O plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado na medicina equina para o tratamento de lesões ósseas, articulares, tendíneas e ligamentares. No entanto o PRP deve ser preparado no momento de cada aplicação, pois seu tempo máximo de utilização após o preparo é de apenas oito horas. O objetivo deste estudo foi avaliar o resfriamento e criopreservação como métodos de armazenamento do PRP equino utilizando dois crioprotetores: dimetil sulfóxido (DMSO) e trealose, na tentativa de manter a viabilidade plaquetária após o armazenamento a baixas temperaturas. Duas amostras de PRP foram preparadas a partir da centrifugação do sangue de seis pôneis saudáveis e foram destinadas à criopreservação a -196º C ou ao resfriamento a 4º C. Cada amostra de PRP preparada foi dividida em quatro alíquotas: fresca, com DMSO, com trealose ou sem crioprotetor. As amostras frescas foram avaliadas quanto à contagem plaquetária, determinação do volume plaquetário médio (VPM), concentração plaquetária em relação ao sangue total e quantificação do fator de crescimento de transformação beta 1 (TGF-β1). As amostras criopreservadas e resfriadas ficaram armazenadas por 14 dias e foram então submetidas às mesmas análises laboratoriais. O número de plaquetas e concentração plaquetária foram similares entre as amostras frescas e resfriadas com ou sem crioprotetor, mas foram superiores nas amostras frescas em relação às amostras criopreservadas. Observou-se aumento do VPM em todas as amostras armazenadas, indicando que as plaquetas sofreram lesões durante o armazenamento. A liberação de TGF-β1 foi superior no PRP fresco em relação ao PRP resfriado ou criopreservado, não havendo diferença entre as amostras que continham ou não crioprotetores. A adição dos crioprotetores DMSO e trealose não impediu as lesões plaquetárias de armazenamento. Por outro lado, tanto as amostras resfriadas quanto as criopreservadas liberaram quantidades significativas de TGF-β1. / Platelet rich plasma (PRP) is used in equine medicine for treatment of bone, joint, tendon and ligament injuries. However the PRP must be prepared at the time of each application, since its maximum time of use after the preparation is only eight hours. The objective of this study was to evaluate cooling and cryopreservation of equine PRP as storage methods using two cryoprotectants: dimethyl sulfoxide (DMSO) and trehalose, in an attempt to maintain platelet viability after storage at low temperatures. Two PRP samples were prepared from the blood centrifugation of six healthy ponies and were intended for cryopreservation at -196 ° C or cooling at 4 ° C. Each prepared PRP sample was divided into four aliquots: fresh, DMSO, trehalose or without cryoprotectant. The fresh samples were evaluated for platelet count, determination of mean platelet volume (MVP), platelet concentration in relation to whole blood and quantification of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). The cryopreserved and cooled samples were stored for 14 days and then submitted to the same laboratory tests. The number of platelets and platelet concentrations were similar between fresh and cooled samples with or without cryoprotectant, but were higher in fresh samples than in cryopreserved samples. An increase in MPV was observed in all stored samples, indicating that platelets suffered lesions during storage. The release of TGF-β1 was higher in fresh PRP than in cold or cryopreserved PRP, with no difference between samples containing or not cryoprotectants. The addition of DMSO and trehalose cryoprotectants did not prevent platelet storage lesions. On the other hand, both the cooled and cryopreserved samples released significant amounts of TGF-β1.

Platelet-rich plasma (PRP) is an autogenous product obtained from whole blood, through one or two centrifugations process. The resulting small volume of plasma contains a high platelets numbers and their growth factors. The aim of this study was to evaluate different protocols to obtain PRP using the manual method according to their capacity to concentrate platelets, leukocytes and erythrocytes contamination and the correlation between platelet count and growth factor TGF-β1 levels in the PRP samples. Ten healthy horses with mean age of 7 years (± 2.39), weighing on average 500 kg (± 67.1) were used to evaluate seven protocols to obtain PRP. The protocols tested varied according to speed and time used on both centrifugations. The variables analyzed on the PRP samples were: platelet concentration, leukocytes and erythrocytes, TGF-β1 levels quantified by ELISA. No significant differences between protocols were observed regarding the ability to concentrate platelet and the levels of TGF-β1. However, protocol PI showed significantly more erythrocyte and leukocyte contamination in PRP samples than the other protocols, being considered an inadequate protocol for the volume of blood used in this experiment. The remaining protocols are suitable for extracting PRP. Although the PRP is an option of therapy in equine medicine, many gaps regarding their compliance must still be met. / O plasma rico em plaquetas (PRP) é obtido a partir do sangue total, através de uma ou duas centrifugações, resultando em um pequeno volume de plasma com elevado número de plaquetas contendo fatores de crescimento. O objetivo do presente estudo foi avaliar diferentes protocolos para obtenção de PRP através do método manual quanto à capacidade de concentração das plaquetas, contaminação com leucócitos e hemácias, e correlacionar a concentração plaquetária com os níveis do fator de crescimento TGF-β1 nas amostras de PRP. Dez equinos, sadios, com idade média de 7 anos (±2,39), pesando em média 500kg (± 67,1) foram usados para avaliar sete protocolos de obtenção de PRP. Os protocolos testados variaram quanto à velocidade e tempo nas duas centrifugações. As variáveis analisadas nas amostras de PRP foram: concentração de plaquetas, presença de leucócitos e hemácias, e níveis de TGF-β1 quantificados pelo teste ELISA. Os resultados deste estudo não demonstraram diferenças significativas entre os protocolos testados quanto à capacidade de concentração plaquetária e quanto aos níveis de TGF- β1. Entretanto, foram observadas diferenças significavas entre o protocolo I aos demais protocolos devido a este apresentar maior número de hemácias e leucócitos nas amostras de PRP, sendo por isto considerado inadequado para o volume de sangue utilizado. Os demais protocolos podem ser utilizados para obtenção de PRP de sangue eqüino. Apesar do PRP ser uma opção de terapia na medicina equina, muitas lacunas relativas ao seu respeito ainda devem ser preenchidas.

O plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado na medicina equina para o tratamento de lesões ósseas, articulares, tendíneas e ligamentares. No entanto o PRP deve ser preparado no momento de cada aplicação, pois seu tempo máximo de utilização após o preparo é de apenas oito horas. O objetivo deste estudo foi avaliar o resfriamento e criopreservação como métodos de armazenamento do PRP equino utilizando dois crioprotetores: dimetil sulfóxido (DMSO) e trealose, na tentativa de manter a viabilidade plaquetária após o armazenamento a baixas temperaturas. Duas amostras de PRP foram preparadas a partir da centrifugação do sangue de seis pôneis saudáveis e foram destinadas à criopreservação a -196º C ou ao resfriamento a 4º C. Cada amostra de PRP preparada foi dividida em quatro alíquotas: fresca, com DMSO, com trealose ou sem crioprotetor. As amostras frescas foram avaliadas quanto à contagem plaquetária, determinação do volume plaquetário médio (VPM), concentração plaquetária em relação ao sangue total e quantificação do fator de crescimento de transformação beta 1 (TGF-β1). As amostras criopreservadas e resfriadas ficaram armazenadas por 14 dias e foram então submetidas às mesmas análises laboratoriais. O número de plaquetas e concentração plaquetária foram similares entre as amostras frescas e resfriadas com ou sem crioprotetor, mas foram superiores nas amostras frescas em relação às amostras criopreservadas. Observou-se aumento do VPM em todas as amostras armazenadas, indicando que as plaquetas sofreram lesões durante o armazenamento. A liberação de TGF-β1 foi superior no PRP fresco em relação ao PRP resfriado ou criopreservado, não havendo diferença entre as amostras que continham ou não crioprotetores. A adição dos crioprotetores DMSO e trealose não impediu as lesões plaquetárias de armazenamento. Por outro lado, tanto as amostras resfriadas quanto as criopreservadas liberaram quantidades significativas de TGF-β1. / Platelet rich plasma (PRP) is used in equine medicine for treatment of bone, joint, tendon and ligament injuries. However the PRP must be prepared at the time of each application, since its maximum time of use after the preparation is only eight hours. The objective of this study was to evaluate cooling and cryopreservation of equine PRP as storage methods using two cryoprotectants: dimethyl sulfoxide (DMSO) and trehalose, in an attempt to maintain platelet viability after storage at low temperatures. Two PRP samples were prepared from the blood centrifugation of six healthy ponies and were intended for cryopreservation at -196 ° C or cooling at 4 ° C. Each prepared PRP sample was divided into four aliquots: fresh, DMSO, trehalose or without cryoprotectant. The fresh samples were evaluated for platelet count, determination of mean platelet volume (MVP), platelet concentration in relation to whole blood and quantification of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). The cryopreserved and cooled samples were stored for 14 days and then submitted to the same laboratory tests. The number of platelets and platelet concentrations were similar between fresh and cooled samples with or without cryoprotectant, but were higher in fresh samples than in cryopreserved samples. An increase in MPV was observed in all stored samples, indicating that platelets suffered lesions during storage. The release of TGF-β1 was higher in fresh PRP than in cold or cryopreserved PRP, with no difference between samples containing or not cryoprotectants. The addition of DMSO and trehalose cryoprotectants did not prevent platelet storage lesions. On the other hand, both the cooled and cryopreserved samples released significant amounts of TGF-β1.

O tratamento tópico de feridas visa favorecer um processo de cicatrização eficaz, rápido e seguro. Como uma das opções, o Plasma Rico em Plaquetas – PRP - um concentrado de plaquetas obtido por meio de centrifugação sanguínea ou aférese, vem sendo também utilizado no tratamento de feridas por conter os fatores de crescimento plaquetários. Visto que se trata de uma terapia inovadora, este estudo objetivou buscar as evidências sobre o seu uso na terapia tópica de feridas crônicas de perna. Para tanto, realizou-se revisão sistemática de literatura, seguindo-se as etapas preconizadas pela Colaboração Cochrane. Os estudos foram levantados até 2006, por meio dos descritores platelet rich plasma, platelet derived growth factor, platelet gel, platelet releasate, platelet lysate, CT-102 activated supernatant, wound healing, chronic wound, foot ulcer, diabetic foot, e varicose ulcer, utilizando diferentes combinações, conforme a base de dados consultada (Cochrane, PubMed, Lilacs, Embase e Cinahal). Para a análise da validade interna dos estudos, empregaram-se: a Escala de Jadad, Escala de Avaliação do Grau de Recomendação e Evidência e Escala de Avaliação do Controle das Variáveis. De 56 estudos pré-selecionados, chegou-se à amostra de 18 ensaios clínicos, indexados, principalmente, no PubMed/ Medline (17 / 94,5%), originários dos EUA (12 / 66,6%) e publicados em língua inglesa. Desses, sete (39%) eram ensaios clínicos randomizados, que obtiveram forte recomendação (A) e nível de evidência alto. A partir das metanálises desses ensaios randomizados, em diferentes combinações, os resultados mostraram que o PRP favorece o processo de cicatrização (IC95% 1,84 - 7,41), principalmente em úlceras diabéticas (IC95% 2,94 - 20,31), e quando utilizado como CT-102 (IC95% 2,70-41,40). Concluindo, esta revisão sistemática e metanálise mostram que há evidências científicas sobre os resultados favoráveis do uso do PRP em feridas crônicas de perna, principalmente as de etiologia diabética / The wound topical treatment stimulates an effective, fast and safe wound healing. The platelet rich plasma (PRP) – a concentrated of platelets obtained from centrifugation or single apheresis, has been used as the treatment of wounds because it contains platelet derived growth factor. Being a new therapy, the aim of this study is to show some evidence about the effectiveness of PRP on the healing of chronic wound leg. To this test, a systematic review was conducted, as the recommendation of the Cochrane Library. The studies were screened until 2006 using some key words: platelet rich plasma, platelet derived growth factor, platelet gel, platelet releasate, platelet lysate, CT-102 activated supernatant, wound healing, chronic wound, foot ulcer, diabetic foot, and varicose ulcer; with different combinations, according to data base (Cochrane, PubMed, Lilacs, Embase e Cinahal). From 56 studies, 18 were clinical trials, specially found in PubMed (17 / 94,5%), originated in USA (12 / 66,6%) and published in English. Seven (39%) were clinical trials randomized , classified as a strong recommendation (A) with high evidence level. The meta-analysis of these randomized trials, shows the PRP promotion in wound healing (CI 95% 1,84-7,41), mainly in diabetic ulcer (CI 95% 2,70-41,40). To sum up, this study provides a scientific evidence on repair of chronic wound leg, mainly diabetic ulcer, using PRP

El estudio fue realizado en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas en el periodo de enero a mayo del año 2011, en el laboratorio de Hematología General. El objetivo de este estudio fue determinar la influencia de interferentes en el recuento de plaquetas obtenidos por el analizador hematológico Sysmex XE 2100, el cual presenta dos metodologías para el recuento de plaquetas: el método de impedancia hidrofocalizada (PLT-I) y el método de citometría de fluorescencia (PLT-O), en muestras de pacientes hemato-oncológicos. El estudio se llevó a cabo mediante una data de información de 232 muestras de personas sanas y 1304 muestras patológicas, se formaron subgrupos de muestras patológicas que tengan un interferente en particular, y realizar el análisis en cada uno de estos sub grupos. Los interferentes en estudio son los fragmentos de hematíes, microcitos (volumen corpuscular medio <82 fL), agregados plaquetarios, parámetros plaquetarios elevados: PLC-R > 30% (porcentaje de plaquetas grandes), VPM >11fL (volumen plaquetario medio), PDW > 14% (amplitud de distribución plaquetaria) Se utilizó la impedancia hidrofocalizada del SYSMEX 2100 XE para ser comparada con el método de citometría de fluorescencia. En consecuencia, se determinó, la media aritmética , la desviación estándar y el coeficiente de variación del error absoluto de los recuentos plaquetarios (diferencia PLT-O – PLT-I), tanto para los grupos normales y patológicos, en diferentes intervalos de plaquetas e interferentes en particular. El análisis de datos consistió en determinar el r de Pearson, para determinar la fuerza de asociación en los diversos grupos establecidos; el análisis de regresión lineal, con la finalidad de estudiar el comportamiento del R² y la pendiente en las diferentes situaciones propuestas (interferentes). Para el caso de interferentes que no fue posible su cuantificación de hizo uso del estadístico chi cuadrado x². Finalmente, se realizó el análisis gráfico de concordancia mediante la prueba de Bland – Altmant. Los resultados muestran que en el intervalo de 150-450 x 10^9 plaquetas/L hay mayor dispersión alrededor de la media en muestras con interferentes que en muestras que no lo presentan (muestras normales). La correlación entre los métodos PLT-O y PLT-I en muestras trombocitopénicas (intervalo de plaquetas: 70 – 150 x 10^9/L) disminuye en presencia de interferentes. Los interferentes que produjeron disminución en la correlación fueron P-LCR >30% y VPM >11fL (R²=0.854). Cuando éstos estuvieron presentes en simultáneo en la muestra, la correlación disminuyó levemente (R² =0.849). Sin embargo, se observó que los fragmentos de hematíes (FRC%) >10 % son los que producen mayor disminución en la correlación (R²=0.814). Los resultados del test de concordancia entre los métodos evaluados se vio afectada por los interferentes evaluados, siendo lo fragmentos de hematíes y agregados plaquetarios los que produjeron mayor discordancia. Se llegó a la conclusión que los recuentos obtenidos por el método de citometría de fluorescencia en muestras trombocitopénicas y provenientes de pacientes con alguna entidad hemato - oncológica están influenciados por los interferentes evaluados.

A Trombocitopenia imune (PTI) é uma doença imuno mediada adquirida de adultos e crianças caracterizada por plaquetopenia transitória ou persistente, onde o grau de plaquetopenia aumenta o risco de sangramento. Geralmente, os pacientes apresentam manifestações clínicas apenas em plaquetopenias abaixo de 50x103/mm3, e contagem de plaquetas entre 100 e 150 x103/mm3, se estável por mais de 6 meses, necessariamente não indica uma condição patológica. Tem sido sugerido diferentes processos fisiopatológicos relacionados às plaquetas de acordo com a intensidade da plaquetopenia, e que alterações na megacariocitopoiese e diminuição da sobrevida plaquetária são eventos determinantes na PTI. Contagem de plaquetas reticuladas em citometria de fluxo é um teste muito útil para avaliação da plaquetopenia, pois reflete a atividade megacariocitopoiética, destruição das plaquetas e a própria contagem de plaquetas. Tanto as plaquetas quanto os megacariócitos apresentam a via intrínseca da apoptose. A atividade dos principais mediadores da apoptose intrínseca, como Bax a Bak, é regulada por proteínas anti-apoptótica da família Bcl-2, tais como Bcl-xL. Um balanço entre Bcl-xL e Bax regula a sobrevivência plaquetária. Pacientes de PTI apresentam aumento da ativação plaquetária e da formação de micropartículas derivadas de plaquetas (MPP). Nosso objetivo foi avaliar a relação entre produção e apoptose plaquetária, e associá-la com a ativação plaquetária e a formação de MPP nos diferentes graus de intensidade da PTI. Os pacientes recrutados foram diagnosticados para trombocitopenia imune (PTI) primária, \"idiopática\", não esplenectomizados, acompanhados regularmente no ambulatório de Doenças Hemorrágicas e Trombóticas, do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e foram divididos grupos de acordo com contagem de plaquetas: < 50x103/mm3 (n=7); entre 50-100x103/mm3 (n=7); > 100x103/mm3 (n=7). Como grupo controle, foram avaliados 10 doadores de sangue da Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo. A produção plaquetária foi estabelecida através da contagem de plaquetas reticuladas por citometria de fluxo com laranja de tiazol. Também por citometria de fluxo avaliamos a ativação plaquetária pela expressão de P-selectina (CD62P), e a formação de MPP através de beads de 1um e dupla positividade para CD41a (GPIIbIIIa) e CD31 (molécula de adesão PECAM-1). A apoptose foi avaliada pela relação entre as expressões das proteínas anti apoptótica, Bcl-xL, e pró apoptótica, Bax, (Bcl-xL/Bax) em Western Blotting. Evidenciamos que na PTI há um aumento do numero de plaquetas reticuladas, predomínio de Bax em relação à Bcl-xL, uma maior ativação plaquetária e formação de MPP, mas em níveis variados dependentes do grau de plaquetopenia instalado. Sugerimos que o nível de predomínio do sistema pró apoptose sobre o anti apoptótico estabelece a intensidade da plaquetopenia na PTI. E que os eventos ativação plaquetária e formação de MPP são regulados pelo balanço entre Bcl-xL/Bax / Immune thrombocytopenic (ITP) is an immune-mediated acquired disease of adults and children characterized by transient or persistent decrease of the platelet count and, depending upon the degree of thrombocytopenia, increased risk of bleeding. ITP usually presents with clinical manifestations only in platelet counts below 50x103/mm3, and counts between 100 and 150x103/mm3 if they have been stable for more than 6 months do not necessarily indicate a pathologic condition. It has been suggested the existence of different pathophysiological processes involving platelets according to the severity of thrombocytopenia, and that alterations in the megakaryopoiesis and reduced platelet lifespan play a key role in ITP. The flow cytometric analysis of reticulated platelets is useful for evaluating thrombocytopenia that reflect the activity megakaryopoiesis, platelets destruction, plataelet count, and age. Platelets and megakaryocytes contain intrinsic pathway of apoptosis. The activity of key mediators of intrinsic apoptosis, Bak and Bax, is tightly controlled by anti-apoptotic Bcl-2 family members, of which Bcl-xL, wich have been shown to coordinately regulate platelet survival. ITP patients have a larger amount of activated platelets that express P-selectin as well as an increase of platelets-derived microparticles (PMP). We suggest a relationship between platelet production and Bcl-xL and Bax expression in ITP patients from different degrees of thrombocytopenia, that has relate with platelet activation and PMP. Our aim was assessment of ratio between platelets production and apoptosis, and it associate with platelets activation and PMP in differents thrombocytopenia degree in ITP. Patients were considered eligible for the study if they were on regular follow-up at the clinic of haemorrhagic and thrombotic diseases of the Hematology Service of Clinics Hospital of University of São Paulo Medicine School diagnosed with primary immune thrombocytopenia, \"idiopathic\". Patients were divided into groups according to levels of thrombocytopenia: platelets count between 100 and 150x103/mm3 ( > 100x103/mm3); between 50 and 100x103/mm3 (50-100x103/mm3); and below 50x103/mm3 ( < 50x103/mm3). Healthy volunteers were blood donors in the Pró-Sangue Foundation of Blood Center of São Paulo, with platelets count between 150 and 450 x103/mm3. Platelets production was through reticulated platelets count by flow cytometry wiht thiazole orange. Also by flow cytometry evaluated platelet activation through expression of P-selectin, and PMP by beads of 1um and double positive for CD41a, and CD31. Apoptosis was evaluated by the relationship between anti apoptotic proteins Bcl- XL, and pro apoptotic, Bax (Bcl-XL / Bax) in Western blotting. We show that there higher reticulated platelets in ITP as well as Bax predominantly in relation to Bcl-xL, increased platelet activation and PMP, but at varying levels depending on the degree of thrombocytopenia. We suggest that the level of dominance of pro apoptotic system on the anti-apoptotic establishes the intensity of thrombocytopenia in ITP, and that platelet activation and formation of MPP events are regulated by the balance between Bcl-xL / Bax

Acidentes pela serpente Bothrops jararaca (Bj) causam distúrbios hemostáticos em pacientes. Sabe-se que a fisiopatologia desses distúrbios é complexa, porém não se conhece a relevância das duas principais famílias de enzimas presentes no veneno de Bj com atividade anti-hemostática, as metaloproteinases e serinaproteases, para promover esses distúrbios. Além disso, a injúria local induzida no local da inoculação do veneno poderia estimular a liberação de fator tissular (TF) na circulação sanguínea, favorecendo a coagulopatia. Assim, o objetivo deste projeto foi investigar a contribuição das metaloproteinases e serinaproteases do veneno de Bj e a expressão de TF para a gênese dos distúrbios hemostáticos, utilizando um modelo experimental em ratos. O veneno de Bj foi previamente incubado com Na2-EDTA 13 mM ou AEBSF 4 mM para inibir as metaloproteinases e serinaproteases, respectivamente, e administrado pelas vias s.c. ou i.v. Após 3 e 6 h, os parâmetros hemostáticos e de expressão proteica de TF e isomerase de dissulfeto proteico (PDI) foram avaliados. Os níveis de veneno circulante se elevaram mais rapidamente no grupo injetado pela via i.v., e o tratamento do veneno com Na2-EDTA ou AEBSF não reduziu os níveis circulantes de veneno em comparação ao grupo controle com veneno. Em comparação com animais tratados com salina, houve uma queda abrupta na contagem plaquetária em todos os grupos e tempos administrados com veneno de Bj, sendo o grupo administrado pela via i.v. o que apresentou uma queda de maior intensidade. O pré- tratamento do veneno com o AEBSF não impediu o consumo plaquetário e somente o Na2-EDTA parcialmente reverteu a plaquetopenia. Por outro lado, o veneno não tratado causou consumo de fibrinogênio plasmático, geração de produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina, prolongamento do tempo de protrombina (TP) e hemorragia no local de inoculação do veneno. No entanto, o Na2-EDTA, e não o AEBSF, bloqueou completamente esses parâmetros. Não houve redução dos níveis de fator VII ao longo do envenenamento, e seus níveis apresentou um notável aumento nos animais envenenados no grupo 6 h s.c. Ratos envenenados apresentaram notável aumento dos níveis do TF plasmáticos, que foi inibido pelo pré-tratamento com o Na2-EDTA. Houve também aumento da expressão de TF no pulmão e pele. Nos grupos injetados com veneno de Bj em 6 h ocorreu uma redução da expressão de PDI. Os resultados mostram que as metaloproteinases são componentes essenciais para o desencadeamento da coagulopatia do envenenamento. No entanto, as metaloproteinases e serinaproteases não estão diretamente envolvidas na gênese da plaquetopenia induzida pelo veneno de Bj e outros mecanismos/toxinas parecem estar envolvidos. Os resultados também demonstraram o aumento dos níveis de TF plasmático durante o envenenamento, similar àquele observado na coagulação intravascular disseminada, o que sugere a importância da geração de TF como um mecanismo para promover distúrbios sistêmicos da coagulação / Bites by Bothrops jararaca (Bj) snakes evoke hemostatic disturbances in patients. The pathophysiology of such disturbances is complex, but the importance of the major enzyme families with anti-hemostatic activity, found in Bj venom. i.e., metalloproteinases and serine proteinases, to promote them is not known. Moreover, the local injury induced at the site of venom inoculation might also stimulate tissue factor (TF) release into bloodstream, favoring the coagulopathy. The aim of this study was to investigate the contribution of metalloproteinases and serine proteinases of Bj venom, as well the TF expression to the genesis of hemostatic disturbances, using an experimental model in rats. Crude Bj venom was previously incubated with 13 mM Na2-EDTA or 4 mM AEBSF to inhibit metalloproteinases and serine proteinases, respectively, and administered s.c. or i.v. into rats. After 3 and 6 h, hemostatic parameters and TF and protein disulfide isomerase (PDI) expression were evaluated in plasma and samples of skin and lungs. Circulating venom levels increased more rapidly in i.v. group, and neither Na2-EDTA nor AEBSF treatment reduced the circulating venom levels in comparison with the control group. Platelet counts showed a marked decrease in all groups administered with Bj venom in comparison with saline-treated rats; the fall in platelet counts was more intense in animals administered i.v. with Bj venom. The pre-treatment of venom with AEBSF failed to block the fall in platelets count, and only Na2-EDTA minimally reversed thrombocytopenia. Nonetheless, non-treated venom provoked plasma fibrinogen consumption, generation of fibrin(ogen) degration products, prolongation of prothrombin time (TP), and hemorrhage at the site of venom inoculation. However, Na2-EDTA, but not AEBSF, completely blocked these parameters. Factor VII levels were not reduced during envenomation, and they showed a marked increase in envenomed rats at 6 h in the s.c. group. Envenomed rats showed a marked increase in plasma TF levels, which was also blocked by Na2-EDTA. In addition, TF expression was increased in the lung and skin samples. PDI expression in skin was reduced at 6 h in all groups treated with venom. These findings demonstrate that metalloproteinases are essential venom components involved in the Bj-induced coagulopathy. Nonetheless, metalloproteinases and serine proteases had no direct involvement in the genesis of Bj-induced thrombocytopenia and other venom mechanisms/toxins seem to be associated therein. High levels of TF in plasma may occur during snake envenomation, so that the etiopathogenesis of coagulopathy in snake envenomation resembled that of true disseminated intravascular coagulation syndrome

Os hemoderivados têm sido utilizados com frequência cada vez maior na medicina equina, sendo caracterizados como um produto autólogo, com maior quantidade de fatores de crescimento e que melhora a capacidade de cicatrização de tecidos com pouco aporte sanguíneo, como tendões e articulações, diminuindo o tempo de recuperação do animal. Sabe-se que os fatores de crescimento são derivados das plaquetas, porém a correlação positiva entre o aumento na contagem plaquetária e a maior concentração de fatores de crescimento ainda é motivo de discussão entre os autores. Com o intuito de se obter um produto final com maior contagem plaquetária, é frequente o aumento da velocidade ou número de centrifugações na metodologia empregada, aumentando o risco de agregação plaquetária precoce. O objetivo do presente trabalho é estudar o efeito da dupla centrifugação no preparo de PRP, por meio da comparação entre contagens plaquetárias, concentrações de fator de crescimento TGF-&#946;1, e grau de ativação plaquetária por meio da porcentagem de agregação. Foram utilizados 12 equinos, machos, de 3 a 5 anos, clinicamente sadios. Para tanto foram realizados dois protocolos distintos: um com centrifugação única e o outro com dupla centrifugação. No primeiro, o sangue com anticoagulante foi centrifugado a 141G/12 minutos; enquanto no segundo a primeira centrifugação foi de 300G/5 minutos seguida de 700G/15 minutos, com repouso entre as mesmas e após. Os produtos obtidos após cada centrifugação foram submetidos à contagem plaquetária, teste de agregação e quantificação de TGF--&#946;1 por meio de kit ELISA. Os resultados obtidos demonstraram maior concentração plaquetária quando utilizado protocolo de dupla centrifugação. Agregometria evidenciou maior ativação das plaquetas durante o preparo do PRP quando submetidas a maiores velocidades de centrifugação (força gravitacional) e não ao fato das amostras serem centrifugadas duas vezes. A quantificação do TGF--&#946;1 não mostrou diferença quando realizado em amostras com apenas uma centrifugação, mas demonstrou valores maiores no produto final da segunda centrifugação. A avaliação por meio de coeficiente de determinação e coeficiente de correlação de Pearson evidenciou correlação positiva entre contagem plaquetária e de TGF--&#946;1. O protocolo com dupla centrifugação se mostrou mais eficaz em concentrar plaquetas e TGF--&#946;1, não sendo prejudicado pela ativação precoce dessas plaquetas durante o preparo. / Blood derived products have been used in equine medicine with increasing frequency, being characterized as an autologous product, with greater amount of growth factors and be capable of improvement the healing capacity in tissues with poor blood supply, such as tendons and joints, reducing the time of recovery of the animal. It is known that the growth factors are derived from platelets, but the positive correlation between the increase in platelet count and the higher concentration of growth factors is still a reason for discussion among the authors. In order to obtain a final product with a higher platelet count, it is frequent to increase the speed or number of centrifugations in the methodology employed, increasing the risk of early platelet aggregation. The aim of the present study is to verify the effect of double centrifugation in PRP preparation by comparing platelet counts, TGF-&#946;1 growth factor concentrations, and degree of platelet activation through percentage of aggregation. Twelve horses, male, aged 3 to 5 years-old, clinically healthy were subjected. Two different protocols were performed: one with single centrifugation and the other with double centrifugation. In the first one, the anticoagulated blood was centrifugated at 141G/12 minutes; while in the second one the first centrifugation was 300G/5 minutes followed by 700G/15 minutes, with rest between them and after. The products obtained after each centrifugation were submitted to platelet counting, aggregation test and measurement of TGF-&#946;1 by ELISA kit. The results showed a higher platelet concentration when double centrifugation protocol was used. The aggregometry test evidenced a greater activation of the platelets during the preparation of PRP when submitted to higher centrifugation velocities (times g), and not to double centrifugation. Quantification of TGF-&#946;1 showed no difference when performed on samples with only one centrifugation, but was higher values in the final product of the second centrifugation. The determination coefficient and Pearsons correlation coefficient showed a positive correlation between the platelet count and TGF-&#946;1 concentration. The double centrifugation protocol proved to be more effective at concentrating platelets and consequently higher amounts of TGF-&#946;1, not being impaired by early activation during obtainment.

Epitélios confluentes de queratinócitos autólogos, cultivados segundo metodologia padronizada por Rheinwald e Green em 1975, têm sido usados como enxertos em diferentes situações clínicas. Contudo, a presença de componentes xenobióticos empregados nesta metodologia implica na possibilidade de transmissão de zoonoses, príons e viroses aos pacientes, além de envolver questões éticas relacionadas à utilização de animais. Tais preocupações têm direcionado pesquisadores a buscar alternativas que superem este impasse; no entanto, as formulações obtidas até o momento não são completamente satisfatórias. Assim, nossa proposta neste estudo, foi omitir ou substituir os componentes xenobióticos tradicionalmente utilizados no meio para queratinócitos, por similares humanos. Como resultado, padronizamos um meio de cultura onde omitimos o emprego de toxina colérica, substituímos o soro fetal bovino por lisado de plaquetas humanas na concentração de 2,5% e a insulina de origem bovina foi substituída por insulina recombinante humana na mesma concentração do método original (5 &mu;g/mL). Com os resultados obtidos foi possível concluir ser viável o cultivo de queratinócitos humanos, mantidos em meio de cultura livre de componentes xenobióticos. / Confluent epithelia of autologous keratinocytes, cultivated according to standardized methodology by Rheinwald and Green in 1975, have been used as grafts in different clinical situations. However, the presence of xenobiotics components applied in this method implies the possibility of transmission of zoonoses, príons, and viruses to patients, besides involving ethical issues related to the use of animals for components obtainment. Such concerns have driven researchers to seek alternatives that overcome this deadlock, as the formulations obtained so far are not completely satisfactory. Thus, our proposal in this study was to omit or replace the xenobiotics components traditionally used in the medium to keratinocytes culture, by human similar. As a result, we have standardized a culture medium whereby we omitted the use of cholera toxin, replaced fetal bovine serum by human platelet lysate at a 2.5% concentration and bovine insulin was replaced by recombinant human insulin at the same concentration as the original method (5 &mu;g/mL). With the results obtained we could conclude that the method to be viable to cultivate human keratinocytes, kept in culture medium free of xenobiotics components.

Embora pacientes em terapia dupla antiplaquetária, composta de aspirina e um antagonista do receptor purinérgico P2Y12, tenham melhor prognóstico, eles ainda sofrem eventos trombóticos. Frequentemente, relaciona-se o nível de inibição plaquetária destes pacientes à ineficácia do tratamento. A reatividade plaquetária destes pacientes é uma função do nível do bloqueio do receptor P2Y12 e dos níveis de óxido nítrico e prostaciclina, importantes mediadores endoteliais, os quais agem em sinergia tripla aumentando o nível dos nucleotídeos cíclicos intraplaquetários mantendo a plaqueta em estado quiescente. Pacientes com disfunção endotelial têm menor disponibilidade destes mediadores e, consequentemente, menor inibição plaquetária in vivo. Propõe-se uma nova estratégia terapêutica composta de um inibidor do receptor purinérgico P2Y12, um ativador da enzima guanilato ciclase e um inibidor da fosfodiesterase, visando aumento dos nucleotídeos cíclicos, resultando em um forte efeito antiplaquetário localizado e tendo aplicação direta à pacientes com disfunção endotelial. / Disorders on the cardiovascular (CV) system are responsible for 31% of deaths worldwide. When inappropriately activated, platelets can cause myocardial infarction and stroke. Dual anti-platelet therapy (DAPT), composed of acetylsalicylic acid and a P2Y12 receptor blocker (clopidogrel, prasugrel, etc) is recommended for the prevention of recurrent CV events. Whilst DAPT is associated with an improvement in patient outcomes, thrombotic events do still occur. Platelet reactivity of patients under DAPT is a function of the level of P2Y12 receptor blockade and the levels of nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2), two important endothelium-derived autacoids. Therefore, a new antithrombotic therapy is proposed using soluble guanylate cyclase (sGC) allosteric modulators independent of NO and phosphodiesterase (PDE) inhibitors. Based on the results observed, the combination of a sGC activator and a PDE inhibitor given at low doses, in the presence of P2Y12 receptor blocker, could produce enhanced and localized platelet inhibition.