, in terms of: production of volatiles or termostable antifungical substances and cell free compounds. The growth promotion test was done with three rootstocks: Sunki tangerine, Swingle citrumelo and Rangpur lime, whose height and number of leaves were measured at 30, 60, 90, 120, 150 and 180 days after treatment with the antagonistic; and in the end of the test, the measuring of dry weight for shoots and roots of plants was measured. The seeds of the rootstocks were treated with the Trichoderma spp isolates and, 180 days later, was tested their capacity of resistance induction through pathogen inoculation on stem, assessed by lesion length. The Phytophthora control assay was carried out by seeds microbiolization of tangerine Sunki and Rangpur lime. By the results, it was found that all Trichoderma spp. isolates provided more than 50% inhibition of the pathogen colony, however, no one produced volatile metabolites. Five isolates produced cell free metabolites and, only the ACB-38 produced termostable antifungal substances, capable of inhibiting the pathogen growth. Trichoderma spp. has the potential for rootstocks growth promoting and resistence inducing to P. nicotianae, but the responses vary according to the plant genotype and the type of isolate antagonist applied. Most isolates of Trichoderma spp. tested were able to control P. nicotianae in Sunki tangerine and Rangpur lime plants. / As espécies de fungos pertencentes ao gênero Trichoderma podem ser encontradas em muitos ambientes, principalmente na rizosfera, como colonizadores de raízes de plantas e promotores de crescimento das mesmas, por facilitarem a absorção de nutrientes, além de protegê-las contra o ataque de fitopatógenos. Sendo assim, esse trabalho teve por objetivo selecionar isolados de Trichoderma spp. com potencial de aplicação como agentes promotores de crescimento e indutores de resistência à Phytophthora nicotianae em porta-enxertos de citros. Primeiramente, avaliou-se in vitro a produção de metabólitos voláteis, termoestáveis e livres de células de dezoito isolados de Trichoderma spp., assim como, a atividade antagônica sobre o crescimento micelial do patógeno. Os testes in vivo compreenderam estudos de promoção de crescimento de três porta-enxertos: tangerina Sunki, citrumelo Swingle e limão Cravo, avaliando-se a altura e o número de folhas aos 30, 60, 90, 120, 150 e 180 dias após o tratamento com o antagônico e, a produção de massa seca da parte aérea e raiz das plantas. Microbiolizou-se as sementes dos porta-enxertos e testou-se a indução de resistência pela inoculação no caule, 180 dias após o tratamento, avaliada pelo comprimento de lesão. O teste de controle de Phytophthora foi realizado pela microbiolização de sementes de tangeriana Sunki e limão Cravo. Pelos resultados dos testes in vitro, verificouse que, todos os isolados de Trichoderma spp. proporcionaram mais de 50 % de inibição na colônia do fitopatógeno, porém, nenhum produziu metabólitos voláteis. Cinco isolados produziram metabólitos livres de células e, somente o ACB-38 produziu substâncias antifúngicas termoestáveis, com capacidade para inibir o desenvolvimento do patógeno. Trichoderma spp. têm potencial para promover crescimento de porta-enxertos cítricos, bem como induzir a resistência à P. nicotianae, porém, as respostas variam de acordo com o genótipo da planta e com o isolado do antagonista utilizado. A maioria dos isolados de Trichoderma spp. testada foi capaz de controlar P. nicotianae em plantas de tangerina Sunki e limão Cravo.

L’agent pathogène Phytophthora parasitica est un oomycète qui a des effets dévastateurs sur l’agriculture et les écosystèmes naturels. En tant qu'organisme hémi-biotrophe, il infecte les racines des plantes en établissant d'abord un contact intime avec les cellules hôtes (biotrophie) avant de les tuer (nécrotrophie) et de terminer son cycle d'infection. Pour contrôler ces processus, les oomycètes sécrètent des protéines effectrices, qui sont internalisées dans les cellules végétales par un motif de translocation (appelé RxLR-EER) pour manipuler la physiologie et les réponses immunitaires de l'hôte. Les études des échanges moléculaires entre Phytophthora parasitica et la plante qui ont été menées par le laboratoire d'accueil ont permis d'identifier un effecteur RxLR, dénommé Avh195. La séquence en acides aminés de l'effecteur est caractérisée par la présence de cinq motifs AIM (« ATG8 Interacting Motive ») qui indiquent une interaction potentielle avec la protéine centrale de l’autophagie, ATG8. Avh195 co-localise avec la fraction membranaire de l'ATG8, et un système double-hybride en levure permettant la détermination d’interactions entre protéines membranaires, a confirmé une interaction non sélective entre Avh195 et plusieurs isoformes d'ATG8. La caractérisation de la perturbation de l'autophagie dépendante de Avh195 a été réalisée dans l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii après génération de lignées transgéniques surexprimant l'effecteur. Les analyses par cytométrie de flux ont révélé que Avh195 ne modifie pas la physiologie et la « fitness » de l'algue dans des conditions de croissance normales et pendant l'autophagie induite par la rapamycine. La microscopie électronique à transmission a révélé que l'effecteur provoque dans les cellules de l’algue un retard dans le flux autophagique, se traduisant par une réduction de la coalescence et de la clairance des vacuoles et une forte accumulation d'amidon dans les chloroplastes. Cependant, ce phénotype est transitoire et seulement légèrement lié aux modifications de la régulation transcriptionnelle de la machinerie autophagique. L'analyse de la fonction effectrice chez les plantes a montré que Avh195 retarde le développement de la mort cellulaire hypersensible, déclenchée par un éliciteur d’oomycète. Cette activité dépend de trois AIM sur cinq, ce qui renforce encore l’importance de l’interaction Avh195-ATG8 pour la fonction de l’effecteur. La surexpression stable d'Avh195 chez A. thaliana a permis de déterminer que l'effecteur n'altère pas les réponses immunitaires des plantes, mais favorise globalement le développement de l'agent pathogène, accélérant le passage de la biotrophie à la nécrotrophie au cours de l'infection. À notre connaissance, le travail présenté dans cette thèse représente la première preuve qu'un effecteur d’oomycète possède une activité transitoire, ciblant de manière non sélective la protéine ATG8 dans différents organismes photosynthétiques pour ralentir le flux autophagique, favorisant ainsi le mode de vie hémi-biotrophe d'un agent pathogène. / The plant pathogen Phytophthora parasitica is an oomycete with devastating impact on both agriculture and natural ecosystems. As a hemi-biotrophic organism it infects the roots of plants first establishing an intimate contact with host cells (biotrophy) before killing them (necrotrophy) and completing its infection cycle. To control these processes, oomycetes secrete effector proteins, which are internalized in plant cells by a translocation motif (called RxLR-EER) to manipulate the physiology and the immune responses of the host. Studies of the molecular exchanges between Phytophthora parasitica and the plant that were conducted by the hosting laboratory led to the identification of an RxLR effector, designed to as Avh195. The amino acid sequence of the effector is characterized by the presence of five AIMs (ATG8 interacting motifs), that indicate a potential interaction with the autophagic core protein, ATG8. Avh195 colocalizes with the membrane-bound fraction of ATG8, and a yeast two-hybrid system, which allows to determine interactions between membrane proteins, confirmed a non-selective interaction between Avh195 and several ATG8 isoforms. The characterization of Avh195-dependent autophagy perturbation was carried out in the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii after generation of transgenic lines overexpressing the effector. Analyses by flow cytometry revealed that Avh195 does not modify the physiology and fitness of the alga, both under normal growth conditions and during rapamycin-induced autophagy. Transmission electron microscopy of cells revealed that the effector provokes a delay in the autophagic flux, manifested as a reduced coalescence and clearance of autophagic vacuoles and a strong accumulation of starch in chloroplasts. However, this phenotype was transient and only slightly related to modifications in the transcriptional regulation of the autophagic machinery. The analysis of effector function in planta showed that Avh195 delays the development of hypersensitive cell death, which is triggered by an oomycete elicitor. This cell death-delaying activity is dependent on three out of five AIMs, further consolidating the importance of the Avh195-ATG8 interaction for the function of the effector. The stable overexpression of Avh195 in A. thaliana allowed to determine that the effector does not impair plant defense responses, but overall promotes the development of the pathogen, accelerating the switch from biotrophy to necrotrophy during infection. To our knowledge, the work presented in this thesis represents the first evidence for an oomycete effector to possess a transitory activity, which targets in a non-selective manner the protein ATG8 in different organisms from the green lineage to slow down autophagic flux, thus promoting the hemibiotrophic life style of a pathogen.

Resumé<p>La pourriture brune de la cabosse de Theobroma cacao L. induite par Phytophthora palmivora est un maladie qui à l’échelle mondiale, cause de sérieuses pertes dans les plantations de cacao. L'utilisation de fongicides est coûteuse et est nuisible pour l'environnement. L'utilisation de micro-organismes est une alternative écologique<p>attractive pour les producteurs. L’objectif de ce travail est d’isoler et de caractériser des rhizobactéries de T. cacao avec une activité antagoniste contre Phytophthora palmivora, l'agent causal de la pourriture des cabosses. Parmi les 127 rhizobactéries isolés, trois isolats CP07, CP24 et CP30, identifiées comme Pseudomonas chlororaphis, ont montré une activité<p>antagoniste in vitro et in vivo contre P. palmivora. <p>La production d'enzymes lytiques, de sidérophores, de biosurfactants et d’HCN, ainsi que la détection de gènes codant pour des antibiotiques, la formation de biofilm et la mobilité des bactéries ont également été évalués pour les trois souches de rhizobactérie.<p>Le séquençage du génome de CP07 a confirmé la présence de gènes codant pour trois types de sidérophores, d’HCN, de phénazines et de biosurfactants de la famille de la viscosine, notamment. Un mutant de CP07 déficient dans la production viscosine a été généré et les études effectuées sur ce mutant indiquent que ce bio-tensioactif particulier est essentiel à la fois pour la mobilité bactérienne et pour la formation de biofilm, mais pas pour l'antagonisme in vitro contre Phytophthora, bien qu'il puisse contribuer à la bioprotection de T. cacao.<p>Cette étude fournit une base théorique pour l'utilisation potentielle de P. chlororaphis<p>CP07 comme un agent de lutte biologique pour la protection des plantes de cacao contre l'infection par P. palmivora.<p><p><p>Abstract<p>The black pod rot in Theobroma cacao L. is a major problem worldwide and in Cuba, is<p>one of the most important diseases. The use of chemical fungicides is expensive and<p>harmful to the environment. The use of microorganisms is an environmentally<p>attractive alternative for producers. In this work, fluorescent Pseudomonas strains were<p>isolated from cocoa rhizosphère. The in vitro antagonistic activity and bioprotection<p>against Phytophthora palmivora (Butler) was evaluated. Three strains with in vitro<p>antagonistic activity and bioprotection, CP07, CP24 and CP30, belonging to the species Pseudomonas chlororaphis, were obtained. P. chlororaphis CP07 was highlighted for the best behavior in vitro and in vivo. P. chlororaphis CP07 produces siderophores, HCN,<p>biosurfactants, exoproteases, lipases and motility (swarming and twitching). Genome<p>sequencing confirmed the presence of genes encoding three types of siderophores, HCN, phenazines, the biosurfactant viscosin, and exoproteases, among others. A mutant impaired in biosurfactant production was constructed. When the mutant was characterized, it was evident that the biosurfactant was not involved in the antagonistic effect in vitro against P. palmivora Mab1, although it is crucial to the motility and the ability to form biofilms. P. chlororaphis CP07 was selected as a potential biological control agent against Phytophthora. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished