A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.

Matrizes extracelulares descelularizadas (dMEC) têm sido utilizadas com sucesso como biomateriais biológicos para regeneração tecidual, já que apresentam vantagens como semelhança estrutural com os tecidos naturais, biocompatibilidade , biodegradabilidade, capacidade de sinalização e homeostase tecidual. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de quatro protocolos para descelularização de músculo esquelético murino, objetivando a produção de matrizes extracelulares (MEC) acelulares para potenciais aplicações na engenharia de tecidos. Músculos tibiais foram coletados e congelados a -20°C ou armazenados a temperatura ambiente, seguido por descelularização em soluções contendo reagentes químicos EDTA + Tris, SDS e Triton X-100, os quais foram aplicados em diferentes sequências e analisados de acordo com modificações macroscópicas causadas nos tecidos, remoção de conteúdo celular e genético das matrizes e na capacidade de preservar a composição protéica e estrutura tridimensional da MEC. Observou-se a otimização da remoção de conteúdo celular, além da preservação da ultraestrutura e composição da MEC nos protocolos com congelação prévia a -20°C e descelularização inicial com a solução SDS, quando comparado àqueles que iniciaram com EDTA + Tris. O segundo objetivo deste trabalho foi comparar a biocompatibilidade da dMEC de músculo murino e placenta canina em modelo murino de injúria muscular. As dMEC foram produzidas a partir da placenta canina (1% SDS, 5 mM EDTA + 0,05% Tripsina, 1% Triton X-100) e do músculo esquelético tibial de ratos Wistar (Congelação a -20°C, 1% SDS, 5 mM EDTA + 50mM Tris, 1% Triton X-100). A lesão muscular foi realizada a partir de uma incisão de 1cm e divulsão na região média do músculo tibial; então, as dMEC foram implantadas. Um grupo cirúrgico, sem o implante, foi usado como um controle. Os animais foram eutanasiados depois de 3, 15 e 45 dias. Análise histológica e imunohistoquímica foram realizadas para avaliar a morfologia tecidual e a presença de infiltrado inflamatório e células em proliferação (CD163 e PCNA). No 3° dia após a implantação, uma intensa reação inflamatória (CD163+) e proliferação celular (PCNA+) foram observadas, adjacentes ao biomaterial, em ambas as matrizes. No 15° dia, o biomaterial de MEC placentária ainda preservou o infiltrado celular (CD163+ e PCNA+) e iniciou o processo de absorção do biomaterial, enquanto que a dMEC do músculo já estava completamente absorvida. Finalmente, depois dos 45 dias, ambos os biomateriais foram absorvidos e o músculo estava completamente cicatrizado, sem fibrose. Conclui-se que congelar as amostras a -20°C anteriormente ao processamento e submeter à incubação inicial em solução de 1% SDS (Protocolo 2B) favoreceu a descelularização de músculo esquelético murino. Além disso, dMEC xenogênicas e alogênicas foram reabsorvidas e apresentaram processos de integração distintos em modelo não-crítico de lesão muscular esquelética, sugerindo que eventuais alterações sistêmicas, observadas a longo prazo, sejam avaliadas, bem como, a validação da utilização destas matrizes em modelos de perda muscular volumétrica. / Decelularized extracellular matrices (dECM) have been successfully used as biological biomaterials for tissue engineering, since they present advantages such as structural similarity with natural tissues, biocompatibility, biodegradability, signaling capacity and tissue homeostasis. The first aim of this study was to evaluate the efficacy of four protocols for the decellularization of murine skeletal muscle for the production of acellular extracellular matrices (ECM) for potential applications in tissue engineering. Tibial muscle was frozen at -20°C or stored at room temperature, followed by decellularization in solutions containing EDTA + Tris, SDS and Triton X- 100 chemical reagents, which were applied in different sequences and analyzed according to macroscopic modifications , removal of cellular and genetic content and the ability to preserve the ECM composition and three-dimensional structure. Thus, the optimization of cellular removal was observed, as well as the preservation of the ECM ultrastructure and composition in the protocols with freezing at -20°C and initial decellularization with the SDS solution, when compared to those starting with EDTA + Tris. The second aim of this study was to compare the biocompatibility of the dECM of murine muscle and canine placenta in murine model of muscle injury. Decellularized ECM were produced from the canine placenta (1% SDS, 5 mM EDTA + 0.05% Trypsin, 1% Triton X-100) and the tibial muscle of Wistar rats (freezing at - 20°C, 1% SDS , 5 mM EDTA + 50 mM Tris, 1% Triton X-100). The muscle injury was performed followed a 1 cm incision and divulsion in the middle region of the tibial muscle, where the dECM were implanted. A surgical group, without the implant, was used as a control. The animals were euthanized after 3, 15 and 45 days. Histological and immunohistochemistry analyses were performed to evaluate the tissue morphology and the presence of inflammatory infiltrate and cells in proliferation (CD163 and PCNA). On the 3rd day after implantation, an intense inflammatory reaction (CD163+) and cell proliferation (PCNA+) were observed, adjacent to the biomaterial, in both matrices. On 15th day, the placenta biomaterial still preserved the cellular infiltrate (CD163+ and PCNA+) and started the biomaterial absorption process, while the muscle biomaterial was already fully absorbed. Finally, after 45th day, both biomaterials were absorbed and the muscle was completely healed, without fibrosis. It was concluded that freezing samples at -20°C prior to processing and subjecting to the initial incubation in 1% SDS solution (Protocol 2B) favored the decellularization of murine skeletal muscle. In addition, xenogeneic and allogeneic dECM were resorbed and presented a distinct integration process in a non-critical model of skeletal muscle, suggesting that potential systemic changes, observed in the long term evaluation, as well as the validation of the use of these matrices in volumetric muscle loss models must be tested.

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.

Poucos estudos descrevem os aspectos histopatológicos da malária placentária em áreas de transmissão instável para Plasmodium vivax. Pretendemos identificar as alterações histopatológicas e suas intensidades, avaliar o impacto de fatores clínicos e epidemiológicos e a associação dos níveis de citocinas e anafilatoxinas relacionadas à malária placentária causada por Plasmodium vivax. Um estudo longitudinal foi realizado em Cruzeiro do Sul (Acre), com seleção de gestantes não infectadas e infectadas. A prevalência de malária placentária detectada por histologia foi de 13,5%. Não foram encontradas evidências microscópicas da adesão por P. vivax no sinciciotrofoblasto, porém esta espécie ocasionou danos placentários semelhantes aos observados na malária gestacional por P. falciparum, porém com intensidade menor do que a observada em áreas de alta transmissão. As alterações ocasionadas podem ser decorrentes de distúrbios locais e sistêmicos que contribuem para um desfecho desfavorável durante a malária gestacional e placentária ocasionadas por P. vivax. / Few studies describe histopathological aspects of placental malaria in unstable transmission areas for Plasmodium vivax. The objectives of the present work were to identify histopathological alterations and their intensities by assessing the impact of clinical and epidemiologic factors and the association of cytokines and anaphylatoxin levels related to gestational and placental malaria caused by the Plasmodium vivax. A longitudinal study was performed in Cruzeiro do Sul (Acre) by selecting non-infected and infected pregnant. No microscopic evidence of adhesion were found for that species in the syncytiotrophoblast, but this species cause similar placental damage to those seen in P. falciparum malaria, but with lower intensity than that observed in high transmission areas. Finally, the alterations caused in the placental environment can concomitantly result from local and systemic disturbances that jointly contribute to an unfavorable outcome upon the gestational and placental malaria caused by the P. vivax.

A Cannabis sativa, genericamente conhecida por maconha é uma das drogas ilícitas mais utilizadas no mundo. Por ser considerado inofensiva em alguns países seu uso recreativo é liberado, o que tem aumentado em grandes proporções do uso desta substância, incluindo mulheres gestantes. A gestação é um período em que ocorrem alterações dinâmicas fisiológicas consideráveis na mãe, placenta e feto e com isso, os processos de absorção, distribuição e eliminação de drogas utilizadas pode ser muito variável. O que torna a utilização de desta droga mais perigosa nesse período. Diversos desfechos gestacionais negativos estão associados a seu uso, porém pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nesta associação. Assim, neste estudo avaliamos experimentalmente utilizando um modelo animal, se os desfechos gestacionais negativos podem estar associados a alterações placentárias. Resumidamente, fêmeas gestantes de camundongos foram expostas a fumaça proveniente da queima da Cannabis diariamente durante a gestação via inalação, mimetizando o uso por humanos. No 18,5° dia da gestação (a termo) foram eutanasiadas e as placentas coletadas apara avaliação estereológica. Os resultados mostram que a o consumo da cannabis em baixa dose pode provocar alterações na estrutura da placenta. Há um aumento significativo em seu volume total decorrente do aumento no volume do labirinto, além disto o volume de capilares fetais está aumentados e a barreira inter-hemal fica mais fina. Estas alterações apesar de sugerirem um mecanismo compensatório, o crescimento fetal normal não é mantido / Cannabis sativa, commonly known as marijuana or pot, is one of the most used ilicit drug in the world. In some countries its recreational use is legal because this drug is not considered harmful to health. Legalization of its use has increased the number of users of this drug including pregnant women. Gestation is a period of physiological dynamic changes in the mother, fetus and placenta, thus the process of absorption, metabolism and excretion is different. Association between negative gestational and fetal outcomes and gestational exposure to marijuana is described in the medical literature, however little is known about the mechanisms involved. Taking this into account, in this study we investigated experimentally, using in a animal model that mimics human use, if the negative gestational outcomes could be associated to placental structural and functional changes. Briefly, pregnant mice were exposed during gestation to either filtered or marijuana smoke by inhalation and at gestational Day 18 (at term) they were euthanized and placentas collected for stereological analysis. Our preliminary results indicate that the use of cannabis sativa during pregnancy is associated to structural changes in the placenta. Placental total volume is increased and is due to increases in the volume of the labyrinth. In the labyrinth the volume of fetal capillaries and their surface area are increased and the interhemal membrane thickness decreased. These changes suggest a compensatory mechanism however, they fail to support the fetal normal growth.

O objetivo deste trabalho foi buscar genes MHC classe I em bovinos expressos durante o desenvolvimento embrionário e gestação que apresentassem similaridade ao gene Ped murino. Para tanto, embriões de PIV e placentas de fetos produzidos por monta natural ou clonados tiveram seu RNA extraído. A partir do RNA extraído foi realizada a produção de cDNA para tentar o isolamento de fragmentos com similaridade ao gene descrito em murinos. Uma vez isolados, os fragmentos foram purificados ou clonados em plasmídeo. As amostras foram seqüenciadas e as seqüências obtidas foram avaliadas, editadas e comparadas a outras seqüências pelo programa BLAST. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada em embriões (D7) e nas amostras de placenta utilizando anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC. A seqüência consenso obtida produziu alinhamentos significantes com os genes do complexo Bola que faz parte do MHC classe I bovino. O alinhamento entre a seqüência consenso e as seqüências de Q7 (Ped) e HLA-G publicados anteriormente demonstrou poucas variações de nucleotídeos entre as seqüências. As amplificações de cDNA de embriões que atingiram o quarto ciclo celular em até 48 hpi (R8) e em 48-90 hpi (L8) e de embriões que atingiram o estádio de blastocisto expandido em 7 dias de cultivo (RR) e em 9 dias de cultivo (RL) mostraram que o fragmento cuja seqüência apresenta alta similaridade ao gene Ped, está presente em embriões RR e RL, mas não em embriões no estádio de 8 células. Em placentas, o resultado da PCR mostrou a amplificação de oito fragmentos em diferentes fases da gestação. O sequenciamento dos fragmentos gerou nove seqüências consenso similares ao gene Ped e também a seqüências obtidas a partir de embriões bovinos. O alinhamento das seqüências mostrou a existência de duas isoformas contendo edição alternativa no exon 2 ou no exon 3. O resultado indicou a existência de polimorfismo ou mais de um gene com alta similaridade ao gene Q7 sendo transcritos durante o período gestacional. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada na membrana de células do trofoblasto e da MCI de embriões e na porção materno fetal de placentas, com uma maior expressão na porção fetal. Placentas oriundas de fetos clonados apresentam maior fluorescência comparada àquelas oriundas de monta natural. Este trabalho identificou, em embriões bovinos, um possível gene homólogo ao Ped murino e a expressão de proteína semelhante àquela codificada por este gene e conclui que existem vários transcritos com similaridade ao gene Q7 sendo expressos na região materno-fetal da placenta, durante a gestação em bovinos, assim como nos embriões / The aim of the present work was to identify bovine MHC class I genes similar to the murine Ped gene expressing during embryonic development and pregnancy. Bovine in vitro produced embryos and placentas obtained from natural mating or cloning-derived fetuses had their RNA extracted. cDNA was synthesized to isolate fragments showing similarity with the gene described in mice. Once isolated the fragments were purified or cloned into plasmids. The samples were sequenced and obtained sequences edited and compared to other sequences by means of the BLAST software. The expression of MHC-Ib protein was evaluated in embryos (D7) and in placentas using a FITC conjugated mouse monoclonal antibody anti-Qa-2. The consensus sequence amplified from blastocyst cDNA produced significant alignments with genes of the Bola complex, which is part of the bovine MHC class I. The alignment between the consensus sequence and the previously published Q7 and HLA-G sequences demonstrated little nucleotide variations among the sequences. The cDNA amplifications of embryos at the fourth cellular cicle in 48hpi (F8); 48-90hpi (S8) and embryos that reached blastocyst expanded stage in 7 days (FF); in 9 days (FS) showed that the Ped candidate gene is present in FF and FS but not in 8-cell embryos. In placentas, the PCR resulted in amplification of eight fragments at different pregnancy stages. Sequencing of the fragments generated nine consensus sequences, similar to the Ped gene and also to sequences obtained from bovine embryos. The alignment of the sequences showed the existence of two isoforms containing an alternative splicing on exon 2 or 3. This result indicates the existence of polymorphisms or that more than one gene with high similarity to the Q7 gene are transcribed during pregnancy. Expression of MHC-Ib protein was verified in trophoblast membrane and embryos inner cell mass cells and in the maternal-fetal portion in placentas, with a greater expression in the fetal portion. Cloned fetuses placentas presented grater fluorescence compared to natural mated. Overall this work identified in bovine embryos a possible gene homologous to the murine Ped and the expression of protein similar to that coded by this gene and concluded that there are many transcripts similar to the Q7 gene being expressed in the maternal-fetal region of the placenta during pregnancy in bovine and such as in embryos

O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

Linfócitos e macrófagos são os principais tipos de leucócitos envolvidos no processo de tolerância materno-fetal. Os linfócitos são divididos em sub-populações de acordo com sua função e fenótipo, apesar de serem morfologicamente semelhantes. Seus tipos incluem os linfócitos T, linfócitos B e natural killers (NK). Macrófagos são células que derivam da migração dos monócitos sangüíneos para o tecido. Na placenta, os macrófagos desempenham um papel importante na regulação da apoptose, prejudicial para o desenvolvimento do embrião, e no processo de apresentação antigênica. Pouco se sabe sobre esses leucócitos na placenta bovina, como sua quantidade e onde estão presentes. Desta maneira, este trabalho tem por objetivo principal identificar as populações de linfócitos e macrófagos presentes na placenta bovina utilizando marcadores específicos e citometria de fluxo. Neste estudo, foram utilizados amostras de placentônios e região intercaruncular de vacas nos três diferentes trimestres da gestação (cinco animais de cada trimestre). As suspensões celulares obtidas foram incubadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD8, anti-(CD14), e anti-CD335 (uNK) e avaliados pela citometria de fluxo. No placentônio, no primeiro trimestre da gestação, a porcentagem média de células marcadas CD3+ foi de 2,37%, CD8+, 2,39%, CD14+, 1,16% e CD335+, 0,78%. Para a região intercaruncular, a porcentagem de células CD3+ foi 3,43%, 4,41% CD8+, CD14+ 3,91% e CD335+ 0,56%. No segundo trimestre gestacional, o placentônio apresentou 0,63% de células positivas para CD3+, 0,62% para CD8+, 0,34% para CD14+ e 0,55% para CD335+. Na região interplacentomal a porcentagem de células marcadas com CD3+ foi 1,59%, 1,25% para CD8+, 0,38% para CD14+ e 0,39% para CD335+. No terceiro trimestre gestacional, o placentônio apresentou 0,72% de células marcadas para CD3+, 0,75% para CD8+, 1,05% para CD14+ e 0,77% para CD335+. Na região interplacentomal a porcentagem de células marcadas para CD3+ foi 1,59%, 1,50% para CD8+, 0,60% para CD14+ e 0,48% para CD335+. Com base nos resultados apresentados, podemos concluir que a população de leucócitos na 11 placenta bovina é menos numerosa quando comparada às outras espécies como camundongos e humanos, provavelmente pelo tipo de placenta sinepiteliocorial que constitui uma barreira significativa para o sistema imunológico materno, diminuindo drasticamente a exposição do concepto a ele. / Lymphocytes and macrophages are the main types of leukocytes involved in the maternal-fetal process of tolerance. Lymphocytes may be divided in subpopulations according to their function and phenotype, although being morphologically similar. Its types include the T lymphocyte, B lymphocyte and natural killers (NK). Macrophages are cells that derive from the migration of blood monocytes to the tissue. In the placenta, macrophages play an important role in the regulation of apoptosis which is deleterious to the development of the embryo and in the process of antigen presentation. There are very few references regarding the presence and quantity of leukocytes in the bovine placenta, therefore this project aims to identify lymphocytes and macrophages populations in the bovine placenta by using specific markers and flow cytometry. In this study placentomes and interplacentomal regions of cows in the three trimesters of pregnancy (five animals of each trimester) were used. Cells were incubated with the following monoclonal antibodies: anti-CD3, anti-CD8, anti-CD14,) and anti-CD335 (uNK) and evaluated by flow cytometry. In the first trimester of pregnancy, for the placentome, the average percentage of cells marked CD3+ was 2.37%, CD8+ 2.39%, , CD14+ 1.16% and CD335+ 0.78%. For the interplacentomal region the percentage of CD3+ was 3.43%, CD8+ 4.41%, CD14+ 3.91%, and CD335+ 0.56%. In second trimester of pregnancy, the placentome presented 0.63% of cells marked with CD3+, 0.62% of CD8+, 0.34% of CD14+ and 0.55% of CD335+. In the interplacentomal region the percentage of cells marked with CD3+ was of 1.59%, 1.25% of CD8+, 0.38% of CD14% and 0.39% of CD335+. In the third trimester of pregnancy, the placentomes had presented 0.72% of cells marked with CD3+, 0.75% of CD8+, 1.05% of CD14+ and 0.77% of CD335+. In the interplacentomal region the percentage of cells marked with CD3+ was of 1.59%, 1.50% of CD8+, 0.60% of CD14+ and 0.48% of CD335+. Based on the presented results, we can conclude that the leukocytes population in the bovine placenta is less 13 numerous than those described for other species like mouse and human, probably because it is a sinepithelial type placenta that constitutes a significant barrier to the maternal immunological system, diminishing drastically the conceptus antigen exposition to it.

Os bovinos são considerados a maior fonte de proteína animal para o homem, razão pela qual se fazem imprescindíveis pesquisas em diversas áreas de produção desses animais com o intuito de minimizar problemas que possam interferir no desenvolvimento e produtividade dos rebanhos. Nesse cenário, o estudo da placenta e placentação tem por objetivo conhecer o desenvolvimento embrionário e suas interações fisiológicas entre o feto e o organismo materno, caracterizado pela íntima união entre eles. O estudo da placenta e placentação tem por objetivo conhecer o desenvolvimento embrionário e suas interações fisiológicas entre o feto e o organismo materno, caracterizado pela íntima união entre eles. Além disso, a falta de marcadores específicos para células placentárias bovinas e as alterações que essas células sofrem durante o progresso da gestação são as principais barreiras para a determinação do perfil morfológico celular presente na interface materno-fetal, razão pela qual seu monitoramento torna-se importante. Buscando melhor compreender essas mudanças, o presente trabalho estudou a dinâmica populacional de células de placenta bovina a fresco e em cultivo. Foram utilizadas 30 amostras de placentônios, divididos em três grupos, de acordo com o desenvolvimento da gestação, quais sejam: primeiro, segundo e terceiro trimestres (n:10 para cada terço). Células oriundas de placentônios foram examinadas a fresco e pós-cultivo durante dez dias, pela microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e citometria de fluxo. Os resultados deste trabalho demonstraram a presença de tipos morfológicos celulares distintos na dependência do progresso da gestação: células gigantes trofoblásticas binucleadas, células gigantes trofoblásticas trinucleadas, células gigantes trofoblásticas mononucleadas, células mononucleadas maiores, células mononucleadas menores e células que apresentam citoplasma amplo, contendo inúmeras vesículas em seu interior. Com a utilização da citometria de fluxo, foi possível identificar nas amostras a fresco três populações distintas em tamanho (FSC) e complexidade (SSC) no primeiro terço, cinco populações no segundo terço e duas populações no terceiro terço gestacional. As células placentárias bovinas apresentaram freqüências variáveis de acordo com o trimestre gestacional e seu tempo de cultivo. / There is a great diversity of cell types in the bovine placenta like mononucleate trophoblast giant cells, binucleate trophoblast giant cells, specialized leucocytes (uterine natural killer, uterine macrophages, etc.) and part of their characterization and function remains unknown or controversial. Besides that, some of these cells change as pregnancy progresses; thus their monitoring is very important. The lack of specific markers to bovine placental cells is a main barrier for the development of an efficient cell tracing. Alternative techniques are being used to study these cells, as well as morphologic observation by optical and electron microscopy methods. The study was carried out to establish a populational kinetics of fresh and cultured bovine placental cells by optical microscopy, by electron microscopy and flow cytometry. Bovine placentomas were sampled at the slaughterhouse from cows with different trimesters of pregnancy (n:10 each). Fragments from the cotiledonary/caruncular interface were collected and cells were mechanically dissociated and their viability was estimated by Trypan Blue exclusion. After that they were incubated (2,5x107 cells per 2 mL) in Dulbecco´s Modified Eagle Medium with 10% FBS. First of all, fresh bovine placental cells analyzed by flow cytometry in order to identity the profiles of populational cells. At the same time, smear of fresh cells was made, fixed by methanol, stained with Giemsa for optical microscopy morphologic analisys and differential counting. After this, cells were analised by flow cytometry and optical microscopy .This process was repeated on the first, fifth and tenth days of the culture. We found seven types of cell: mononucleate trophoblast giant cells, binucleate trophoblast giant cells, trinucleate trophoblast giant cells, large mononucleate cells and small mononucleate cells. The placental cells displayed different frequencies according to the gestation period and culture time length.

As regiões organizadoras de nucléolos (Nucleolar Organizer Regions - NORs) são regiões de cromatina levemente corada em volta da qual, no final da telófase, o nucléolo é novamente formado após a mitose. Um grupo peculiar de proteínas ácidas que têm alta afinidade por prata são localizadas nos mesmos locais que as NORs, o que confere as mesmas a propriedade de serem clara e rapidamente visualizadas por colorações que utilizam nitrato de prata. As NORs, quando coradas por prata são chamadas de AgNORs. O número de AgNORs está estritamente relacionado com a atividade transcricional do RNAr e com a agilidade e rapidez da proliferação celular. A homeostase celular utiliza-se de mecanismos através dos quais os tecidos de um organismo mantêm-se ou renovam-se, e para que isso ocorra, as células dispõe de dois programas genéticos principais: o ciclo celular e a apoptose. Considerando o crescimento da placenta e consequentemente das células trofoblásticas mono e binucleadas, esse trabalho teve dois principais objetivos: 1. determinar a relação quantitativa entre a proliferação celular e o estágio da gestação através da quantificação das AgNORs utilizadas como marcadores em placentas bovinas, evidenciando a intensa atividade proliferativa e metabólica das células binucleadas e estabelecendo o padrão de normalidade para gestações bovinas; e 2. determinar a ploidia das células do placentônio bovino e, através da análise dos estágios do ciclo celular, estabelecer a cinética celular envolvida na formação e diferenciação das células trofoblásticas binucleadas. Houve um aumento da quantidade de AgNORs nas células trofoblásticas mononucleadas a medida em que a gestação avançou, principalmente no terceiro trimestre de gestação. Isso indica um aumento na atividade proliferativa e/ou metabólica dessas células. O número de AgNORs expresso pela células binucleadas apenas aumentou do primeiro para o segundo trimestre, permanecendo, após esse estágio, praticamente constante. Isso nos leva a crer que a atividade das células binucleadas atinge seu ponto máximo no segundo trimestre e permanece com o seu metabolismo alto até o final da gestação. Além disso, esse número foi extremamente maior do que o observado nas células trofoblásticas mononucleadas, evidenciando a intensa atividade metabólica dessa célula. Na análise do ciclo celular, dois tipos celulares diferiam quanto ao seu tamanho (área) e quanto a sua granulosidade no placentônio, caracterizando diferenças quanto sua ploidia, sendo uma população diplóide e a outra tetraplóide. Para a fase G0-G1, a porcentagem obtida para o primeiro trimestre foi significativamente maior quanto comparada com o segundo e com o terceiro trimestre. Para a fase G2-M, encontramos um padrão inverso ao observado na fase G0-G1. Assim, podemos concluir que no primeiro trimestre de gestação as células tetraplóides estão formadas, mas não diferenciadas. A medida em que a gestação avança e a demanda metabólica fetal aumenta, essas células entram em processo de diferenciação para sua completa transformação em células capazes de produzir diversas substâncias e suprir as necessidades gestacionais maternas e fetais. / Nucleolar Organizer Regions (NORs) are weakly stained chromatin regions around which nucleoli reform after mitosis. A group of highly argyrophilic proteins are localized at the same sites as NORs, allowing NORs to be very clearly and rapidly visualized by silver nitrate staining procedures. They are called AgNORs. The number of AgNORs is strictly related to rRNA transcriptional activity and to the rapidity of cell proliferation. Cellular homeostasis uses two mechanisms to maintain or renew all tissues in organisms: the cell cycle and apoptosis. To comprehend the growth and the maturation of several tissues it is important to understand proliferation cellular kinetics and the cell cycle. The aim of this study was to evaluate the functional activity relation between the proliferative and metabolic capacity of trophoblastic mononucleate and binucleate cells from bovine placentomes at different stages of pregnancy. In addition, this study determined the ploidy and established the cellular kinetics involved in cell formation and differentiation through cell cycle analysis. The results demonstrated that: 1. The AgNOR number of mononucleate trophoblastic cells is related to their proliferative activity and stage of pregnancy; 2. The AgNOR number of binucleate trophoblastic cells is related to their level of metabolic activity and stage of pregnancy; 3. The AgNOR number of binucleate cell was just derived metabolic activity, and not proliferative activity, differing to mononucleate cells; 4. The AgNOR number was much greater in binucleate cells than in mononucleate cells, evidencing that the metabolism of binucleate cells was much higher than that of mononucleate cells; 5. Two cell populations form the bovine placentome: one is diploid cells and the other tetraploid; and 6. In the first trimester, the majority of tetraploid cells are not differentiated; with the progress of pregnancy and the increase in metabolic demands of fetus, the tetraploid cells begin a differentiation process and become cells that are able to supply maternal and fetal needs. These parameters could be applied to investigations about placental abnormalities due to pathologies or gestations derived from manipulated embryos.