Rapid Alkalinization Factor (RALF) pertence a uma crescente família de peptídeos com características hormonais em plantas. Inicialmente isolado de folhas de plantas de tabaco, peptídeos RALF podem ser encontrados em todo reino vegetal e são expressos em plantas ubiquamente. Plantas de cana-de-açúcar apresentam quatro isoformas dos genes SacRALF e foi identificado que o gene SacRALF1 é expresso predominantemente. Transcritos de SacRALF1 são abundantes nas zonas de elongação de pontas de raízes, e todos os quatro genes SacRALF são mais expressos em folhas jovens e em expansão do que em folhas expandidas. Nos limbos foliares, transcritos dos genes SacRALF foram encontrados em alta concentração na parte basal da folha e baixa concentração na porção apical. O conjunto das análises de expressão gênica neste estudo sugerem que a expressam dos genes SacRALF está localizada nas zonas de elongação de raízes e folhas. Folhas maduras, que são desprovidas de células em elongação, não mostraram expressão considerável dos genes SacRALF. Culturas de suspensão celular embriogênica de cana-de-açúcar mostraram um nível constitutivo de transcritos de genes SacRALF. O peptídeo SacRALF1 foi adicionado ao meio de cultura e inibiu o crescimento de microcalli derivado de culturas de suspensão celular em concentrações tão baixas quanto 0,1 µM. Microcalli expostos ao SacRALF1 exógeno mostraram um número reduzido de células elongadas. Os resultados obtidos sugerem que os peptídeos RALF possuem uma função no desenvolvimento de plantas, particularmente na elongação celular. / Rapid Alkalinization Factor (RALF) is part of a growing family of peptides with hormone characteristics in plants. Initially isolated from leaves of tobacco plants, RALF peptides can be found throughout the plant kingdom and they are expressed in plants ubiquitously. Sugarcane plants have four isoforms of SacRALF genes and SacRALF1 isoform is expressed predominantly. SacRALF1 transcripts are abundant in the elongation zone of root tips and all four SacRALF genes are more expressed in young and expanding leaves than in expanded leaves. In leaf blades, SacRALF gene transcripts were found at high levels at the basal portion of the leaf and at low levels at the apical portion. The whole set of gene expression analyses showed in this study, suggest that SacRALF genes expression is localized in elongation zones of roots and leaves. Mature leaves that are devoid of elongating cells do not show considerable expression of SacRALF genes. Sugarcane embryogenic cell suspension cultures showed a nearly constitutive level of SacRALF gene transcripts. SacRALF1 peptide was added to culture media and inhibited the growth of microcalli derived from cell suspension cultures at concentrations as low as 0.1 µM. Microcalli exposed to exogenous SacRALF1 showed a reduced number of elongated cells. The findings suggest that RALF peptides have a role in plant development, particularly in cell elongation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-01Bitstream added on 2014-06-13T20:24:22Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_azl_dr_rcla.pdf: 1708787 bytes, checksum: b3a9a5f321c84fbef694ca3153961530 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho vinte de cinco linhagens de basidiomicetos, estocadas na coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, foram avaliadas com relação aos seus potenciais de produção de enzimas ligninolíticas. A finalidade dessas enzimas é complementar um preparado enzimático (contendo xilanases e celulases) para ser aplicado em dietas de ruminantes. A produção das enzimas nos resíduos/subprodutos farelo de trigo, farelo de algodão, polpa cítrica e bagaço de cevada foi considerável. Farelo de trigo e bagaço de cevada proporcionaram as melhores quantidades da enzima lacase. O fungo Coriolopsis byrsina produziu altos níveis de lacase extracelular, com baixa atividade de celulase. A atividade de feruloil esterase foi detectada no extrato enzimático bruto desse mesmo fungo quando cultivado em bagaço de cevada. A lacase foi estável até 60 °C por 1 hora, apresentando duas temperaturas ótimas, a 40 e 55 °C. Foi estável em ampla faixa de pH (4,0 – 8,0), apresentando pH ótimo 4,5 e mantendo 20% de sua atividade em pH 7,0. Além disso, apresentou 30% da sua atividade após 6 horas de incubação nas condições do ambiente ruminal. O tratamento das fibras vegetais com o extrato enzimático bruto de C. byrsina (alta atividade de lacase) misturado com o extrato enzimático bruto Trichoderma reesei (celulase + xilanase) melhorou o percentual de hidrólise, disponibilizando os carboidratos fermentáveis para posterior fermentação ruminal. A digestibilidade in vitro por produção de gases apresentou aumento significativo em todos os alimentos (forragens) avaliados / At the present research work twenty five basidiomycete strains kept in the colection of microrganisms in the Processing Biochemistry and Applied Microbiology laboratory at IBILCE were evaluated according to their ligninolytic enzymes production potential. The objective of these enzymes would be to complement an enzymatic mix (containing xylanases and cellulases) to be added to ruminants diets. The enzyme production in the byproducts like wheat bran, cotton bran, citrus pulp and brewer’s spent grain were considerably high. The wheat bran and the brewer’s spent grain presented the highest quantity of laccase. The fungal Coriolopsis byrsina produced high levels of extracellular laccase with low cellulose activity. The feruloyl esterase activity was detected in the crude enzyme of the same fungal when cultivated in brewer’s spent grain. Laccase was stable at 60 °C for 1 hour, presenting two optimal temperature at 40 and 55 °C. It was stable at (4.0 – 8.0) pH range, presenting optimal pH at 4.5 and keeping 20% of its activity at pH 7.0. Besides that, it presented 30% of its activity after 6 hours of incubation under ruminal conditions. The vegetable fiber treatment with C. byrsina crude enzyme (laccase high activity) mixed to Trichoderma reesei crude enzyme (cellulose + xylanase) improved the hydrolysis percentage releasing sugars for further ruminal fermentation. In vitro gas production digestibility showed significant increase in various crops

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Regina Teresa Rosim Monteiro / Banca: João Claudio Thomeo / Banca: Ricardo Andrade Reis / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Resumo: No presente trabalho vinte de cinco linhagens de basidiomicetos, estocadas na coleção de microrganismos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada, foram avaliadas com relação aos seus potenciais de produção de enzimas ligninolíticas. A finalidade dessas enzimas é complementar um preparado enzimático (contendo xilanases e celulases) para ser aplicado em dietas de ruminantes. A produção das enzimas nos resíduos/subprodutos farelo de trigo, farelo de algodão, polpa cítrica e bagaço de cevada foi considerável. Farelo de trigo e bagaço de cevada proporcionaram as melhores quantidades da enzima lacase. O fungo Coriolopsis byrsina produziu altos níveis de lacase extracelular, com baixa atividade de celulase. A atividade de feruloil esterase foi detectada no extrato enzimático bruto desse mesmo fungo quando cultivado em bagaço de cevada. A lacase foi estável até 60 °C por 1 hora, apresentando duas temperaturas ótimas, a 40 e 55 °C. Foi estável em ampla faixa de pH (4,0 - 8,0), apresentando pH ótimo 4,5 e mantendo 20% de sua atividade em pH 7,0. Além disso, apresentou 30% da sua atividade após 6 horas de incubação nas condições do ambiente ruminal. O tratamento das fibras vegetais com o extrato enzimático bruto de C. byrsina (alta atividade de lacase) misturado com o extrato enzimático bruto Trichoderma reesei (celulase + xilanase) melhorou o percentual de hidrólise, disponibilizando os carboidratos fermentáveis para posterior fermentação ruminal. A digestibilidade in vitro por produção de gases apresentou aumento significativo em todos os alimentos (forragens) avaliados / Abstract: At the present research work twenty five basidiomycete strains kept in the colection of microrganisms in the Processing Biochemistry and Applied Microbiology laboratory at IBILCE were evaluated according to their ligninolytic enzymes production potential. The objective of these enzymes would be to complement an enzymatic mix (containing xylanases and cellulases) to be added to ruminants diets. The enzyme production in the byproducts like wheat bran, cotton bran, citrus pulp and brewer's spent grain were considerably high. The wheat bran and the brewer's spent grain presented the highest quantity of laccase. The fungal Coriolopsis byrsina produced high levels of extracellular laccase with low cellulose activity. The feruloyl esterase activity was detected in the crude enzyme of the same fungal when cultivated in brewer's spent grain. Laccase was stable at 60 °C for 1 hour, presenting two optimal temperature at 40 and 55 °C. It was stable at (4.0 - 8.0) pH range, presenting optimal pH at 4.5 and keeping 20% of its activity at pH 7.0. Besides that, it presented 30% of its activity after 6 hours of incubation under ruminal conditions. The vegetable fiber treatment with C. byrsina crude enzyme (laccase high activity) mixed to Trichoderma reesei crude enzyme (cellulose + xylanase) improved the hydrolysis percentage releasing sugars for further ruminal fermentation. In vitro gas production digestibility showed significant increase in various crops / Doutor

O etanol celulósico a partir da palhada de cana pode elevar a produção do bioetanol, porém esta é normalmente decomposta no campo. A degradação da parede celular no campo não foi elucidada e compreender este processo auxiliará na produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a degradação da palhada de cana de açúcar no campo durante um ano. Foi analisada a composição da parede celular por fracionamento e composição dos monossacarídeos. Na parede celular, observou-se redução de 26% no teor de celulose enquanto houve aumento de 13% na fração de hemiceluloses mais solúveis. Mudanças na composição dos monossacarídeos das frações mostraram que o arabinoxilano (AX) foi o primeiro polímero a ser solubilizado (após 3 meses) seguido dos <font face=\"Symbol\">b-glucanos e celulose (após 6 meses). Isto sugere que o AX é a hemicelulose mais exposta e sua solubilização permitiu a degradação da celulose após 6 meses. A partir dos dados obtidos, sugeriu-se a utilização de xilanases seguidas de glucanases numa possível ordem de enzimas para produção de etanol celulósico. / The sugarcane straw cellulosic ethanol can increase bioethanol production, but the straw is usually degraded in the field. However, the process that leads the cell wall disassembly under field conditions is unknown and understanding how this happens can improve cellulosic ethanol production. In the present work we aimed at studying how sugarcane straw is degraded in the field during a year. Cell wall composition was determined by fractioning and determination of monosaccharide composition. Results showed a decrease (ca.26%) in cellulose content and an increase of 13% in high solubility hemicelluloses fraction. Changes in monosaccharide composition showed that the first polymer to be solubilised is the arabinoxylan (AX) (after 3 months) followed by <font face=\"Symbol\">b-glucans and cellulose (after 6 months). This suggests that AX is the most exposed hemicelullose and its solubilisation allowed cellulose degradation after 6 months. Our data suggest the use of xylanases followed by glucanases as an enzyme order to be used in cellulosic ethanol production from sugarcane straw.

As paredes celulares vegetais são estruturas essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Além das suas diversas funções biológicas, os componentes polissacarídicos constituintes das paredes celulares (celulose, hemiceluloses e pectinas) são de vital importância como fonte natural de fibras para a nutrição humana e animal e são considerados os principais recursos renováveis do planeta, utilizados como matéria-prima para diversos processos industriais, por exemplo nos processos de produção de polpa celulósica. Todos esses fatores têm despertado grande interesse no estudo da composição e biossíntese das paredes celulares. A biossíntese dos seus polímeros se inicia no citoplasma das células, onde ocorre a formação dos precursores por uma rota metabólica complexa de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. O entendimento da regulação dessa rota metabólica é fundamental para modular a dinâmica de biossíntese desses açúcares e assim tentar manipular as propriedades bioquímicas das paredes celulares. Nesse contexto, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da superexpressão do gene miox2 de Arabidopsis thaliana em plantas de Nicotiana tabacum. O produto desse gene é a enzima mio-inositol oxigenase (E.C. 1.13.99.1), cuja função é converter o mio-inositol em ácido D-glucurônico, composto central da rota de biossíntese de açúcares-nucleotídeo. Foram determinadas quatro isoformas tecido-específicas para o gene miox (miox1, miox2, miox4 e miox5) em Arabidopsis, sendo que a isoforma miox2 é a predominante em caules. Esse gene foi clonado em trabalhos anteriores realizados no laboratório e no presente trabalho, o cDNA do gene miox2 foi superexpresso em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) a fim de se avaliar o efeito da superexpressão na composição de carboidratos de parede celular secundária. As linhagens de plantas transgênicas obtidas, não mostraram diferenças visualmente perceptíveis em comparação aos controles, indicando ausência de alterações fisiológicas e morfológicas. Foram quantificados os monossacarídeos de paredes celulares secundárias (arabinose, ramnose, galactose, glicose, xilose, manose), os ácidos urônicos (ácido galacturônico e glucurônico) e as ligninas (solúvel e insolúvel), a partir de tecido xilemático e parênquima medular do caule. A ausência de modificações significativas nas proporções desses metabólitos, indica que as plantas exercem um estrito controle na regulação da biossíntese de paredes celulares secundárias de forma que a superexpressão do gene miox2 não provocou nenhuma alteração altamente significativa. Outros genes candidatos e os mecanismos envolvidos na sua regulação deverão ser testados quanto ao nível de transcrição, modificações pós-trancricionais e pós-traducionais a fim de entender a regulação do fluxo de carbono para a biossíntese de paredes celulares. / Cell-walls are essential structures for plant development and growth. Apart from its biological functions, the polyssacharides that make cell-walls (cellulose, hemicellulose and pectins) are the principal natural fibrous materials used for human and animal nutrition. They are also considered the most important renewable resource on earth and their use as industrial raw material is inevitable. An example is the use of wood in the production of pulp and paper. For all these reasons, the study of molecular composition and biosynthesis of plant cell-walls has been a matter of great interest for researchers over the past few years. Cell-wall polyssacharides biosynthesis begins at the cytoplasm, where a pool of UDP-glucose and other activated sugar nucleotide precursors are generated by multiple and complex interconvertion reactions. Understanding how cells control the metabolic pathways responsible for sugar nucleotide precursors synthesis, would be a primary requirement for manipulating them in an attempt to generate plants with improved properties for human use. In that context, tha aim of this research work was to analyze the effects of Arabidopsis thaliana miox2 gene overexpression in a plant model system (Nicotiana tabacum). The product of miox2 gene is myo-inositol oxygenase enzyme 2 (E.C.1.13.99.1) which converts D-glucuronic acid, an important sugar nucleotide precursor, from its substrate myo-inositol. Four isoforms of miox gene, with apparent tissue specific expression (miox1, miox2, miox4 and miox5) were already determined, but miox2 is the one primarily expressed in stems. Its cDNA was cloned from Arabidopsis thaliana in previous works and overexpressed in tobacco plants. Five normal transgenic lines were obtained, showing no phenotypically differences relative to the control line. This fact implied that miox2 overexpression did not alter any physiological nor morphological aspect of plant development. The cell-wall monossacharides (arabinose, rhamnose, galactose, glucose, xylose and mannose), uronic acids (galacturonic and glucuronic acid) and lignins (soluble and insoluble) from stem xylem and parenchymal tissue were quantified. The absence of major changes in any of the compounds measured for the transgenic lines indicated that they were able to adjust their level of carbohydrate composition. Plants seem to regulate the proportions of sugar nucleotide precursors through highly complex metabolic pathways that establish strong compensatory mechanisms. It will be necessary to study other candidate genes and some aspects of their regulation at transcriptional, postranscriptional and postransaltional level, as an attempt to understand the cell-wall carbohydrate flux.

O alumínio é limitante à atividade agrícola em todo o mundo. Nos solos ácidos a disponibilidade de Al aumenta. Estes solos constituem a maioria dos solos do mundo e dois terços dos solos brasileiros. O problema da acidez do solo e da toxicidade por Al é altamente significativo para as perdas na produtividade agrícola e florestal. Para se ter Al disponível, primeiramente tem que se ter condições de pH baixo. O primeiro sintoma causado pela toxicidade por Al é a inibição no alongamento do sistema radicular. Existem trabalhos vinculando a inibição a alterações nos processos de divisão e expansão celular. Embora os mecanismos de toxicidade e resistência ao Al não estejam totalmente elucidados, admite-se que em algumas plantas, a quelação do Al por ácidos orgânicos é um dos mecanismos que confere resistência das células ao Al, assim como em outras plantas a elevação do pH da rizosfera, por compostos liberados pelo sistema radicular, atua na queda da disponibilidade do Al na solução do solo. Porém, existem outras alternativas que vêm sendo propostas na literatura como possíveis mecanismos de resistência das plantas ao Al, principalmente ao nível celular e molecular. Alterações nas composições lipídica e protéica da membrana plasmática, assim como na sua estrutura física; ativação do sistema antioxidante celular; alterações na sinalização celular e de atividade dos canais de troca da membrana plasmática vêm sendo estudados como possíveis contribuintes para os mecanismos de resistência ao Al. A sensibilidade celular ao Al depende do seu estágio de desenvolvimento. As células sensíveis ao Al acumulam o metal, enquanto que as resistentes acumulam muito pouco. Foi constatado em nosso trabalho que as células sensíveis ao Al também são sensíveis ao baixo pH. As células sensíveis não conseguem recuperar seu crescimento e sua viabilidade celular após a exposição ao Al ou ao baixo pH.A sacarose ou manitol conferiram proteção às células quanto ao acúmulo de Al. Isso fez com que a viabilidade mantivesse-se em níveis próximos ao controle (pH5,6) e a cultura conseguisse recuperar seu crescimento e viabilidade após a exposição ao Al e ao baixo pH. O efeito protetor não foi devido ao caráter energético da sacarose, pois o manitol não é metabolizado pelas células BY-2 e os resultados foram semelhantes quando se usou sacarose ou manitol, nas mesmas concentrações. Sabe-se que o Al aumenta a peroxidação lipídica e a oxidação protéica da membrana plasmática, pela geração de EAO?s, desencadeando o processo de estresse oxidativo na célula. Em nosso estudo, nas células sensíveis houve peroxidação dos lipídios, ativação do sistema de enzimas antioxidantes, como SOD, GST, GR, CAT e APX, alteração nos níveis de carboidratos e alteração no perfil protéico de frações enriquecidas de membrana plasmática, obtido por eletroforese 2D. O mesmo comportamento foi verificado em células sensíveis tratadas a baixo pH. Pode-se concluir que o sistema antioxidante celular foi ativado na presença de baixo pH ou Al, pela ocorrência de peroxidação lipídica, que gera maiores concentrações de H2O2 nas células sensíveis (fase log). E que existem diferenças no perfil protéico de células tratadas com Al em relação a células mantidas sob condições de cultivo, tanto em presença de spots como em expressão diferencial. Porém estas diferenças necessitam ser melhores exploradas. A peroxidação lipídica é um bom indicador da sensibilidade celular ao Al e ao baixo pH, assim como a ativação do sistema antioxidante e a geração do peróxido de hidrogênio. Poderiam ser realizados experimentos no tempo, medindo-se o acúmulo de Al e relacionando-o aos níveis de peroxidação lipídica, atividade das enzimas antioxidantes e geração do peróxido, para que pudéssemos indicar talvez um processo que se iniciasse antes que outro, ou mesmo que decaísse antes do outro. Assim como um monitoramento das condições de oxidação protéica na presença de Al. / Aluminum limits crop production in all over the world. In acid solis the Al disponibility is larger. Acid soils compose the major part of the brazillian soils. The problem of acidity and Al toxicity results in losses of productivity in agriculture and forestry. The first symptom of Al toxicity is inhibition of root growth. There is many studies that indicate relations between the inhibition of root growth and cell division and expansion alterations. The mechanisms of Al toxicity and resistance aren?t completely understood in plants. The resistance mechanism of Al chelation by organic acid is one of the mechanisms accept, like the elevation of the rizosphere pH by substances exsudated by the root system. Other possible mechanisms that are being mentionated are the alterations in plasma membrane composition and structure, antioxidant cell system activation, alterations in cell signal and alterations in the membrane channels activity. Aluminum cell sensibility depends of the status cellular. The cells that are sensible to Al, are in the log phase of growth and accumulate the metal, whereas the resistant cells do not accumulate and were in the stationary phase of growth. In our work, we observed that the sensible cells are sensible to low pH too. The sensible cells don?t recover their growth rate and cellular viability after the treatment exposition. Sucrose or mannitol confers cellular protection against the Al. The cellular viability was high (next to the control, pH5,6) and the cell culture recovery their growth and viability after the Al or low pH exposition. The protective effect don?t occurs in response to the energetic role of sucrose, because cells treated with mannitol showed the same results and the mannitol did not metabolizated by tobacco BY-2 cells. Al induces lipid peroxidation and protein oxidation in plasma membrane, by the ROS generation promoting the oxidative stress. We found that sensible Al cells showed lipid peroxidation, H2O2 generation, antioxidant enzymes activation (SOD, le carbohydrate levels and protein profile alterations by 2D electrophoresis. The same responses were observed in the pH sensible cells, at log phase of growth. This differences should be more explored. We concluded that the lipid peroxidation is an indicator of sensitivity to Al and low pH, like the antioxidant enzymes activities and the H2O2 generation. Studies should be done with the Al accumulated in time, measuring the activities of antioxidant system and the lipid peroxidation with the objective to indicated what process could start firstly

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

Rapid Alkalinization Factor (RALF) pertence a uma crescente família de peptídeos com características hormonais em plantas. Inicialmente isolado de folhas de plantas de tabaco, peptídeos RALF podem ser encontrados em todo reino vegetal e são expressos em plantas ubiquamente. Plantas de cana-de-açúcar apresentam quatro isoformas dos genes SacRALF e foi identificado que o gene SacRALF1 é expresso predominantemente. Transcritos de SacRALF1 são abundantes nas zonas de elongação de pontas de raízes, e todos os quatro genes SacRALF são mais expressos em folhas jovens e em expansão do que em folhas expandidas. Nos limbos foliares, transcritos dos genes SacRALF foram encontrados em alta concentração na parte basal da folha e baixa concentração na porção apical. O conjunto das análises de expressão gênica neste estudo sugerem que a expressam dos genes SacRALF está localizada nas zonas de elongação de raízes e folhas. Folhas maduras, que são desprovidas de células em elongação, não mostraram expressão considerável dos genes SacRALF. Culturas de suspensão celular embriogênica de cana-de-açúcar mostraram um nível constitutivo de transcritos de genes SacRALF. O peptídeo SacRALF1 foi adicionado ao meio de cultura e inibiu o crescimento de microcalli derivado de culturas de suspensão celular em concentrações tão baixas quanto 0,1 µM. Microcalli expostos ao SacRALF1 exógeno mostraram um número reduzido de células elongadas. Os resultados obtidos sugerem que os peptídeos RALF possuem uma função no desenvolvimento de plantas, particularmente na elongação celular. / Rapid Alkalinization Factor (RALF) is part of a growing family of peptides with hormone characteristics in plants. Initially isolated from leaves of tobacco plants, RALF peptides can be found throughout the plant kingdom and they are expressed in plants ubiquitously. Sugarcane plants have four isoforms of SacRALF genes and SacRALF1 isoform is expressed predominantly. SacRALF1 transcripts are abundant in the elongation zone of root tips and all four SacRALF genes are more expressed in young and expanding leaves than in expanded leaves. In leaf blades, SacRALF gene transcripts were found at high levels at the basal portion of the leaf and at low levels at the apical portion. The whole set of gene expression analyses showed in this study, suggest that SacRALF genes expression is localized in elongation zones of roots and leaves. Mature leaves that are devoid of elongating cells do not show considerable expression of SacRALF genes. Sugarcane embryogenic cell suspension cultures showed a nearly constitutive level of SacRALF gene transcripts. SacRALF1 peptide was added to culture media and inhibited the growth of microcalli derived from cell suspension cultures at concentrations as low as 0.1 µM. Microcalli exposed to exogenous SacRALF1 showed a reduced number of elongated cells. The findings suggest that RALF peptides have a role in plant development, particularly in cell elongation.

La formation du duramen est un processus physiologique clé impliqué dans la qualité du bois puisqu'il contribue notamment à sa durabilité naturelle. L'objectif de cette thèse est de comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la formation du duramen chez le douglas. L'étude a été menée aux niveaux phénotypiques, biochimiques et moléculaires sur plusieurs génotypes de douglas. Des études phénotypiques, il ressort que la proportion de duramen serait sous influence génétique et très peu environnementale, et que l'expansion du bois de coeur se déroule principalement en automne-hiver. Afin de caractériser la composition biochimique du bois, une nouvelle méthode a été développée. Elle repose sur la dissolution du bois dans des liquides ioniques, les solutions obtenues sont ensuite immuno-marquées à l'aide d'anticorps dirigés contre des épitopes de polymères pariétaux. Cette méthode a permis d'observer l'évolution, cerne par cerne, de la composition pariétale du bois de l'aubier externe au coeur du duramen. Certains polymères sont plus abondants dans l'aubier (arabinanes), tandis que d'autres dans le duramen (pectines, xylanes et galactanes). En parallèle, les gènes impliqués dans la formation du duramen ont été étudiés par RNA-Seq à partir de douglas appartenant à un seul génotype et abattus en hiver. Les résultats montrent que des gènes codant des facteurs de transcription, des protéines de défense, des enzymes de la voie de biosynthèse des phénylpropanoides et des enzymes impliquées dans le remodelage de la paroi sont surexprimés dans la zone de transition par rapport à l'aubier. Des hormones, l'éthylène et le jasmonate notamment, semblent jouer un rôle important dans la maturation de l'aubier. / The heartwood formation is a key physiological process involved in wood quality because it contributes to its natural durability. The goal of this thesis is to understand mechanisms involved in the heartwood formation in douglas fir. This study has been carried out at phenotypic, biochemical and molecular levels from several douglas-fir genotypes. Thanks to phenotypic analysis, we showed that heartwood proportion is probably under genetic control, and little influenced by the environment. In douglas fir, heartwood expansion mainly occurs during autumn and winter. To characterize the biochemical composition of wood, a new method has been developed. The method implies the wood dissolution in ionic liquid, the solution obtained are then analyzed by immunodetection with monoclonal antibodies against plant cell wall glycan epitopes. Thanks to this method, the wood cell wall composition has been studied, ring-by-ring, from the outer sapwood to the inner heartwood. Some polymers are more abundant in the sapwood (arabinans) while others in the heartwood (pectins, xylans and galactans). Then, genes involved in the heartwood formation have been studied by RNA-Seq from trees belonging to one genotype sampled during winter. Results show that genes encoding transcription factors, defence related proteins, enzymes involved in phenylpropanoid biosynthesis and plant cell wall modification are upregulated in transition zone compared to sapwood. Hormones, ethylene and jasmonate especially, seem to play an important role during sapwood maturation.

Le contrôle moléculaire du patterning au cours des processus développementaux est aujourd’hui bien décrit chez les organismes multicellulaires. A l’inverse, la contribution de la croissance dans l’émergence des patterns reste peu explorée, et est souvent réduite à un rôle passif. Au cours de cette thèse, j’ai étudié cette question en utilisant le méristème apical caulinaire (MAC) d’Arabidopsis comme modèle. Le méristème est un groupe de cellules en divisions situé à l’extrémité de toutes les tiges et les branches et qui génère tous les organes aériens de la plante selon un patron stéréotypé, aussi appelé phyllotaxie. Dans une première partie, j’ai étudié comment la croissance de la tige pouvait influencer le patron phyllotactique. Plus précisément, en découplant dépôt de la cellulose dans la paroi et l’orientation des microtubules, j’ai montré que le patron de phyllotaxie devenait bimodal en raison de l’induction d’une torsion lors de la croissance de la tige. Dans une seconde partie, j’ai analysé le lien entre forme du MAC et expression génétique. En particulier, j’ai pu corréler l’expression d’un gène maître : SHOOTMERISTEM LESS (STM) au degré de courbure dans le MAC. De plus, en utilisant des approches de micromécaniques, j’ai aussi pu montrer que l’expression de STM pouvait être induite par le patron de contraintes localement généré par la courbure. Pour finir, j’ai aussi étudié comment la taille du méristème influence la robustesse du pattern de phyllotaxie sur la tige en modulant la fréquence d’initiation des organes. L’ensemble de ce travail met ainsi en avant le rôle de la croissance dans le patterning, notamment via des mécanismes de rétrocontrôles géométriques et mécaniques. / The molecular mechanisms behind the emergence of patterns during developmental processes have been well described in multicellular organisms. However, the contribution of growth in patterning is still poorly understood; growth is often seen as a passive output of the activity of the patterning signals. In this PhD, I have studied the relation between growth and patterning using the shoot apical meristem of Arabidopsis as a model system. The meristem is a group of dividing cells located at the tip of every stems and branches that generates all the aerial organs of the plant following a typical spatio-temporal pattern also called phyllotaxis. In a first part, the influence of post-meristematic growth on phyllotaxis was assessed. More precisely, by uncoupling cellulose deposition from the orientation of the microtubule array, I showed that the resulting stem torsion induces the emergence of a new and robust bimodal phyllotactic pattern. In a second part, the relation between meristem shape and gene expression was analyzed. More precisely, I correlated the expression of a master regulatory gene: SHOOT MERISTEMLESS (STM) to tissue curvature in the boundary domain that separates the emerging organ from the meristem. Furthermore, I showed that STM expression can be induced by micromechanical perturbations thus suggesting that shape-derived mechanical stresses in the meristem boundary contribute to STM expression. Finally, I also studied how meristem size can influence the robustness of the pattern of phyllotaxis along the stem through a modulation of the frequency of organ initiation. Altogether, this work highlights the important contribution of growth in patterning, notably thanks to the existence of geometrical and mechanical feedbacks.