Insetos vetores apresentam diminuição na produção de ovos quando infectadas por plasmódios. Esse fenômeno foi demonstrado em diferentes modelos de laboratório utilizando mosquitos Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Anopheles stephensi. Durante o desenvolvimento de Plasmodium gallinaceum ocorrer alterações em diferentes processos fisiológicos de Aedes aegypti, tais como redução nos níveis de ecdisona (precursora do hormônio 20-hidroxiecdisona) na hemolinfa e alterações nos níveis transcricionais em genes envolvidos com vitelogênese, transporte de lipídeos e resposta imune. Os dados obtidos também mostram alterações nas quantidades de proteínas hemolinfáticas minoritárias e majoritárias em fêmeas infectadas. Embora maior parte do desenvolvimento do parasita acontece no trato digestivo, outros tecidos como corpo gorduroso, ovários e hemolinfa são afetados. Além disso, nossos dados sugerem fortemente que o parasita utiliza a lipoforina como fonte nutricional durante a esporogonia. / Insect disease vectors show decreased fecundity when infected with Plasmodium. This phenomenon has already been demonstrated in laboratory models such as Aedes aegypti, Anopheles gambiae and Anopheles stephensi . Some physiological processes of Aedes aegypti suffer changes when the vector is infected with Plasmodium gallinaceum . The ecdysone (20-hidroxyecdysone hormone precursor) level in the hemolymph is reduced and genes involved on vitellogenesis, lipid transport and immune response have their transcriptional pattern changed. The data obtained also show that these modifications also occur with major and minor hemolymph proteins. The fat body, ovaries and hemolymph are affected during infection, even though, the parasite development occurs mainly in the midgut. In addition, our results strongly suggest that parasites use lipophorin as a nutritional source for sporogony.

Nesta tese estudamos os repertórios das famílias multigênicas var (domínio DBLa), rif e stevor, importantes fatores de virulência, de Plasmodium falciparum em isolados brasileiros. Mostramos que estas famílias multigênicas podem ser conservadas entre diferentes isolados no Brasil, sugerindo que o repertório de genes variantes pode ser limitado em algumas localidades. Identificamos menos polimorfismos nos genes stevor que os genes var ou rif. Constatamos que genes var podem ser conservados ao longo do tempo em isolados brasileiros. Identificamos também os domínios DBLa e DBLb de genes var associados a citoaderência a CHOICAM1 em isolados de Rondônia. Mediante ensaios de ELISA, mostramos que domínios DBLbICAM foram reconhecidos de modo heterogêneo. Por citometria de fluxo, demonstramos que o parasita aderente em ICAM1 foi reconhecido majoritariamente pelo plasma de pacientes com infecção sintomática e menos de infecção assintomática. Além disso, identificamos por PCR em tempo real os genes var transcritos no clone 3D7 aderente em diferentes linhagens de células CHO. / Herein, we studied the repertoire of multigenic families of var (DBLa domain), rif and stevor from brazilian isolates of Plasmodium falciparum. We showed that these multigenic families could be conserved among different isolates from Brazil, suggesting that the repertoire of variant genes can be limited in certain areas. We identified less polymorphism in stevor genes than in var or rif genes. We also demonstrated that var genes can be conserved over time in Brazilian isolates and identified the DBLa and DBLb domains from var genes associated with cytoadherence to CHOICAM1 in Rondonian isolates. ELISA assays showed that these DBLbICAM domains were recognized in a heterogeneous fashion. By flow cytometry, we demonstrated that ICAM1-adherent parasites were stronger recognized by plasma from symptomatic infections than from non-symptomatic infections. Finally, we profiled the var gene transcripts in 3D7 parasites adherent to different CHO cells by real time PCR.

A malária apresenta um alto índice de mortalidade com mais de 500 mil mortes registradas em 2013. Para agravar a situação de saúde pública, foi descrito o surgimento de resistência às drogas usadas na terapêutica da doença. Torna-se necessário a identificação e o estudo de novos alvos antimaláricos. A via MEP se mostra como um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas contra P. falciparum uma vez que está ausente em humanos. Nossos objetivos foram avaliar a função da vitamina E biossintetizada pelo parasita, caracterizar a biossíntese de vitamina K1 e o metabolismo de fitol. Esse estudo determinou que a vitamina E biossintetizada pelo parasita atua no sistema redox do parasita. Por outro lado, mostramos que a biossíntese de vitamina K1 é ativa no parasita e detectamos sua forma reduzida. Por fim, observamos que existe uma via de reaproveitamento de fitol em P. falciparum assim como em plantas. O estudo abre oportunidades para um desenvolvimento racional de novos antimaláricos e aprofunda o conhecimento na biologia do parasita. / Malaria has the highest mortality rate with more than 500 000 deaths in 2013. The public health situation gets worse because it has been described the emergence of resistance to common drugs used in the treatment of disease. It is necessary to identify and study of new antimalarial targets. The MEP pathway is a potential target for drug development against Plasmodium falciparum once it is absent in humans. Our objectives were to evaluate the function of vitamin E biosynthesized by the parasite and characterize the biosynthesis of vitamin K1 and the phytol metabolism. This study determined that vitamin E biosynthesized by the parasite operates in the redox system of the parasite. We show the biosynthesis of vitamin K1 is active on parasite and we detected its reduced form. Finally, we demonstrate that there is a phytol salvage pathway in P. falciparum as well as plants. The study opens opportunities for the rational development of new antimalarials and deepens knowledge on parasite biology.

La plasmodione est une benzylmenadione (bMD) qui a été désignée comme inhibiteur subversif de flavoenzymes. Ces enzymes utilisent FAD comme co-facteur et sont impliquées dans de nombreux processus biologiques, et notamment dans le maintien de l’homéostasie redox par les systèmes thiorédoxine et glutathion. La plasmodione présente une forte activité contre P. falciparum in vitro, elle est actif sur tous les stades asexués, préférentiellement sur les stades anneaux, avec une vitesse d’élimination des parasites très rapide. Mon objectif a été de tester sa capacité à bloquer la transmission du parasite murin au moustique et de contribuer à déterminer son mode d’action. Pour ce faire, j’ai dans un premier temps mis au point de nouveaux protocoles. Mes résultats ont démontré que (i) la plasmodione réduit le développement du parasite in vivo et limite la transmission du parasite au moustique en agissant sur tous les stades parasitaires sexués infectieux pour le moustique ; (ii) qu’un dérivé de la même famille, plus soluble, est beaucoup plus efficace, notamment sur les stades sexués et la transmission ; (iii) que lorsqu’ils sont délivrés directement au moustique, il n’y a aucun effet du bleu de méthylène ou de la plasmodione sur la survie des moustique ; (iv) enfin en utilisant des parasites invalidés pour la GR, la GS, la γGCS ou la GluPho, mes résultats suggèrent que le modèle d’action proposé des bMDs est à revoir, et que d’autres flavoenzymes pourraient être la cible. / Plasmodione is a benzylmenadione, synthetized as a flavoenzyme inhibitor. These enzymes use FAD as a cofactor and are involved in numerous biologic processes, including the regulation of the redox equilibrium through thioredoxin and glutathione metabolisms. Plasmodione is very efficient in vitro against all stages of the human parasite P. falciparum, especially on ring stages, and is a fast killer. The aims of my PhD were to monitor the ability of Plasmodione to block parasite transmission to mosquitoes and to characterized its mode of action. For that, I had to implement new protocols. My results showed (i) that Plasmodione decrease both the parasite development in vivo and its transmission to mosquitoes while acting on every sexual stage infectious for the mosquito. (ii) A derivative from the same chemical family, more soluble, is more efficient than Plasmodione, especially on asexual stages and on transmission. (iii) When compounds are directly deliver into mosquitoes, neither methylene blue or Plasmodione have an effect on the survival. (iv) Finally, the use of knock out parasites for the GR, GS, γGCS or GluPho genes suggest that the proposed mode of action of the benzylmenadiones has to be corrected and other flavoenzymes could be targeted rather than GR.

As células T CD4+ do baço são importantes na proteção frente à malária através de mecanismos mediados pelas citocinas do perfil Th1. Neste trabalho observamos o aumento das células NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b por baço nos camundongos C57BL/6, que apresentam o fenótipo de células ativadas, produzem IFN-<font face=\"Symbol\">g, expressam de níveis altos de Fas e PD-L1 que correlaciona com a baixa capacidade proliferativa na fase aguda da infecção pelo Plasmodium chabaudi AS. As células T CD4+ convencionais são a principal subpopulação de células T ativadas na resposta imune frente à infecção, que se desenvolve em duas fases consecutivas concomitantemente com as parasitemias aguda e crônica. Na fase aguda da infecção, a resposta das células T CD4+ convencionais é intensa e de curta duração, com produção grandes quantidades citocinas com cinética semelhante às células T CD4+ não-convencionais. Dessa maneira, as células T CD4+ convencionais possuem um papel central no início da resposta ao P. chabaudi, respondendo em paralelo com as células T não-convencionais como uma ponte entre a imunidade inata e adquirida. / Spleen CD4+ T cells have an important role for protection against malaria through mechanisms mediated by Th1 cytokines. We observed that the increase in NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b cell numbers per spleen in C57BL/6 mice, show an activated cell phenotype, with high expression of Fas and PD-L1 correlating with their low proliferative capacity and produce IFN-<font face=\"Symbol\">g during the acute P. chabaudi infection. We show that conventional CD4+ T cells are the main activated T cells subpopulation in the immune response to infection, which develops in two consecutive phases concomitantly with acute and chronic parasitemias. In the acute phase, the conventional CD4+ T cell response is intense and short-lasting, rapidly providing proinflammatory. Taken together, these results indicated the central role of conventional CD4+ T cells during P. chabaudi malaria, acting in parallel with non-conventional CD4+ T cells as a link between innate and acquired immunity.

A partir de isolados de campo de P. falciparum de pacientes sintomáticos e assintomáticos de uma mesma área endêmica brasileira, clonamos fragmentos de genes surf e dos genes das proteínas do merozoíto AMA1 e das famílias MSP e EBL. Expressamos todas as sequências diferentes encontradas fusionadas a GST. Por ELISA, testamos a positividade para IgG dos plasmas das mesmas amostras de sangue e identificamos as subclasses de IgG nos plasmas mais reativos e a duração da resposta de IgG em um subgrupo de plasmas. A odds ratio conferida pela resposta humoral contra MSP5, MSP9 e SURFIN 13.1 mostrou 9x menos chances para os dois primeiros e 3,5x menos chances para o terceiro para a presença de sintomas, através da análise de tabelas de contingência. A odds ratio conferida pela resposta humoral mais intensa a MSP5 e EBA175 aponta respectivamente, 9,4x e 5,7x mais chances de desenvolvimento do perfil assintomático, por regressão logística. Paralelamente, verificamos por RT-qPCR que pode ocorrer switching transcricional e talvez exclusão alélica na expressão de genes surf. / Using field P. falciparum isolates present in the blood of symptomatic and asymptomatic patients from the same endemic Brazilian area, we cloned and expressed all different sequences of surf genes and those encoding merozoite antigens AMA1, MSP1-10 and members of the EBL protein family as GST fusion peptides. We identified plasmas positive for specific IgG and their subclasses in the most reactive plasmas and the longevity of the response in a lot of plasmas by ELISA. The odds ratio conferred by antibodies against MSP5, MSP9 and SURFIN 13.1 pointed to 9x fewer chances of the first two and 3,5x fewer chances of the last for presence of malaria symptoms by cross tab analysis. The odds ratio conferred by the higher quantity of antibodies against MSP5 and EBA175 pointed to 9,4x and 5,7x higher chances for development of an asymptomatic profile by logistic regression. In parallel, transcription analysis of surf genes in the P. falciparum strain 3D7 verified by RT-qPCR pointed to a mechanism reminiscent of allelic exclusion.

A malária é responsável por cerca de 207 milhões de casos e 627 mil óbitos em todo o mundo. No Brasil, em 2013, foram registrados mais de 167 mil casos. Um dos grandes desafios para o controle da doença é o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos. Dentre as cinco espécies que podem causar malária em seres humanos, Plasmodium falciparum é a que apresenta maior habilidade de desenvolver resistência a quase todas as classes de medicamentos utilizados no tratamento. Estudos com marcadores moleculares têm associado mutações em diversos genes à resistência aos antimaláricos. A mutação K76T no gene pfcrt é relacionada à resistência à cloroquina. Mutações em pfmdr1 e aumento de seu número de cópias foram associados à resistência a diversos antimaláricos, como quinino, mefloquina e derivados de artemisinina. A resistência aos antifolatos é associada a mutações nos genes pfdhfr e pfdhps. Mutações nos genes pfATPase6 e pfAP2-u têm sido relacionadas à diminuição de sensibilidade à artemisinina. O monitoramento dessas mutações e suas associações às respostas in vivo e in vitro aos antimaláricos pode contribuir para a escolha de terapêutica para o controle da doença. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil genético relacionado à resistência em P. falciparum ao longo de 27 anos. Foram analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período entre 1984 e 2011, de pacientes atendidos em serviços de saúde nos estados do Pará e São Paulo, com infecções provenientes principalmente de países da América do Sul e África. A análise do gene pfcrt mostrou frequência de 100% da mutação K76T nas amostras de países da América do Sul ao longo das décadas analisadas. Este resultado é concordante com o fenótipo de resistência à cloroquina observado em 100% das amostras testadas in vitro para sensibilidade a este antimalárico. Amostras de países africanos apresentaram o genótipo selvagem em infecções únicas ou mistas. Com relação ao gene pfmdr1, a análise do códon 86 mostrou surgimento do mutante 86Y na última década em amostras da América do Sul e ocorrência de alelos selvagens e mutantes em amostras da África. Na análise do códon 1246 foi observada predominância do mutante 1246Y nas amostras sul-americanas e do selvagem D1246 nas africanas. Com relação ao gene pfdhfr, as amostras brasileiras apresentaram frequência de 100% dos mutantes 51I e 108N. O mutante 59R não foi observado no período 1980-1990, mas estava presente em 22,6% das amostras de 2000-2010. A análise do gene pfdhps das amostras brasileiras mostrou frequência de 100% do mutante 437G em todas as décadas e diminuição da frequência de 540E no período 2000-2010 em relação aos anteriores. O sequenciamento do gene pfATPase6 revelou a ocorrência de mutações que já haviam sido relatadas anteriormente, porém seu papel na resistência aos derivados de artemisinina ainda não foi elucidado. Na análise do gene pfAP2-? foram observadas duas novas mutações. Não foram observadas associações entre as mutações estudadas e a resposta in vivo e in vitro à mefloquina, quinino e derivados de artemisinina. Este estudo permitiu a avaliação do perfil genético de P. falciparum, com análise de marcadores moleculares relacionados à resistência a diversos antimaláricos, em amostras coletadas ao longo de 27 anos em que o parasito foi submetido à pressão de diferentes esquemas terapêuticos adotados no Brasil / Malaria is responsible for 207 million cases and 627 thousand deaths worldwide. In Brazil, in 2013, more than 167 thousand cases were reported. The major challenge for malaria control is the emergence and spread of resistance to antimalarials. Among the five species able to cause malaria in humans, Plasmodium falciparum presents ability to develop resistance to almost all classes of drugs for malaria treatment. Studies with molecular markers have associated mutations in several genes to antimalarial resistance. The mutation K76T in pfcrt is related to chloroquine resistance. Polymorphisms in pfmdr1 and increased copy number were associated to several antimalarials resistance, such as quinine, mefloquine and artemisinin derivatives. Resistance to antifolates is associated to mutations in pfdhfr and pfdhps genes. Mutations in pfATPase6 and pfAP2-u were linked to decreased sensibility to artemisinins. The monitoring of these mutations and their association with in vivo and in vitro responses may contribute to the choice of therapeutics for malaria control. The aim of the present study was to analyze the genetic profile related to resistance in P. falciparum over twenty-seven years. Samples collected from 1984 to 2011 from patients enrolled at health facilities in Para and Sao Paulo States were assessed. The origin of infections was mainly from South America and Africa countries. Pfcrt analysis showed that all samples from South America countries harbored the K76T mutation over the four decades, in agreement with the resistant phenotypic response of samples tested in vitro for chloroquine. African samples presented the wild type in mixed or single infections. Regarding to the pfmdr1 gene, the emergence of the mutant 86Y was observed in the last decade in South American samples and occurrence of both, mutant and wild type, in African ones. The analysis of 1246 showed only the mutant 1246Y in South American samples and the wild type D1246 in samples from Africa. Regarding to pfdhfr gene, the frequency of mutants 51I and 108N was 100% in Brazilian samples. The mutant 59R was not observed in the period 1980-1990 and it was present in 22.6% in samples from 2000-2010. The mutant 437G of pfdhps gene was observed in 100% of Brazilian samples in all decades and the frequency of mutant 540E decreased in the period 2000-2010 when compared to 1980-1990. The sequence analysis of pfATPase6 gene showed mutations previous described, but their role in artemisinin resistance is not well defined. Two novel mutations were observed in pfAP2-? gene. No association between the polymorphisms studied and in vivo or in vitro responses to mefloquine, quinine and artemisinin derivatives was observed. This study enabled the knowledge of P. falciparum genetic profile regarding to mutations related to resistance in samples collected over twenty-seven years, when the parasite was exposed to selective pressure of several therapeutic schemes adopted in Brazil

Uma família multigênica, polimórfica, ainda pouco conhecida de P. falciparum é a família SURFIN, codificada por dez genes denominados surf. Para abordar o modo de transcrição desses genes e observar se ocorre switching transcricional, monitoramos a quantidade de transcritos analisando amostras por RT-qPCR ao longo de 40 reinvasões. O gene surf 4 foi claramente detectado em nossos ensaios, apresentando quantidade significativa de transcritos na fase esquizonte. Para analisar a localização e função de SURFIN 4, construímos linhagens transgênicas (por fusão à GFP) e por fusão de um domínio desestabilizador (DD24) que permite de forma controlada, desestabilizar a proteína e analisar a sua importânica. Não houve alteração na viabilidade dos parasitas com SURFIN 4 desestabilizado, no entanto detectamos um aumento significativo de transcritos quando SURFIN 4 foi diminuída. Estes achados apontam para um novo mecanismo de regulação gênica, ao menos para o gene surf 4 onde a proteína SURFIN 4 parece ser capaz de modular a quantidade do seu respectivo transcrito. / One smaller family of antigen variant of P. falciparum whose function is still unknown is surf genes. Some members appear in asexual blood stage forms and may be associated also to virulence associated processes. We accessed the transcription of the members of the surf gene family along multiple invasions by real time PCR. Based on the observation of constitutive expression of one surf gene, surf4.1, we created a parasite line which expresses a GFP, conditionally destabilized SURFIN4.1 protein. Upon destabilization of the protein, no differential growth rates were observed. However, when we monitored the transcription of SURFIN4.1 knocked-down parasites compared to their stabilized counterparts, we observed a strong increase in the transcript quantities of surf4.1 and also three other surf genes, pointing to a feedback of the SURFIN protein quantity to either the stability of surf transcripts or the transcriptional activity of surf loci. This type of potential regulation is yet unheard in Plasmodium biology.

Estudamos o papel de quinases de Plasmodium na modulação, via derivados de triptofano, no ciclo celular do parasita. Foram realizadas análises com melatonina, N-acetilserotonina, triptamina e serotonina, avaliadas através de microscopia e citometria de fluxo. Parasitas deficientes para as proteínas PfNEK2, PfNEK3 e PfMAP1 apresentaram respostas similares ao parasita selvagem enquanto pfpk7- e pfeik1- não apresentaram resposta aos compostos indólicos. Estes dados sugerem envolvimento das quinases PfPK7 e PfeIK1 na transdução de sinal via compostos derivados de triptofano na modulação do ciclo intraeritrocítico em P. falciparum. Ensaios de medidas de cálcio intracelular mostraram que a ausência de pfpk7- leva a uma atenuação na liberação de cálcio promovida por melatonina, sugerindo que a ativação desta quinase é importante no aumento de cálcio citosólico. Estes resultados ampliaram a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam resposta a melatonina. / We evaluated the role of Plasmodium kinases in the modulation, via tryptophan derivatives, of the parasite cell cycle. We performed analysis with melatonin, N-acetylserotonin, tryptamine and serotonin through blood smears and flow cytometry analyzes. Parasites deficient in the proteins PfNEK2, PfNEK3 and PfMAP1 showed similar responses to the wild type while pfpk7- e pfeik1- did not respond to the indolic compounds. This data suggest the involvement of the kinases PfPK7 and PfeIK1 in melatonin signal transduction for cell cycle modulation in P.falciparum. Intracellular calcium measurement assays showed that pfpk7- diminished the ability of melatonin to rise cytosolic calcium concentration, suggesting that this kinase is involved with cytosolic calcium increase. These results expand the understanding of the molecular mechanisms that regulate melatonin-dependent cell cycle modulation.

A imunidade inata que o mosquito apresenta tenta combater os patógenos dentro do organismo do mosquito impedindo que este seja transmitido para outros hospedeiros. A resposta celular apresenta três diferentes processos: fagocitose, encapsulamento e formação nodular, todos estes processos buscam eliminar os patógenos. Peptídeos antimicrobianos fazem parte da resposta humoral do mosquito, sendo codificados por genes e secretados por diversos tipos celulares. Um peptídeo novo pouco conhecido descoberto em Anopheles gambiae, a gambicina, demonstrou bons resultados no combate de parasitas. Na infecção por Plasmodium galleceum, não há diferença significativa na expressão deste peptídeo entre o grupo controle e infectado nos intervalos analisados. Na infecção por vírus dengue, sorotipo 2, a gambicina não apresenta diferença significativa no intervalo de 24 horas após a infecção, quando comparamos grupo controle e infectado, nos intervalos de 7 dias e 14 dias após a infecção, a expressão da gambicina é maior no grupo controle quando comparemos com o grupo infectado. / Innate immunity presents a mosquito tries to combat the pathogens inside the body of the mosquito preventing it from being transmitted to other hosts. The cellular response has three different processes: phagocytosis, encapsulation and nodule formation, all these processes seek to eliminate pathogens. Antimicrobial peptides are part of the humoral response mosquito being encoded by genes and secreted by several cell types. A little known new peptide discovered in Anopheles gambiae, the gambicina showed good results in controlling pests. In Plasmodium infection galleceum, there is no significant difference in the expression of this peptide between the control group and infected in the analyzed intervals. In infection with dengue virus serotype 2, the gambicina no significant difference within 24 hours after infection when comparing the control group and infected at intervals of 7 days and 14 days after infection, the expression is higher in gambicina control group when compare to the infected group.