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Biogenesis and dynamics of the early secretory pathway in Pichia pastoris /Bevis, Brooke J. January 2002 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Pritzker School of Medicine, Department of Molecular Genetics and Cell Biology, June 2002. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.
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Analysis of the localization of Pichia pastoris Sec12p to transitional endoplasmic reticulum sites /Soderholm, Jonathan F. January 2003 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Dept. of Molecular Genetics and Cell Biology, June 2003. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.
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Immobilisierung von BPA-Bindeproteinen an der Oberfläche von HefezellenMergler, Magnus. Unknown Date (has links) (PDF)
Techn. Hochsch., Diss., 2003--Aachen.
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Expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris de uma quitinase antifúngica da família 19 das glicosídeo hidrolases de Chromobacterium violaceum. / Expression in Escherichia coli and Pichia pastoris an antifungal chitinase family 19 of glycoside hydrolases Chromobacterium violaceum.Nepomuceno, Denise Rocha January 2012 (has links)
NEPOMUCENO, D. R. Expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris de uma quitinase antifúngica da família 19 das glicosídeo hidrolases de Chromobacterium violaceum. 2012. 171 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:39:14Z
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Previous issue date: 2012 / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The annotation of the genome of this species revealed many genes encoding products with potential applications in many areas. Among these products are several chitinases, which are enzymes capable of degrading chitin, a polysaccharide of N-acetyl-β-D-glucosamine. Chitin is found in the cell wall of many fungi and in the exoskeleton of insects and crustaceans. Chitinases are of great biotechnological interest because these enzymes can be used to produce useful derivatives from chitin, and also to be exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase (CV1897) belonging to family GH19 from C. violaceum ATCC 12472. The complete sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP+, with the native signal peptide) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET302/NT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. The partial sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP-, without the native signal peptide) was expressed only in P. pastoris. In E. coli the rCV1897SP+ was mainly produced as insoluble inclusion bodies. In P. pastoris, the two versions of the protein (rCV1897PS+ and rCV1897PS-) were secreted into the culture medium, in their soluble and functional form. The enzymes were purified by affinity chromatography on immobilized nickel ions, with yields of 1.8 mg/L (rCV1897PS+) and 2.1 mg/L (rCV1897PS-), being detected by electrophoresis as two isoforms with different molecular weights. The recombinant chitinase (rCV1897PS+) showed optimal hydrolytic activity at pH 5.0 and was active after treatement at temperatures up to 40 °C for 30 min. The rCV1897 showed chitinolytic activity against colloidal chitin and glycol-chitin on SDS-PAGE. Circular dichroism spectra showed that the protein has predominantly α-helical arrangements (37%), also having 26% of β-strands and 38% disordered structure. The fluorescence spectra revealed that the protein was produced in their folded conformation. The rCV1897PS+ inhibited the conidial germination and mycelial growth of the phytopathogenic fungi Penicillium herquei and Colletotrichum lindemuthianum. Both rCV1897PS+ and rCV1897PS- in combination with fluconazole acted synergistically against different strains of the human pathogenic yeast Candida tropicalis. The biochemical, structural and biological studies of rCV1897 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, saprófita, não patogênica e de vida livre. A anotação do genoma dessa espécie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicações em diversas áreas. Dentre esses produtos estão várias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarídeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustáceos. As quitinases são de grande interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados úteis, e também para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização bioquímica, estrutural e biológica de uma quitinase recombinante (CV1897), da família 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequência completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptídeo sinal nativo) foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequência parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptídeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusão, de forma insolúvel e inativa. Em P. pastoris, as proteínas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solúvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em níquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade ótima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de até 40 °C por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinásica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroísmo circular revelaram que a estrutura da proteína possui predominantemente estrutura secundária do tipo α-hélice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescência revelaram que a proteína foi produzida na sua conformação enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinação de conídios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associação com o fluconazol atuaram de forma sinérgica contra diferentes cepas da levedura patogênica Candida tropicalis. Os estudos bioquímicos, estruturais e biológicos da rCV1897 poderão ser úteis para aplicação biotecnológica dessa enzima.
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Produção heteróloga do peptídeo antimicrobiano AFP 1.5 em Pichia pastorisValença, Iara Holanda 06 July 2015 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-03T16:47:27Z
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2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Os peptídeos antimicrobianos são importantes moléculas do sistema imune inato dos organismos. Essas moléculas podem interagir com membranas lipídicas, levando a formação de poros ou a desestabilização da mesma, resultando no extravazamento e morte celular. Essa característica revela que os peptídeos antimicrobianos apresentam um possível potencial contra microrganismos patogênicos. No entanto, adquirir essas moléculas para serem imediatamente aplicadas na indústria farmacêutica de seu habitat natural é inviável, já que as quantidades obtidas são muito baixas. Sendo assim, uma opção é a produção por meio da utilização de sistemas heterólogos de expressão. A levedura metilotrófica Pichia pastoris é um dos sistemas de expressão heterólogos mais utilizados. Os peptídeos anticongelantes (antifreeze peptide – AFP), são uma classe de peptídeos antimicrobianos multifuncionais isolados de animais de regiões polares, onde essas moléculas impedem a formação de cristais de gelo nos fluídos corporais desses organismos. O sintético AFP 1.5 é um peptídeo anticongelante retirado do peixe Pleuronectes americanus. Esse peptídeo foi expresso no sistema heterólogo de produção Pichia pastoris. Foi realizada uma expressão com indução por metanol à 0,5% por 48 horas e um ensaio antimicrobiano por disco de difusão contra Escherichia coli. O ensaio antimicrobiano contra E. coli apresentou resultados positivos, com a formação de halos de inibição nos sobrenadantes dos clones 1, 2 e 4. Com o resultado positivo em E. coli se torna necessário novos testes de expressão, a fim de melhorar a produção da proteína recombinante. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides are important molecules of the innate immune system of the organisms. These molecules may interact with lipid membranes, leading to pore formation or the destabilization of the membrane, resulting in leakage and cosnequently cell death. This feature reveals that the antimicrobial peptides are potential drug candidates for antimicribal diseases. However, in order to apply those molecules in the pharmaceutical industry it is not feasible to isolate them from its natural habitat since the relevant amounts are very low. Thus, one option is its production using heterologous expression systems. The methylotrophic yeast Pichia pastoris is one of the most utilized heterologous expression systems. The antifreeze peptides - AFP are a class of multifunctional antimicrobial peptides isolated from animals polar regions, where these molecules prevent the formation of ice crystals in the body fluids of these organisms. The synthetic AFP 1.5 is an antifreeze peptide removed from the fish Pleuronectes americanus. This peptide was produced in Pichia pastoris. An expression induction with 0.5% methanol for 48 hours and an antimicrobial disc diffusion assay against Escherichia coli was performed. The antimicrobial test against E. coli showed positive results with the formation of inhibition zones in the supernatants of clones 1, 2 and 4. With a positive result in E. coli, it is necessary to test new expression, in order to improve production of the recombinant protein.
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Produção de glicerol quinase em Pichia pastorisAizemberg, Raquel [UNESP] 12 August 2011 (has links) (PDF)
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aizemberg_r_me_arafcf.pdf: 685654 bytes, checksum: d058342c2d66649275266dc34dcb968d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A levedura Pichia pastoris vem sendo largamente utilizada como um eficiente sistema de expressão para a produção de proteínas heterólogas, pois é um sistema seguro, fácil e mais barato que sistemas de expressão de outros eucariotos. Neste trabalho, a enzima de interesse é a glicerol quinase (GK), que cataliza a transferência do fosfato terminal do ATP para o glicerol originando glicerol-3-fosfato e ADP. Esta reação pode ser utilizada na determinação da concentração de glicerol, subproduto da fermentação alcoólica. A leitura do consumo de glicerol é realizada pela determinação espectrofotométrica do NADH gerado na reação de oxido-redução catalizada pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Este estudo de indução foi realizado em diferentes condições de crescimento da levedura Pichia pastoris. Os resultados mostraram a seleção do melhor clone da levedura Pichia pastoris para a expressão extracelular da enzima glicerol quinase, e a determinação das melhores condições do meio de cultura para a produção da enzima de interesse foram: concentração do meio de cultura BMMY (20 vezes), densidade inicial de célula (0,1 mg/mL), concentração de metanol na fase de indução (1%), natureza do tampão (fosfato de potássio), pH (6,0), suplementação de glicerol no meio BMMY (1%), peptona (marca Difco), sem adição de sulfato de amônio, caseína e glicina, uso do meio BMMY e liofilização do mesmo. Estudos de parâmetros cinéticos foram realizados e a atividade máxima da GK foi obtida em pH 9,8, a 50ºC e 2,5 μM de substrato, por metodologia clássica, além da presença de sulfato de magnésio e diluição da enzima de 30 vezes. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente... / The yeast Pichia pastoris has been widely used as an efficient expression system for production of heterologous proteins because it is a safe, easy and cheaper than expression systems in other eukaryotes.In this studie, the enzyme of interest is glycerol kinase (GK), which catalizes the transfer of terminal phosphate from ATP to glycerol resulting glycerol-3-phosphate and ADP. This reaction can be used in determining the concentration of glycerol, a byproduct of fermentation. The reading of the consumption of glycerol is carried out by spectrophotometric determination of NADH generated in the redox reaction catalyzed by the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase. This study of induction was performed in different conditions of growth of the yeast Pichia pastoris. The results show that selecting the best clone of the yeast Pichia pastoris for the expression of extracellular enzyme glycerol kinase, and determining the best conditions of the culture medium for producing the enzyme of interest were: concentration of the culture medium BMMY (20 times), initial cell density (0.1 mg/mL), methanol concentration in the induction phase (1%), nature of buffer (potassium phosphate), pH (6.0), glycerol supplementation in BMMY medium (1%), peptone (Difco), without addition of ammonium sulfate, casein and glycine in BMMY and lyophilized medium. Studies of kinetic parameters were conducted and the GK maximum activity was obtained at pH 9.8 at 50°C and 2.5 μM substrate by conventional method, besides the presence of magnesium sulfate and diluting the enzyme 30 times. The enzyme showed high thermal stability - the activity was fully maintained up to 50°C for one hour - and at pH 7.0 for 7 days and kept under refrigeration, freeze-dried extract showed a decrease in enzymatic activity. Calculated by... (Complete abstract click electronic access below)
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Clonagem e expressão de fragmentos de anticorpos (FABs) anti-HIV-1 em Pichia pastorisSimi, Kelly Cristina Rodrigues 12 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T23:42:04Z
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2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença pandêmica que
atinge diversos países no mundo todo. Atualmente, não existe uma vacina eficiente contra o vírus da imunodeficiência (HIV) devido a habilidade do vírus de escapar do sistema imune.
Contudo, estudos recentes têm utilizado glicoproteínas do envelope do HIV como potencial alvo para o desenvolvimento de uma vacina capaz de inibir a entrada do vírus na célula hospedeira.
Recentemente, nosso grupo selecionou fragmentos de anticorpos (Fabs) de uma biblioteca combinatória de anticorpos de pacientes com osteosarcoma direcionados para um peptídeo sintético de um epítopo neutralizante da gp41. No presente trabalho, foram clonados os Fabs anti-gp41-HIV em vetor de expressão de Pichia pastoris. Após a obtenção das clonagens dos Fabs nesse vetor as respectivas sequências foram confirmadas. A levedura Pichia pastoris tem
sido largamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes com sucesso. O nível de expressão obtido para os Fabs na levedura Pichia pastoris foi muito baixo. Esses Fabs
demonstraram possuir um bom índice de adaptação de códon para a expressão em Pichia
pastoris. Dessa forma, ajustes no protocolo de expressão deverão ser realizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is a pandemic deficiency through
out the continent. At the moment there is not an efficient vaccine against immunodeficiency virus (HIV) due the virus efficient escape of from the immune system. However, recent studies have used glycoprotein of HIV as a potential target to development a vaccine to inhibit the virus
entry into host cells. Recently, our group selected antibody fragments (Fabs) from an antibody combinatorial library of osteosarcoma patients directed to a synthetic biotinilated peptide gp41
neutralizing epitope (576 to 619 amino acids residues). In this work, the Fabs anti-gp41-HIV into a Pichia pastoris were cloned into expression vector. Three Fabs were cloned into this vector
with correct sequence. Pichia pastoris has been used extensively and successfully to express recombinant proteins. Unfortunately, the recombinant proteins were expressed in low levels.
However, this Fabs showed to have a good codon adaptation index to be expressed in Pichia pastoris, thus adjustment in the protocol must be performed.
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Heterologous expression of a glycoside hydrolase Family 18 (cv2736) of Chromobacterium violaceum in Pichia pastoris with potential antibacterial / ExpressÃo heterÃloga de uma glicosil hidrolase da FamÃlia 18 (cv2736) de Chromobacterium violaceum em Pichia pastoris com potencial antibacterianoSuelen Carneiro de Medeiros 24 August 2012 (has links)
CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarÃdeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que à extremamente abundante na natureza. ApÃs o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteÃnas com potencial biotecnolÃgico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteÃna CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em cÃlulas de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importÃncia mÃdica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteÃna truncada, sem um possÃvel peptÃdeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressÃo pPICZαA, para expressÃo em P. pastoris KM71H. A proteÃna completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fraÃÃo proteica, contendo as proteÃnas secretadas para o meio de cultura, por cÃlulas de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressÃo recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogÃnea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo trÃs bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoÃcidos. ApÃs coloraÃÃo com reagente de Schiff para revelaÃÃo de glicoproteÃnas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. AlÃm disso, rCV2736PS+ teve seus peptÃdeos identificados por espectrometria de massas, na fraÃÃo F0/95 do meio de cultura livre de cÃlulas. A proteÃna recombinante produzida sem os 22 aminoÃcidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinÃsica maior que a encontrada para a fraÃÃo contendo rCV2736PS+, apesar de nÃo ter sido detectada por SDS-PAGE. A fraÃÃo F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestÃvel atà 50ÂC e com pico de atividade quitinolÃtica em pH 3,0. A mesma fraÃÃo apresentou maior atividade endoquitinÃsica e ativa contra os substratos sintÃticos 4-nitrofenil N,Nââdiacetil-β-D-quitobiosÃdeo e 4-nitrofenil N,Nâ,Nâââtriacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), tÃpico das proteÃnas da famÃlia GH18. Do mesmo modo, a fraÃÃo F0/95 foi testada contra seis espÃcies de bactÃrias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fraÃÃo foi testada contra a levedura Candida albicans, mas nÃo foi detectada inibiÃÃo do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteÃna recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molÃcula com potencial antibacteriano.
Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; ExpressÃo heterÃloga. / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a
polysaccharide composed of units of N-acetyl-D-
glucosamine, which is abundant in nature.
The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472
has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism
of medical importance. To this purpose, the full ORF
(encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ
α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736
PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41.
3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiffâs reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed
higher chitinase activity than that found for th
e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium
of induced cells, was active after heat treatment at
50 ÂC and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to
degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl
-β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet
yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated
that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8
barrel (also known as TIM barrel), which is typical of
the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same
fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition
of this microorganism in the assay. These results
suggest that rCV2736 should be further studied as a new
anti-bacterial agent.
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Desenvolvimento de estratégias vacinais contra doenças associadas ao papilomavírus bovinoJesus, André Luiz Santos de 03 May 2013 (has links)
Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:30:04Z
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Previous issue date: 2013-05-03 / CAPES; CNPq / Os papilomavírus são conhecidos por causarem lesões em tecidos epiteliais em uma variedade de animais. Em bovinos, as doenças associadas ao papilomavírus bovino (BPV) geram perdas econômicas para os criadores. Até agora não existem vacinas ou tratamentos eficazes contra BPV. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver estratégias vacinais contra doenças associadas ao BPV. Para a produção de vacinas de subunidade, a levedura Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a produção de várias proteínas recombinantes. Os genes L1 de BPV1, 2 e 4 foram clonados em vetor de expressão, sob regulação do promotor induzível por metanol AOX1. Os recombinantes produziram proteína viral, mas em níveis baixos. Para aumentar a produção, foi utilizada a estratégia de otimização dos códons aliada ao uso de bioreator. Alem disso, o gene L1 de BPV1 foi clonado em vetor não comercial, sob controle do promotor constitutivo PGK1. A proteína L1 foi detectada por imunoblot no sobrenadante da cultura dos recombinantes. Como abordagem terapêutica, a imunização genética tem sido empregada com alguns produtos disponíveis no mercado. Os genes L2 e E5 de BPV1 foram clonados em vetor de expressão pCI-neo e as construções foram utilizadas para transfectar células HEK293. A expressão gênica foi detectada por RT-PCR e a produção das proteínas virais foi confirmada por Western blot. O presente estudo apresenta resultados promissores para o desenvolvimento de uma plataforma vacinal contra infecções pelo BPV.
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Expressão das proteínas não-estrutural 1 (NS1) dos vírus Dengue-1, Dengue-3 e Dengue-4 em Pichia pastoris / Expression of the nonstructural proteins 1 (NS1) of the Dengue-1, Dengue-3 and Dengue-4 viruses in Pichia pastorisPrates, John Willians Oliveira 20 July 2017 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-27T14:33:18Z
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Previous issue date: 2017-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A dengue é uma doença amplamente distribuída pelo mundo, e representa um grande problema de saúde pública em vários países. As manifestações clínicas podem variar desde uma síndrome viral inespecífica e benigna, até um quadro grave e fatal de doença hemorrágica com choque. O diagnóstico na sua fase inicial é muito importante, pois auxilia no tratamento sintomático do paciente e na adoção de medidas para o controle do vetor, prevenindo a dispersão da doença. Nesse contexto, a detecção de antígenos virais, especialmente a proteína não estrutural 1 (NS1), é uma alternativa muito eficaz para realizar o diagnóstico da dengue. Essa proteína é sintetizada pelas células infectadas, podendo ser detectada nos sobrenadantes das culturas ou no soro de pacientes infectados. Dessa forma, ela pode ser utilizada como antígeno para o desenvolvimento de kits de diagnóstico. No entanto, um grande problema no desenvolvimento de tais kits, consiste na obtenção desses antígenos, que geralmente é realizado por métodos caros, trabalhosos e de difícil execução. Nesse contexto, objetivou-se nesse trabalho utilizar um sistema de expressão eucariótico para produzir as proteínas NS1 dos vírus dengue-1, -3 e -4, e avaliar a sua antigenicidade. O gene otimizado da proteína NS1 do vírus dengue-4 foi clonado no plasmídeo pPICZαA, o qual foi utilizado para transformar leveduras Pichia pastoris por eletroporação. Posteriormente,a levedura transformada foi submetida á indução da expressão da proteína NS1. Outras duas leveduras transformadas, de maneira independente, com dois plasmídeos diferentes (pPICZαA/NS1DENV1 e pPICZαA/NS1DENV3) também foram induzidas a expressar as proteínas NS1 dos vírus dengue-1 e dengue-3. Proteínas de 60 kDa (NS1 DENV4), e duas de 50 kDa (NS1 DENV-1 e NS1 DENV-3) foram obtidas. Essas proteínas mostraram-se antigênicas no teste de Western Blot, demonstrando o seu potencial para serem utilizadas como antígenos para aplicações diagnósticas. / Dengue is a disease widely distributed throughout the world and represents a major public health problem in several countries. Clinical manifestations may range from a benign non-specific viral syndrome to severe and fatal hemorrhagic shock syndrome. The diagnosis in its initial phase is very important, since it assists in the symptomatic treatment of the patient and in the adoption of measures for the control of the vector, preventing the dispersion of the disease. In this context, detection of viral antigens, especially nonstructural protein 1 (NS1), is a very effective alternative for the diagnosis of dengue. This protein is synthesized by infected cells and can be detected in culture supernatants or in the serum of infected patients. In this way, it can be used as antigen for the development of diagnostic kits. However, a major problem in the development of such kits is the procurement of these antigens, which is usually accomplished by costly, laborious and difficult methods. In this context, the objective of this study was to use a eukaryotic expression system to produce the NS1 proteins of dengue-1, -3 and -4 viruses, and to evaluate their antigenicity. The optimized NS1 protein gene of the dengue-4 virus was cloned into the plasmid pPICZαA, which was used to transform Pichia pastoris yeasts by electroporation. Subsequently, the transformed yeast was subjected to the induction of NS1 protein expression. Two other yeasts independently transformed with two different plasmids (pPICZαA/NS1DENV1 and pPICZαA/ NS1DENV3) were also induced to express the NS1 proteins of the dengue-1 and dengue-3 viruses. Proteins of 60 kDa (NS1 DENV4) and two of 50 kDa (NS1 DENV1 and NS1 DENV3) were obtained. These proteins were shown to be antigenic in the Western Blot test, demonstrating their potential to be used as antigens for diagnostic applications.
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