Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-11T18:18:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EletrorretinografiaMultifocalDesenvolvimento.pdf: 3263891 bytes, checksum: a89768008f3f46c900221a6944872516 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-19T12:27:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EletrorretinografiaMultifocalDesenvolvimento.pdf: 3263891 bytes, checksum: a89768008f3f46c900221a6944872516 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T12:27:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EletrorretinografiaMultifocalDesenvolvimento.pdf: 3263891 bytes, checksum: a89768008f3f46c900221a6944872516 (MD5) Previous issue date: 2014-11-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A presente tese foi composta por dois estudos desenvolvidos paralelamente. O primeiro objetivo foi o desenvolvimento de um método para classificar as respostas eletrorretinográficas e validar este método em toxoplasmose ocular. O segundo objetivo foi investigar o efeito do uso agudo de cloroquina na retina de paciente com malária (P. vivax) que receberam o tratamento estabelecido pelo Ministério da Saúde do Brasil. A ferramenta experimental de ambos os estudos foi o eletrorretinograma multifocal (mfERG). No primeiro estudo, o sistema Veris foi usado para testar 10 sujeitos saudáveis e calcular a razão sinal-ruído com o objetivo de achar os melhores valores para separar respostas normais de respostas retinianas diminuídas. O resultado final desta análise foi aplicado em três pacientes com perda visual devido toxoplasmose ocular. Os resultados mostraram uma razão sinal-ruído ótima de 0,47 para separar formas de onda com e sem sinal. As razões sinal ruído de 0,47, 0,44, 0,48, 0,57, 0,78 e 1,21 foram ótimas para separar respostas normais de respostas progressivamente atenuadas. A aplicação da análise sinal-ruído em pacientes com toxoplasmose ocular foi capaz de mapear a área retiniana sem atividade quando provocada pela luz. O segundo estudo foi desenvolvido usando o mfERG para avaliar 48 pacientes com malária, P. vivax, que receberam terapia medicamentosa de cloroquina. Estes dados foram comparados com os dados de 37 sujeitos saudáveis. Os resultados mostraram que o número de infecções variava de 1 a 18 vezes. Durante o tratamento, a dose média de cloroquina ingerida foi 5429 ± 782,3 mg. A estimativa da dose cumulativa normalizada pela massa corporal variou de 14,58 a 545,45 mg/kg. Nenhuma diferença foi observada na amplitude e tempo implícito do mfERG entre os pacientes e os controles em nenhum dos anéis concêntricos do campo visual. Não houve correlação significativa entre a atividade retiniana com a dose cumulativa de cloroquina. Concluiu-se que a análise da razão sinal-ruído desenvolvida nesta tese pode ser usada como um método confiável para estudar a função retiniana diminuída, incluindo o mapeamento das consequências da toxoplasmose ocular; e que o uso agudo da cloroquina para tratamento de malária não causou nenhuma piora da atividade retiniana registrada pelo mfERG. / The current thesis was composed by two studies performed in parallel. The first purpose was the development of a reliable method to classify the electroretinographic responses and to validate this method in ocular toxoplasmosis. The second purpose was to investigate the effect of the acute use of chloroquine in the retina of vivax malaria patients, which received the standard treatment of the Ministry of Health of Brazil. The experimental tool of both studies was the multifocal electroretinogram (mfERG). In the first study the Veris system was used to test 10 healthy subjects to calculate a signal to noise ratio analysis in order to find the best values to separate normal responses from impaired retinal responses. The final results of this analysis were applied in three patients with visual loss due ocular toxoplasmosis. The results showed an optimal signal to noise ratio of 0.47 to separate waveforms with and without signal. The signal to noise ratio of 0.47, 0.44, 0.48, 0.57, 0.78, 1.21 were optimal to separate normal responses from progressively attenuated responses. The application of the signal to noise ratio analysis into ocular toxoplasmosis patients was able to map the retinal area with no activity evoked by the light. The second study was performed using mfERG to evaluate 48 vivax malaria patients which received chloroquine-based treatment. Their data were compared to 37 healthy subjects. The results showed that number of infections ranged between from 01 to 18 times. During the treatment, the mean dosage of intaken chloroquine was 5429 ± 782.3 mg. The cumulative dosage normalized to the body mass ranged from 14.58 to 545.45 mg/kg. No difference was observed in the mfERG amplitude and implicit time obtained from malaria patients and control group at any concentric rings of the visual field. There was no significant correlation between the retinal activity with the chloroquine cumulative dosage. It was concluded that the signal to noise analysis developed in this thesis can be used as a reliable method to study impaired retinal function, including the mapping of ocular toxoplasmosis consequences; and the acute use of chloroquine for malaria treatment caused no impairments to retinal activity recorded by mfERG.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-11T18:31:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ComprometimentoPulmonarMalaria.pdf: 3612216 bytes, checksum: db5bd6736fecad376c1f2be4ab4974a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-21T13:12:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ComprometimentoPulmonarMalaria.pdf: 3612216 bytes, checksum: db5bd6736fecad376c1f2be4ab4974a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-21T13:12:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ComprometimentoPulmonarMalaria.pdf: 3612216 bytes, checksum: db5bd6736fecad376c1f2be4ab4974a4 (MD5) Previous issue date: 2014-11-20 / A malária é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida ao homem pela picada de mosquitos do gênero Anophelis. Em 2011 a Amazônia brasileira registrou 266.348 casos. No Brasil, a espécie mais prevalente é o P. vivax (80%), antes considerado responsável pelas formas benignas da malária. Relatos demonstram formas graves com manifestação pulmonar e óbitos. Os mecanismos fisiopatológicos não são bem compreendidos. Assim, analisou-se 247 pacientes portadores de malária vivax, recrutados do Programa de Ensaios Clínicos em Malária do Instituto Evandro Chagas (IEC) Belém/PA) e serviço de diagnóstico de malária da Secretaria de Saúde do município de Goianésia/Pará, no período de abril/2011 a outubro/2013, objetivando avaliar parâmetros clínicos, epidemiológicos, parasitológicos, radiológicos, imunes e genéticos (variantes de P. vivax), associando-os ao comprometimento pulmonar na malária vivax. O Projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Evandro Chagas. Foram analisados parâmetros hematológicos (hemograma, transaminases, bilirrubinas) e densidade parasitária, assim como foram dosados os níveis séricos das citocinas (TNF-, IL-10 e INFγ) em D0 e D14, relacionando com as manifestações pulmonares. Em D0 foi determinada a prevalência das variantes do P. vivax (VK210 e VK247 e P. vivax-like) e estabelecido associação com os pacientes que apresentaram alterações na radiografia (RX) de tórax e/ou na espirometria. O estudo foi do tipo longitudinal, prospectivo e analítico envolvendo aspectos clínicos, imunológicos, hematológicos, radiológicos e de função respiratória. Pacientes com alterações pulmonares confirmadas por achados clínicos e/ou radiológicos e/ou funcionais constituíram o grupo de estudo, e os pacientes que não apresentaram tais achados, o grupo controle. Participaram: portadores de malária vivax diagnosticados pela gota espessa e confirmados por PCR, de 15 a 60 anos, de ambos os gêneros, sem doenças crônicas, sem uso de corticosteróides no momento do diagnóstico e que assinaram o TCLE. Nos resultados observou-se: 69,2% eram do sexo masculino; média de idade 35anos; 64,4% residiam em Belém; 79,8% contraiu malária no interior do estado do Pará; 42,5% eram primoinfectados; tempo médio de doença foi de 7,5 dias; média de parasitemia foi de 6.979 parasitos/mm3; 46,8% tinham sobrepeso ou obesidade I. Tabagismo e pneumopatias prévias não foram fatores de risco para o agravamento da doença nessa amostra. Da tríade malárica 92,3% apresentaram cefaléia; e a tosse foi o sintoma respiratório mais frequente (53,4%). Hepato e esplenomegalia foram mais frequentes entre os primoinfectados; e plaquetopenia foi significativa em D0. Alterações radiológicas foram encontradas em 9,7% dos casos e estavam relacionadas à malária. Falta de ar e tosse, tiveram significância estatística nos pacientes com alteração no RX e/ou espirometria. A Interleucina-10 (IL-10) e Interferon gama (INFγ) foram significativamente mais elevados em D0 em relação a D14, ao contrário e de forma curiosa o Fator de Necrose Tumoral (TNF) apresentou níveis séricos baixos em D0. A variante do P. vivax mais frequente foi VK210 (69,1%); não houve correlação significativa no aparecimento de alterações no RX e/ou espirometria relacionada a alguma das subespécies do plasmódio no estudo. Das citocinas, INFγ esteve significativamente elevado em D0 relacionado às variantes nas seguintes situações: (VK210; VK247; VK210/247). A IL-10 aumentou significativamente em D0 somente quando a subespécie foi VK210. Malária pulmonar é uma realidade ainda subestimada, principalmente as manifestações pulmonares menos exuberantes, sendo necessário investigar potenciais mecanismos envolvidos ligados ao hospedeiro e ao parasito, enfatizando a importância do diagnóstico precoce e assim evitando desfechos desfavoráveis. / Malaria is a disease caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium and transmitted to humans by mosquitoes of the genus Anophelis. In 2011, the Brazilian Amazon reported 266.348 cases. In Brazil, the most prevalent species is Plasmodium vivax (80%). It´s considered responsible for benign forms of malaria, reports have shown severe forms of pulmonary malaria and deaths. The pathophysiological mechanisms are not well understood.Thus, we analyzed 247 patients with vivax malaria recruited from the Clinical Trials Program in Malaria Institute Evandro Chagas (IEC) Belém / PA) and malaria diagnosis service of the Secretariat of Health of the city of Goianésia / Pará between April / 2011 to October / 2013 to evaluate clinical, epidemiological, parasitological, radiological, genetic and immune (variants of P. vivax) parameters, associating them to the pulmonary involvement in vivax malaria. The project was approved by the Research Ethics Committee of the Instituto Evandro Chagas.Hematological parameters (blood count, transaminases, bilirubin), parasite density were analyzed as were measured at D0 and D14 serum levels of cytokines (TNF-, IL-10 and INFγ), relating to the pulmonary manifestations. D0 was determined prevalence of P. vivax variants (VK210 and VK247 and P. vivax-like) and established association of these variants with patients who had an abnormal chest X-ray and / or spirometry. The study was longitudinal, prospective analytical type involving clinical, immunological, hematological, and radiological aspects of respiratory function. Patients with pulmonary involvement confirmed by clinical and / or radiological and / or functional findings constituted the study group, and patients without such findings, the control group. Participants: those with vivax malaria diagnosed by thick blood, confirmed by PCR, 15-60 years old, both genders, with no chronic diseases, no use of corticosteroids at diagnosis and who signed the consent form. Project approved by the CEP of the IEC. Observed: 69.2% were males; mean age 35 years old; 64.4% lived in Belém; 79.8% contracted malaria in the state of Pará; First infection 42.5%; mean duration of disease 7.5 ± 5.9 days; average of 6979.25 ± 8692.22 parasitaemia parasites / mm3; 46.8% were overweight or obese I; smoking and previous lung disease were not risk factors for worsening of the disease in this sample; 92.3% had headache from malaria triad; among respiratory symptoms, cough was the most frequent (53.4%); hepatomegaly and splenomegaly was more frequent among naïve malaria; Thrombocytopenia was significant in D0; radiological abnormalities in 9.7% of cases; changes in X-ray were related to malaria shortness of breath and cough had statistical significance in those with changes in the X-ray and / or spirometry; IL-10 INFγ and cytokines were significantly higher compared D0 to D14, unlike that serum TNF levels were low in D0. VK210 P. vivax variant was more frequent (69.1%); there was no significant correlation in the appearance of changes in RX in this sample and / or spirometry related to any of the P. vivax subspecies. Among the cytokines, INFγ was significantly elevated in D0 associated to variants in the following situations: (VK210, VK247, VK210 / 247). IL-10 also significantly increased in D0 only when the subspecies was VK210. Lung malaria is a reality still underestimated, especially less prominent pulmonary manifestations, being necessary to investigate potential mechanisms involved linked to the host and the parasite, emphasizing the importance of early diagnosis, avoiding unfavorable outcome.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2015-06-18T17:20:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_MarcadoresEstresseOxidativo.pdf: 2298812 bytes, checksum: e5d10f76398173dce7a3c6f19fd25794 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-06-22T13:10:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_MarcadoresEstresseOxidativo.pdf: 2298812 bytes, checksum: e5d10f76398173dce7a3c6f19fd25794 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-22T13:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_MarcadoresEstresseOxidativo.pdf: 2298812 bytes, checksum: e5d10f76398173dce7a3c6f19fd25794 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No Brasil, o P. vivax representa a maioria dos casos de malária, totalizando quase 90% dos registros nos estados da Amazônia Legal. Vários estudos objetivaram compreender a relação do estresse oxidativo nos pacientes infectados pelo Plasmodium spp com as respostas clínica e parasitológica, pois o papel protetor ou deletério das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio geradas por diferentes mecanismos no decurso da infecção é controverso na fisiopatogenia da malária humana. Entretanto, não há estudos que associem os danos oxidativos e as defesas antioxidantes do hospedeiro na malária vivax não complicada na Amazônia. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar marcadores de estresse oxidativo no decorrer da fase aguda da malária por P. vivax, caracterizando o envolvimento das vias redox, a resposta do hospedeiro humano e a influência da quimioterapia, a fim de testar as hipóteses que os biomarcadores de estresse oxidativo não são alterados no decurso da fase aguda da malária vivax não complicada e a introdução da quimioterapia não contribui para o estresse oxidativo nestes sujeitos. Foi realizado estudo quantitativo longitudinal de casos constituídos por 38 sujeitos com malária por P. vivax adultos, de ambos os gêneros, os quais foram analisados antes, durante e após a instituição da terapia (D0, D2 e D7), comparados a grupo controle de 15 voluntários saudáveis, pareados por gênero e idade. Foram determinados por técnicas espectrofotométricas os teores de metemoglobina, a peroxidação lipídica, a capacidade antioxidante não enzimática total, a atividade da superóxido dismutase, os níveis eritrocitários de glutationa reduzida e da glutationa total plasmática. Comparado ao grupo controle, de maneira significativa, os teores de glutationa reduzida (p=0,004) foram inferiores e a peroxidação lipídica (p<0,001) foi superior, respectivamente. Entretanto, alterações significativas não foram observadas nos teores de metemoglobina, na capacidade antioxidante não enzimática total e na atividade da superóxido dismutase comparados ao grupo controle. Entretanto, com o decorrer do tratamento foram notados aumento significativo dos teores de metemoglobina (p<0,001) e da atividade da superóxido dismutase (p=0,038); porém os níveis de glutationa reduzida eritrocitária estava reduzidos (p=0,007). Além disso, não houve alterações significativas nos níveis da capacidade antioxidante não enzimática total e da glutationta total plasmática com a introdução dos antimaláricos. O nível de estresse oxidativo não foi obtido, uma vez que não foi significativa a correlação da peroxidação lipídica com a capacidade antioxidante não enzimática total durante o tratamento. Conclui-se que o aumento da peroxidação lipídica resultante do dano oxidativo foi contraposto pelo consumo de glutationa eritrocitária antes da introdução da terapia, sugerindo a participação das vias redox na malária vivax não complicada. A instituição da quimioterapia, provavelmente, interferiu no ciclo redox intraeritrocitário, o que foi caracterizado pelo continuo aumento da metemoglobina e da atividade da superóxido dismutase, bem como pela redução dos teores de glutationa reduzida nos eritrócitos. / In Brazil, P. vivax accounts for the majority of malaria cases, totaling almost 90% of the records in the Amazonian states. Several studies aimed to understand the relationship of oxidative stress in patients infected with Plasmodium spp clinical and parasitological responses because the plays role deleterious or protective of reactive oxygen species and nitrogen generated by different mechanisms during infection is controversial in the pathogenesis of human malaria . However, no studies involving oxidative damage and antioxidant defenses of the host uncomplicated vivax malaria in the Amazon. Therefore, the aim of this study was to evaluate oxidative stress markers during the acute phase of malaria by P. vivax, characterizing pathways involving redox response of the human host and the influence of chemotherapy in order to test the hypothesis that biomarkers of oxidative stress are not changed during the acute phase of vivax malaria and uncomplicated introduction of chemotherapy does not contribute for oxidative stress in these subjects. It was conducted quantitative study longitudinal case consisting of 38 subjects with malaria by P. vivax adults of both gender, which were analyzed before, during and after the introduction of therapy (D0, D7 and D2), compared to control group of 15 healthy volunteers, matched for gender and age. Were determined by spectrophotometric techniques levels of methemoglobin, lipid peroxidation, total non-enzimatic antioxidant capacity, the activity of superoxide dismutase, erythrocyte levels of reduced glutathione and total glutathione in bloodstone. Compared to the control group, significantly, the levels of reduced glutathione (p = 0.004) was lower and lipid peroxidation (p <0.001) was higher, respectively. However, no significant changes were observed in the levels of methemoglobin, in total non-enzimatic antioxidant capacity and activity of superoxide dismutase compared to the control group. However, with the course of treatment were noted significant increase in the levels of methemoglobin (p <0.001) and superoxide dismutase activity (p = 0.038), but erythrocyte levels of reduced glutathione was reduced (p = 0.007). Furthermore, no significant changes in the levels of total non-enzimatic antioxidant capacity and glutathione in bloodstone with the introduction of antimalarials. The level of oxidative stress was not obtained, since there was no significant correlation between lipid peroxidation with the total non-enzimatic antioxidant capacity during all treatment. It was concluded that increased lipid peroxidation resulting from oxidative damage is opposed by the use of glutathione before the introduction of the therapy, suggesting the involvement of redox pathways in uncomplicated vivax malaria. The institution of chemotherapy, probably, interfered in intraerythrocyte redox cycle, which was characterized by a continuous increase in methemoglobin and the activity of superoxide dismutase, as well as by the reduction of the levels of reduced glutathione in erythrocytes.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-17T17:59:45Z No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-17T17:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciencias Medicas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Anualmente, a malária afeta cerca de 300 milhões de pessoas no mundo (causando cerca de um milhão de mortes). No Brasil 450.000 casos são notificados anualmente. Recentemente, muitos trabalhos têm procurado identificar moléculas mediadoras da interação mosquito/plasmódio. Anopheles aquasalis é o vetor de malária mais importante nas regiões litorâneas do Brasil e Plasmodium vivax o agente etiológico causador da maior parte dos casos da doença. Este estudo visa examinar moléculas que participam da interação entre estes dois organismos. Para tal, duas estratégias foram utilizadas: subtração de cDNAs e PCR com iniciadores degenerados. As bibliotecas subtrativas foram produzidas a partir de amostras de A. aquasalis 2 e 24 horas após alimentação sanguínea ou infecção por P. vivax. Após a análise dos cDNAs obtidos foram observadas diferenças na expressão de genes entre A. aquasalis alimentados com sangue e com sangue infectado em ambos os intervalos de tempo investigados. Os resultados das subtrações de cDNA para os genes serino protease, fibrinogênio, proteína responsiva a bactéria e carboxipeptidase foram corroborados utilizando PCR em tempo real. Por exemplo, uma cecropina teve a sua expressão diminuída após a infecção com P. vivax e uma serpina apresentou um resultado oposto. Análise de um fator de transcrição GATA revelou um aumento de RNAm 36 horas após infecção com P. vivax assim como um aumento da infecção após silenciamento deste gene, demonstrando a importância deste fator de transcrição para a resposta imune do inseto contra P. vivax. Em paralelo, cDNAs de A. aquasalis específicos para genes relacionados com a via JAK-STAT [fator de transcrição STAT, proteína inibitória de STAT ativado (PIAS) e óxido nítrico sintase (NOS)] e com o sistema de detoxificação celular (catalase e duas superóxido dismutases) foram amplificados utilizando iniciadores degenerados. Resultados de expressão destes genes revelaram que STAT, PIAS e NOS são induzidos pela infecção com P. vivax e experimentos de genética reversa comprovaram que a via de sinalização JAK/STAT é importante na resposta imune do A. aquasalis contra este parasito. Com relação às enzimas de detoxificação, foi observado um aumento da expressão 36 horas após infecção e uma diminuição da atividade das enzimas SOD e catalase 24 horas após infecção. Este aumento de RNAm 36 horas após infecção pode estar relacionado à tentativa das células de diminuírem a quantidade intracelular de espécies reativas de oxigênio mantida pela diminuição da atividade destas enzimas 24 horas pós infecção. Surpreendentemente, o silenciamento da catalase exacerbou a infecção do P. vivax. Este resultado pode ser correlacionado com a produção de uma rede de ditirosina que protegeria os parasitos da resposta imune do inseto. Nossos resultados apontam mecanismos imunes adotados pelo A. aquasalis para combater o P. vivax, fornecendo informações importantes sobre moléculas envolvidas no processo de interação e imunidade deste vetor de malária no Brasil com seu parasito. / Each year, malaria affects 300 million people worldwide, causing 1 million deaths. In Brazil, 450,000 cases are reported annually. Recently, many studies have attempted to identify molecules that mediate the interaction mosquito-parasite. Anopheles aquasalis is the most important vector of malaria in the coastal regions of Brazil and the etiological agent Plasmodium vivax causes most cases of the disease. This study aims examining molecules that participate in the interaction between these two organisms. For this, two strategies were used: cDNA subtraction and PCR using degenerate primers. The subtractive libraries were produced from samples of A. aquasalis 2 and 24 hours after blood feeding or infection by P. vivax. After analyzes of cDNAs, differences were observed in gene expression between A. aquasalis fed with blood or infected blood at both times investigated. The expression of some candidates obtained through subtraction cDNA (serine protease, fibrinogen, carboxypeptidase and bacteria responsive protein genes) were confirmed using real time PCR. For example, the expression of a cecropin decreased after P. vivax infection while a serpin presented increased expression. Analysis of a transcription factor, GATA, revealed an increase in the mRNA levels 36 hours after infection. Silencing of this gene produced increased infection, demonstrating the importance of this transcription factor for the insect's immune response against P. vivax. In parallel, A. aquasalis cDNA sequences for the JAK-STAT pathway [transcription factor STAT, protein inhibitor of activated STAT (PIAS) and nitric oxide synthase (NOS)] and for genes related to cellular detoxification (catalase and two superoxide dismutases) were obtained using degenerate primers. Results of expression of these genes revealed that STAT, PIAS and NOS are induced by infection with P. vivax and reverse genetics experiments have shown that this pathway is important in the immune response of A. aquasalis against P. vivax. Regarding the detoxification enzymes, an increase in mRNA expression was observed 36 hours after infection and a decrease in activity 24 hours after infection. This increase in mRNA 36 hours after infection may be related to the attempt of cells to decrease the amount of intracellular ROS due to the diminished activity of these enzymes 24 hours after infection. Surprisingly, the silencing of catalase exacerbated the infection of P. vivax. This result may be correlated with the production of a dytirosine network that protects the parasites from the insect's immune response. Our results indicate immune mechanisms adopted by A. aquasalis to combat P. vivax, providing important information about molecules involved in the process of interaction and immunity of this vector with its Brazilian malaria parasite.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: This study evaluated the influence of infection by Plasmodium vivax on the relations between hematological and biochemical variables and the osmotic stability of the erythrocyte membrane in a Brazilian Amazon population. A total of 72 patients with P. vivax malaria were included in the study and invited to return after 14 days, post treatment with chloroquine and primaquine, for clinical and laboratorial re-evaluations. The osmotic stability of the erythrocyte membrane was analyzed by non-linear regression of the dependency of the absorbance of hemoglobin, released with hemolysis, as a function of the salt concentration, and it was represented by the inverse of the salt concentration at the midpoint of the curve (1/H50) and by the variation of salt concentration, which promotes lysis (dX). Bivariate and multivariate methods were used in the analysis of the results. Prior to treatment of the disease, the erythrocytes showed greater stability, probably due to the natural selection of young and also more stable erythrocytes. The bivariate analysis showed that 1/H50 was positively correlated with red cell distribution width (RDW), urea, triglycerides, and very low-density lipoprotein (VLDL)-cholesterol, but negatively associated with albumin, HDL-cholesterol and indirect bilirubin, while dX was negatively associated with mean corpuscular hemoglobin concentration. These associations were confirmed by canonical correlation analysis. Stepwise multiple linear regression showed that albumin, urea, triglycerides and VLDLcholesterol are the variables with highest abilities of predicting the erythrocyte stability. The bivariate analysis also showed that the hematological index RDW was related to elevated levels of bilirubin and decreased levels of albumin and urea, associated with liver damage resulting from malaria. CHAPTER III: Studies in the Brazilian Amazon region, an endemic area for Plasmodium vivax, has been featured in the characterization of the mechanisms involved in the pathogenesis of infection by this species of Plasmodium. Intense inflammatory response and oxidative stress have been involved in the clinical complications of the disease. However, the exact role of oxidative stress responses in malaria disease is unclear, but certainly the combination of environmental, host and parasite factors are involved in susceptibility and severity of this disease. The present study aimed to evaluate the influence of genetic polymorphisms of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD1 A35C and SOD2 Ala16Val), glutathione peroxidase (GPx1 Pro197Leu), N5,N10- metilenetetrahydrofolate reductase (MTHFR C677T) and NADPH-quinone oxidoreductase (NQO1 C609T) on the oxidative stress responses in patients infected with P. vivax. An evaluation of redox markers profile was performed in 73 P. vivax infected patients at day 1 and day 14 after antimalarial therapy and 30 non-infected individuals. The genotyping of the polymorphic sites for enzymes were performed by PCR/RFLP methods. Associations between genotype and oxidative markers were analyzed by chi-square statistic with determination of relative risk and confidence intervals, adjusted for baseline factors that include gender. The distribution patterns of MTHFR C677T, GPx1 Pro197Leu and SOD2 Ala16Val genotypes is certainly due to the selective pressure that malaria has on human populations from endemic areas. P. vivax patients showed decrease in catalase (Cat) and GPx activities and total antioxidant capacity (TAC), as well as elevated levels of malondialdehyde (MDA) and allantoin. Regarding the polymorphisms, T allele carriers for MTHFR C677T SNP presented lower levels of AST, ALT and GGT, resulting from a possible protective effect against severe liver injury. Wild-type patients for GPx1 Pro197Leu SNP showed lower risk to develop thrombocytopenia. The SOD2 Ala16Val SNP was associated with decreased levels of MDA (reduced lipoperoxidation) and lower Cat and GPx activities. The GPx activity presented an inverse correlation with RDW, a hematological index that is a potential marker of erythropoietic and oxidative stress conditions. / CAPITULO II: Esse estudo avaliou a influência da infeção por Plasmodium vivax nas relações entre variáveis bioquímicas e hematológicas e a estabilidade de membrana de eritrócitos em uma população da Amazônia brasileira. Um total de 72 pacientes diagnosticados com P. vivax foram incluídos no estudo e convidados a retornar 14 dias após o tratamento com cloroquina e primaquina, para reavaliações clínicas e laboratoriais. A estabilidade osmótica da membrana do eritrócito foi analisada por regressão não-linear da dependência da absorbância de hemoglobina, liberada com a hemólise, em função da concentração de NaCl, e foi representada pelo inverso da concentração de sal no ponto médio da curva (1/H50) e pela variação da concentração de sal necessária para promoção de lise completa (dX). Métodos de estatística bivariada e multivariada foram utilizados na análise dos resultados. Antes do tratamento da doença, os eritrócitos apresentaram maior estabilidade, provavelmente devido à seleção natural de eritrócitos jovens e mais estáveis. A análise bivariada revelou que 1/H50 apresentou correlação positiva com RDW, ureia, triglicerídeos e VLDL, mas estava negativamente associado com albumina, HDL e bilirrubina indireta, enquanto dX apresentou correlação negativa com MCHC. Essas associações foram confirmadas por análises de correlação canônica. A regressão linear múltipla do tipo stepwise mostrou que albumina, ureia, triglicerídeos e VLDL representam um grupo de variáveis com melhor capacidade de predizer a estabilidade do eritrócito. A análise bivariada também mostrou que o índice hematológico RDW foi relacionado a elevados níveis de bilirrubina e diminuição dos níveis de albumina e ureia, em decorrência dos danos hepáticos provocados pela malária. CAPITULO III: Estudos na região amazônica brasileira, área endêmica para Plasmodium vivax, têm se concentrado na caracterização dos mecanismos envolvidos na patogênese da infecção por essa espécie de Plasmodium. Intensa reposta inflamatória e estresse oxidativo têm sido envolvidos nas complicações clínicas da doença. Entretanto, o papel exato do estresse oxidativo na doença malárica é incerto, mas a combinação de fatores do ambiente, do hospedeiro e do parasita está envolvida na susceptibilidade e severidade dessa doença. O presente estudo teve o objetivo de estudar a influência de polimorfismos genéticos das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD1 A35C e SOD2 Ala16Val), glutationa peroxidase (GPx1 Pro197Leu), N5,N10- metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR C677T) e NADPH-quinona oxidoredutase (NQO1 C609T) na resposta do estresse oxidativo em pacientes infectados com P. vivax. Avaliação do perfil dos marcadores redox foi realizada em uma amostra de 73 pacientes infectados por P. vivax no dia 1 e dia 14 após tratamento com antimaláricos, e em 30 indivíduos não infectados. A genotipagem dos sítios polimórficos para as enzimas foi realizada pelo método da PCR/RFLP. Associações entre genótipo e marcadores oxidativos foram analisados pelo método do qui-quadrado com determinação dos riscos relativos e intervalos de confiança, ajustados para características básicas como gênero. A distribuição da frequência dos genótipos para MTHFR C677T, GPx1 Pro197Leu e SOD2 Ala16Val é certamente devida à pressão seletiva que a malária exerce nas populações em áreas endêmicas. Pacientes infectados apresentaram diminuição nas atividades enzimáticas de Cat e GPx e da capacidade antioxidante total (TAC), bem como níveis elevados de malondialdeído (MDA) e alantoína. Com relação aos polimorfismos, portadores do alelo T para a MTHFR C677T apresentaram níveis menores de AST, ALT e GGT, resultante de um possível efeito protetor contra o comprometimento hepático grave. Pacientes com genótipo selvagem para a GPx1 Pro197Leu mostraram menor risco de desenvolver trombocitopenia. A SOD2 Ala16Val foi associada à diminuição dos níveis de MDA (lipoperoxidação reduzida) e menor atividade enzimática de Cat e GPx. A atividade de GPx apresentou uma correlação inversa com o RDW, índice hematológico considerado potencial marcador de condições de estresse oxidativo e eritropoiético. / Doutor em Genética e Bioquímica

The experiment discussed in the next chapter was to confirm the aforementioned bystander effect. In the first experiment we separated hosting and non-hosting mRBCs by the percol purification method and then measured the corner frequencies of them. The mean fc of the distribution is almost the same, and this confirms the effect of the parasite on the non-hosting mRBC. In the next experiment, we have incubated nRBCs in the spent media and measured the corner frequency at six-hours intervals to see how the fc changed with the incubation time. The results showed that within 24 hours, the fc of the incubated nRBCs increases to the level of the iRBCs. The fact that nRBCs are getting affected by the spent media indicates that some substances must be released in the spent media which alter the physical properties of the nRBCs. This kind of effect on non-host mRBCs was previously observed by some earlier works [Dondorp97, Sabolovic91a, Bambardekar08]. It has also been recently shown that the rosetting of the host mRBCs to the non-host mRBCs is also activated by the substances released in the medium [Handunnetti89, Wahlgren89], which are also somewhat similar to the bystander effect observed by us. In addition to this, there are reports which suggest that sickle cell disease also shows binding properties [Roseff08, Zhang12] which may be due to the substances released in the medium. So it was already observed that the released substances induced changes in the properties of RBCs, but our study gives a direct confirmation of the same. The next study was to find out the released substances which were responsible for the observed changes above. We incubated infected and uninfected RBCs in different drugs. Then, we measured them to see what kind of changes occur in the corner frequency of the incubated RBCs. The corner frequency of normal RBCs incubated in db-cAMP shows the maximum change. So the released substance that is responsible for the bystander effect may be due to the db-cAMP. All the experiments above were done using samples cultured only in the lab. Since the environment of the blood taken directly from the patient may differ from the one that is cultured in the lab, it is natural to find out if similar kinds of changes can be observed in the clinical sample or not. The study in chapter 6 was targeted to find out the same. We took clinical samples from BMRI for patients having a confirmed malaria infection by both P. falciparum and P. vivax. This also provided us the opportunity to work with the P. vivax infected sample as it is very difficult to culture them in the lab. The results shown in this chapter clearly indicate that similar kinds of changes occur in the clinical sample also. It is worth noting that even though P. vivax infects only immature RBCs (reticulocytes), changes were also observed in P. vivax samples. This gives us another strong confirmation about the previously observed bystander effect. This also indicates that this technique can be used as a tool to diagnose malaria. Although we cannot differentiate between P. falciparum and P. vivax, this technique combined with other well established techniques can give us more confirmation. So, in all the experiment above we have shown an easy and novel technique which can be used to differentiate between normal and malaria-infected RBCs. We have also observed the bystander effect and tried to find out the released substances which are responsible for this effect. We have shown that this technique can use the bystander effect of malaria to identify malaria. It has also been shown that the RBCs taken from the patient sample also show the same changes as the cultured samples, which gives us the possibility that this technique can be used as a diagnostic tool combined with other technique. This technique can also be used in experiments like the effects of drugs and to find out drugs for diseases like malaria. Future outlook 1. We have observed the changes only for malaria. There may be other diseases like sickle cell anemia which can also alter the corner frequency of the distribution of RBCs. We have to find out the specificity of the observed changes. 1 We can directly measure the elasticity of RBCs using dual traps in optical tweezers to find out the effect of different infections and drugs on the rigidity of RBCs and compare the with the data above. 2 We can also study other cells using the same method to see if we can find out any difference between healthy and unhealthy cells.

Thesis (Ph. D.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2005. / Typescript (photocopy).