Para examinar como o nível de diversidade genética de Plasmodium vivax em uma comunidade varia no tempo e no espaço, investigamos a dinâmica de polimorfismos do parasito durante as primeiras fases de ocupação de um assentamento agrícola na Região Amazônica brasileira. A caracterização por microssatélites de 84 isolados de P. vivax, colhidos ao longo de três anos, revelou uma diversidade genética de moderada a alta (heterozigosidade esperada média, 0,699), com uma grande proporção (78,5%) de infecções por múltiplos clones (IMC), mas também um forte desequilíbrio de ligação (DL) consistente com um raro cruzamento entre os haplótipos. Observamos uma pequena influência temporal na diversidade genética dos haplótipos do parasito e nenhum padrão de distribuição espacial dos mesmos. Em amostras consecutivas colhidas de um mesmo indivíduo observou-se uma intensa renovação de haplótipos ao longo do tempo. Um único haplótipo foi compartilhado por três indivíduos cujas amostras foram colhidas durante um surto; todos os outros 81 haplótipos foram recuperados apenas uma vez. A menor diversidade parasitária, com a menor proporção de IMC e um DL mais intenso, foi observada no momento do surto, fornecendo um claro exemplo de uma estrutura populacional epidêmica de um patógeno humano. Todos os parâmetros populacionais retornaram aos valores prévios ao surto durantes os últimos anos de estudo, apesar da queda concomitante na transmissão de malária. Sugerimos que a genotipagem do parasito pode ser útil para monitorar a propagação de novas linhagens do parasito associadas a surtos em áreas que se aproximam da eliminação da malária. / To examine how community-level genetic diversity of the malaria parasite Plasmodium vivax varies across time and space, we investigated the dynamics of parasite polymorphisms during the early phases of occupation of a frontier settlement in the Amazon Basin of Brazil. Microsatellite characterization of 84 isolates of P. vivax sampled over 3 years revealed a moderate to high genetic diversity (mean expected heterozygosity, 0.699), with a large proportion (78.5%) of multiple-clone infections (MCI), but also a strong multilocus linkage disequilibrium (LD) consistent with rare outcrossing. Little temporal and no spatial clustering was observed in the distribution of parasite haplotypes. A single microsatellite haplotype was shared by 3 parasites collected during an outbreak; all other 81 haplotypes were recovered only once. The lowest parasite diversity, with the smallest proportion of MCI and the strongest LD, was observed at the time of the outbreak, providing a clear example of epidemic population structure in a human pathogen. Population genetic parameters returned to preoutbreak values during last 2 years of study, despite the concomitant decline in malaria incidence. We suggest that parasite genotyping can be useful for tracking the spread of new parasite strains associated with outbreaks in areas approaching malaria elimination.

A colina quinase, 1ª enzima de uma via que forma 45% da membrana de P. falciparum foi clonada, expressa e purificada, e um anticorpo policlonal desenvolvido. Estudos de transporte da enzima demonstraram que a PfChok é transportada para o citossol por uma via independente do inibidor Brefeldina A. Obteve-se informação da estrutura secundária e uma modelagem da estrutura terciária da proteína, tendo sido localizados sítios de fosforilação para proteínas quinases. Através de uma nova abordagem em genômica funcional de Plasmodium, o gene da proteína adaptadora PfRACK foi códon otimizado e inserido em células de mamíferos. Estudos de dinâmica de Ca2+ em microscopia confocal indicaram que sua sinalização nas células estudadas é inibida na presença de PfRACK, dependente da interação direta com receptores de IP3. A enzima localiza-se distintivamente em relação à RACK1 endógena. Nossos resultados abrem a possibilidade de novos estudos, ao estabelecer a transfecção de genes do parasita para estudos de mecanismos de transdução de sinal na interação Plasmodium-hospedeiro. / Choline Kinase, the first enzyme of a pathway responsible for up to 45% of Plasmodium falciparum parasite membrane, was cloned, expressed and purified, and a policlonal antibody was developed to follow its localization along the intraerythrocytic cycle. The enzyme is transported to parasite´s cytosol, through a pathway independent of the Endoplasmic Reticulum to Golgi apparatus. Information about the secondary structure was obtained, as well a model of the tertiary structure, where several kinases phosphorylation sites were identified. The PfRACK gene was codon-optimized and transfected in mammalian cells. Dynamic Ca2+ studies by confocal microscope have revealed that Ca2+ signaling of the transfected cells was inhibited by PfRACK, dependent on direct interaction with InsP3 receptors. The protein co-localizes distinctly of the endogenous RACK1. Our results open new possibilities of malaria functional genomics, by establishing the transfection of parasites genes into mammalian cells with the aim to study transduction signals mechanisms of the Plasmodium-host interaction.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O parasitismo é uma importante força seletiva em populações, assim como a competição e a predação. Os parasitos sanguíneos podem afetar a coloração da plumagem, a seleção sexual e o sucesso reprodutivo em aves. As aves da região Antártica têm sido mencionadas na literatura como livres de hemoparasitos. A Baía do Almirantado, na Ilha Rei George, Península Antártica, é a maior Baía da região, abrigando diferentes espécies de aves durante o período reprodutivo. Dentre elas, estão duas espécies de skuas, as mais frequentes da Antártica, skua-sub-antártica (Catharacta lonnbergi) e skua-polar-do-sul (C. maccormicki) e três espécies de pinguins, pinguim-antártico (Pygoscelis antarctica), pinguim-papua (P. papua) e pinguim-de-adélia (P. adeliae). Skuas e pinguins são aves que se dispersam durante o inverno austral, podendo ser potenciais reservatórios e transmissores de parasitos, embora resultados negativos de hemoparasitos tenham sido encontrados para diversas outras aves marinhas e também para a região Antártica. O objetivo do presente trabalho foi investigar a presença de hemoparasitos em pinguins e skuas antárticos na Baía do Almirantado. Amostras de lâminas de esfregaço sanguíneo e de sangue para análises moleculares de pesquisa de Plasmodium/Haemoproteus foram coletadas em dois períodos reprodutivos, de dezembro de 2010 a março de 2011 e de dezembro de 2011 a fevereiro de 2012. Um total de 185 amostras de aves foram coletadas, incluindo 120 pinguins e 65 skuas. Skuas foram tiveram resultados negativos para hemoparasitos. As três espécies de pinguins foram positivas para Plasmodium/Haemoproteus , via técnica molecular, incluindo dois P. papua,dois P. antarctica etrês P. adeliae. Apenas um indivíduo confirmado positivo pela técnica molecular, pertencente a P. papua, foi positivo utilizando a técnica de esfregaço sanguíneo, com diagnóstico de Plasmodium sp. Não houve diferença significativa entre indivíduos machos e fêmeas das espécies parasitadas, assim como entre adultos e filhotes. As aves parasitadas (n=7), foram categorizadas abaixo do peso (n=5) e acima do peso (n=2). O presente estudo é o primeiro a relatar hemoparasitos na região Antártica e também é o primeiro registro de presença de hemoprotozoários para as três espécies de pinguins analisadas. A ausência de hemoparasitos em aves antárticas tem sido justificada pela ausência de potenciais vetores na região. Portanto, é possível que os pinguins parasitados tenham adquirido a infecção durante a dispersão por ocasião do inverno austral. No entanto, skuas antárticas também são aves migratórias, que podem atingir regiões com potenciais vetores reconhecidos, mas nunca foram diagnosticadas com hemoparasitos, o que foi reforçado pelos resultados negativos do presente estudo. Nesse caso, acredita-se que skuas, podem ter um sistema imune competente ou que a ausência de hemoparasitos nessas aves seja justificada por confinamentos filogenéticos entre parasito-hospedeiro. Entretanto, pouco se sabe sobre a existência de vetores na Antártica, rotas migratórias das aves da região e especificidade parasito-hospedeiro. Os resultados inéditos encontrados no presente estudo devem, portanto, servir como ponto de partida para o entendimento das interações parasito-hospedeiro, de forma a contribuir para a preservação do ambiente antártico. / Parasitism is an important selective pressure in populations, as well as competition and predation. Blood parasites can affect the color of plumage, sexual selection and reproductive success in birds. Antarctic birds have been mentioned in literature absent of blood parasites. Admiralty Bay is located at King George Island, Antarctic Peninsula, and is the largest bay on the region, harboring different avian species during the reproductive period. Among them, are the two most common skuas of Antarctica, the brown-skua (Catharacta lonnbergi) and the south-polar-skua (Catharacta maccormicki), and tree penguins species, the Chinstrap (Pygoscelis antarctica), the Gentoo (P. papua) and the Adelie (P. adeliae). Skuas and penguins are seabirds that migrating during the southern winter, and may be potential reservoirs and transmitters of parasites. However, negative results of blood parasiteshave been found in several seabirds and also to the Antarctic region. The objective of this study was to investigate the presence of blood parasites in Antarctic penguins and skuas at Admiralty Bay. Blood smears and blood samples for molecular analyses to research Plasmodium/Haemoproteuswere collected in two reproductive periods, from December 2010 to March 2011 and from December 2011 to March 2012. A total of 185 bird samples were collected, including 120 penguins and 65 skuas. Skuas were negative for parasites. The tree species of penguins were positives to Plasmodium/Haemoproteusby molecular analysis, including two P. papua, two P. antarctica and tree P. adeliae. Only one positive penguin by molecular technique, a P. papua, was positive in blood smears, diagnosed with Plasmodium sp. There was no significant difference between male and female individuals of the parasitizedspecies, as well as between adults and chicks. Parasitized birds (n = 7) were categorized as underweight (n=5) and overweight (n=2).The present study is the first to report blood parasites in the Antarctic region and is also the first record of the presence of blood protozoa for the three penguin species analyzed. The absence of blood parasites in Antarctic birds has been justified by the absence of potential vectors in the region. Therefore, it is possible that the parasitized penguins acquired infectionwhen they disperse during southern winter. However, antarctic skuas are migratory birds, and they can reach regions with recognized potential vectors, but have never been diagnosed with blood parasites, what was reinforced by data of the present study. In this case, it is believed that skuas may have a competent immune system, or that the absence of these parasites in these birds is justified by phylogenetic constraints between the host-parasite. Nevertheless, little is known about the existence of vectors in the Antarctica, migratory routes of birds in the region and parasite-host specificity. The inedited results found in this study should therefore serve as a starting point to understand the host-parasite interactions, and to contribute to the preservation of the Antarctic environment.

As células T CD4+ do baço são importantes na proteção frente à malária através de mecanismos mediados pelas citocinas do perfil Th1. Neste trabalho observamos o aumento das células NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b por baço nos camundongos C57BL/6, que apresentam o fenótipo de células ativadas, produzem IFN-<font face=\"Symbol\">g, expressam de níveis altos de Fas e PD-L1 que correlaciona com a baixa capacidade proliferativa na fase aguda da infecção pelo Plasmodium chabaudi AS. As células T CD4+ convencionais são a principal subpopulação de células T ativadas na resposta imune frente à infecção, que se desenvolve em duas fases consecutivas concomitantemente com as parasitemias aguda e crônica. Na fase aguda da infecção, a resposta das células T CD4+ convencionais é intensa e de curta duração, com produção grandes quantidades citocinas com cinética semelhante às células T CD4+ não-convencionais. Dessa maneira, as células T CD4+ convencionais possuem um papel central no início da resposta ao P. chabaudi, respondendo em paralelo com as células T não-convencionais como uma ponte entre a imunidade inata e adquirida. / Spleen CD4+ T cells have an important role for protection against malaria through mechanisms mediated by Th1 cytokines. We observed that the increase in NK1.1+TCR<font face=\"Symbol\">a<font face=\"Symbol\">b cell numbers per spleen in C57BL/6 mice, show an activated cell phenotype, with high expression of Fas and PD-L1 correlating with their low proliferative capacity and produce IFN-<font face=\"Symbol\">g during the acute P. chabaudi infection. We show that conventional CD4+ T cells are the main activated T cells subpopulation in the immune response to infection, which develops in two consecutive phases concomitantly with acute and chronic parasitemias. In the acute phase, the conventional CD4+ T cell response is intense and short-lasting, rapidly providing proinflammatory. Taken together, these results indicated the central role of conventional CD4+ T cells during P. chabaudi malaria, acting in parallel with non-conventional CD4+ T cells as a link between innate and acquired immunity.

Orientadores: Marcelo Brocchi, Fabio Trindade Maranhão Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T03:58:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franzin_FernandaMaria_M.pdf: 1412458 bytes, checksum: 2fe89ebc9e03c37ffcc48000024a232d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A malária é uma doença tropical causada pelo parasita Plasmodium spp e é considerada um sério problema de saúde pública. São aproximadamente 500 milhões de casos anuais e mais de um milhão de mortes, especialmente na África e Ásia. No Brasil, são 500 mil novos casos por ano, principalmente na região Amazônica. Esses elevados índices de mortalidade e morbidade são motivadores da busca por estratégias de controle e eliminação dessa doença. A vacinação é uma ferramenta promissora no controle e prevenção da malária, entretanto, uma vacina segura e efetiva ainda não está disponível, em parte devido ao complexo ciclo de vida do parasita e a expressão de diferentes antígenos em cada fase. O antígeno de membrana similar ao ligante de eritrócitos (MAEBL), é um forte candidato a ser usado no desenvolvimento de uma vacina efetiva contra a malária, uma vez que esse antígeno é expresso em diferentes períodos do ciclo de vida do parasita. Neste estudo, o domínio M2 do antígeno MAEBL de Plasmodium yoelli foi expresso em linhagens vivas atenuadas de Salmonella enterica Typhimurium (?3987, ?4550 e H683) e o uso dessas bactérias como vacina recombinante potencialmente indutora de proteção contra malária murina foi avaliado. Essas linhagens foram obtidas após construção e transdução do plasmídio pYA3137trc contendo a região m2 do gene maebl e a expressão do antígeno foi confirmada por immunoblotting. A administração oral das linhagens recombinantes a camundongos BALB/c/AnUnib resultou na colonização dos tecidos hospedeiros apenas pela linhagem H683. Essa linhagem foi então avaliada em termos de indução de resposta imune humoral contra M2 e capacidade de imunização no modelo murino. Apesar da resposta humoral contra M2 ter sido detectada in vivo, a linhagem recombinante não demonstrou proteção potencial contra a infecção por Plasmodium yoelii no modelo murino. / Abstract: Malaria is a tropical disease caused by the parasite Plasmodium spp and is considered a serious public health problem. There are about 500 million annual cases and more than one million of deaths, especially in Africa and Asia. In Brazil, there are 500.000 new cases per year, mainly in the Amazon region. Those high rates mortality motivate the search for strategies of control and elimination of this illness. The vaccination is a promising tool in the control and prevention of malaria; however, a safe and effective vaccine is not available yet, in part due to the complex life cycle of the parasite and expression of different antigens in each phase. Membrane antigen erythrocyte binding like (MAEBL) is a strong candidate to be used in the development of an effective vaccine against malaria, since this antigen is expressed in different periods of the parasite life cycle. In this work, the M2 domain of Plasmodium yoelli MAEBL antigen was expressed in attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium (?3987, ?4550 e H683) and the use of these bacterias as potential inductor of protection against murine malaria was evaluated. These strains were obtained by construction and transduction of the plasmid pYA3137trc carrying the m2 region of the maebl gene and the antigen expression was confirmed by immunoblotting. The oral administration of the recombinant strains to BALB/c/AnUnib mice resulted in the colonization of host tissues only for the H683 strain. This strain was further evaluated in terms of induction of humoral immune response against M2 and immunization capacity in murine model. Even though humoral response against M2 was detected in vivo, the recombinant strains did not shown protective potential against the infection of Plasmodium yoelii in murine model. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T10:58:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Lourival de Almeida Silva - 2015.pdf: 2573495 bytes, checksum: 0eee1e3d91463a3f757ecdc4fe7126ce (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T11:02:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Lourival de Almeida Silva - 2015.pdf: 2573495 bytes, checksum: 0eee1e3d91463a3f757ecdc4fe7126ce (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T11:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Lourival de Almeida Silva - 2015.pdf: 2573495 bytes, checksum: 0eee1e3d91463a3f757ecdc4fe7126ce (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Leishmaniasis is a neglected tropical disease responsible for physical, economic and social damages. Even though malaria is not classified as a neglected tropical disease, is responsible for high morbidity and mortality, especially in African countries. Current treatments for both diseases face several drawbacks, including the evolution of drugresistant parasites, the high cost of major drugs and the high toxicity of others. For these reasons, there is an urgent need to develop new drugs that minimize these downsides and, consequently, help eradicate these diseases. To overcome these difficulties, both academics and pharmaceutical companies are increasingly employing the so-called “drug repositioning strategy”. Drug repositioning aims to find new applications for drugs approved for other indications, and has proven valuable for decreasing research costs as well as to decrease the time required to market the "new" drug. In the present study, we used bioinformatics to identify and analyze molecular targets of the energy metabolism of Leishmania spp and of the P. falciparum apicoplast. The energy metabolism of Leishmania and the apicoplast metabolism have various enzymes that can be targeted by specific drugs, leading to lower toxicity and more promising therapies for humans. Using the TDR Targets database, we were able to identify 94 genes and 93 Leishmania energy metabolism targets. We identified 44 positive targets in these databases, and for 11 of these targets we found drugs already approved for use in humans. We used a similar strategy to identify antimalarial drugs that acted specifically against the apicoplast metabolism. The GeneDB database of the P. falciparum genome was used to compile a list of 600 proteins with apicoplast signal peptides. Each of these proteins was treated as a potential drug target and its predicted sequence was used to interrogate three different open access databases (DB TTD, DrugBank and STITCH ). We identified many drugs with the potential to interact with 47 peptides allegedly involved in apicoplast biology in P. falciparum. Fifteen of these hypothetical targets are predicted to interact with drugs are already approved for clinical use, but were never evaluated against malaria parasites. Our results suggest that the drugs identified here show potential activity against leishmania parasite and malaria, but need experimental validation to confirm their effectiveness. / As leishmanioses são parasitoses negligenciadas responsáveis por prejuízos físicos, econômicos e sociais. A malária, embora não seja classificada como negligenciada, é responsável por altos índices de morbidade e mortalidade, principalmente nos países africanos. Ao longo dos anos, o tratamento dos infectados tem sido a forma mais eficaz de controle dessas endemias. Entretanto, os efeitos tóxicos, o alto custo dos fármacos e a resistência dos parasitos têm sido os maiores desafios enfrentados pela terapêutica das leishmanioses e da malária. Sendo assim, é urgente a necessidade de desenvolver novos fármacos que minimizem esses transtornos e contribuam para erradicação dessas parasitoses. Diante disso, laboratórios acadêmicos, governos e organizações não governamentais têm apoiado projetos voltados para o reposicionamento de fármacos aprovados com vistas a reduzir custos e tempo de produção de novos antiparasitários. No presente trabalho, utilizamos a bioinformática para identificar, buscar e analisar alvos moleculares do metabolismo energético de Leishmania spp e do apicoplasto de P. falciparum, visando o reposicionamento in silico de fármacos. Utilizando a base de dados TDR Targets, identificamos 94 genes e 93 alvos do metabolismo energético de Leishmania. Em seguida, utilizando a sequência peptídica de cada alvo, interrogamos as bases de dados Drug Bank e TTD na busca de fármacos. Nossa busca resultou em 44 alvos positivos, dos quais 11 interagiam com 15 fármacos aprovados para uso em humanos. Utilizamos estratégia semelhante para identificar fármacos antimaláricos que atuassem especificamente contra o metabolismo do apicoplasto. A base de dados GeneDB do genoma de P. falciparum foi usada para compilar uma lista de cerca de 600 proteínas com peptídeos sinais do apicoplasto. Cada uma dessas proteínas foi tratada como potencial alvo de fármaco e sua sequência prevista foi usada para interrogar três diferentes bases de dados de acesso livre (TT DB, DrugBank e STITCH ) Identificamos fármacos com potencial de interagir com 47 peptídeos supostamente envolvidos na biologia do apicoplasto do P. falciparum. Quinze desses alvos hipotéticos são previstos interagir com fármacos já aprovados para uso clínico, mas que nunca foram avaliados contra os parasitos da malária. Os nossos resultados sugerem que os fármacos aqui identificados apresentam potencial para tratamentos das leishmanioses e da malária, mas que necessitam de validação experimental para confirmar sua eficácia.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-10-23T17:15:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Karlla Gonçalves Macedo - 2014.pdf: 3559333 bytes, checksum: be77b4325f787c0048a0c9a15e8c800b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-10-23T17:16:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Karlla Gonçalves Macedo - 2014.pdf: 3559333 bytes, checksum: be77b4325f787c0048a0c9a15e8c800b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-23T17:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Karlla Gonçalves Macedo - 2014.pdf: 3559333 bytes, checksum: be77b4325f787c0048a0c9a15e8c800b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-08-05 / Drug discovery and development process requires high investments of both time and money. Strategies for drug design aided by computers, CADD (Computer-Aided Drug Design) have gained prominence over the last decades, in order to minimize the impact of those costs. CADD techniques also allow the exploration of a greater number of biological targets and promising molecules. Malaria is an endemic disease in Africa and in South American caused by the protozoa of the genus Plasmodium. In 2012, 207 million cases and 627,000 deaths were estimated, according to the World Health Organization. The enzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) catalyzes the fourth step of the pyrimidine biosynthesis, and consists in a validated target for the design of new antimalarial agents. The aim of this study was to develop structure-activity relationships (SAR) rules and to generate quantitative structure-activity relationships (QSAR) models using a set of triazolopyrimidines described in the literature as inhibitors of DHODH from P. falciparum (PfDHODH). SAR rules were established using methods of clustering, activity cliffs and activity landscapes. In addition, several models of 2D-QSAR and hologram QSAR (HQSAR) were developed and validated. The SAR analyses allowed the understanding of the basic structural requirements for the antimalarial activity of triazolopyrimidines, like alkyl halides substituents on the triazolopimidinic ring, hydrophobic substituents in the para position on the benzene ring, all in agreement with the chemical space inside the active site of the PfDHODH. The HQSAR and 2D-QSAR models showed good statistical parameters and good predictive ability. The HQSAR contour maps were also consistent with the chemical space of the active site of the enzyme. The results of this study could serve as guide for the design of new antimalarials with higher potency. / O processo de planejamento e desenvolvimento de novos fármacos é um trabalho complexo, que demanda elevados investimentos de tempo e dinheiro. Estratégias de planejamento de fármacos auxiliadas por computador, CADD (Computer-Aided Drug Design) vêm se destacando, pois minimizam gastos e tempo, além de poder explorar um número maior de alvos biológicos e moléculas promissoras. A malária é uma doença endêmica grave na África e América do Sul, causada por protozoários do gênero Plasmodium. Em 2012 foram estimados 207 milhões de casos e 627.000 mortes, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. A enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) atua na quarta etapa da biossíntese de pirimidinas, é um alvo validado para o planejamento de novos agentes antimaláricos. O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver regras de relação entre estrutura e atividade (SAR) e modelos robustos e preditivos de relações quantitativas entre estrutura e atividade bidimensionais (QSAR-2D), utilizando um conjunto de triazolopirimidinas descritas na literatura como inibidores da DHODH de P. falciparum (PfDHODH). Foram desenvolvidas regras de SAR utilizando os métodos de análise de agrupamentos, cliffs de atividade e landscapes de atividade. Além disso, desenvolveu-se e validou-se vários modelos de QSAR–2D e de holograma QSAR (HQSAR). As análises de SAR, permitiram estabelecer requisitos estruturais essenciais para a atividade antimalárica das triazolopirimidinas, como substituintes haletos de alquila no anel triazolopimidínico, substituintes hidrofóbicos na posição para no anel benzênico, todos de acordo com o espaço químico da cavidade de interação da PfDHODH. Os modelos de HQSAR e QSAR-2D apresentaram bons parâmetros estatísticos e boa capacidade preditiva. Os mapas de contribuição de HQSAR também estão de acordo com o espaço químico da cavidade de interação da PfDHODH. Os dados obtidos servem como guia para o planejamento de novos antimaláricos com maior potência.

Estima-se que a malária seja responsável por um milhão de mortes anuais, atingindo principalmente crianças. O sistema imune participa tanto na proteção contra a infecção pelo plasmódio, como no desenvolvimento das síndromes associadas à malária (anemia, malária cerebral, acidose metabólica e choque sistêmico). Recentemente, tem sido mostrado que a imunidade inata é capaz de detectar sinais liberados por células ou tecidos danificados como o ATP e o ácido úrico. Esses sinais de perigo parecem ser importantes para promover a regulação da inflamação após o trauma ou injúrias ocasionadas pelos patógenos. Porém, a relevância fisiológica desses sinais na resposta imune e seu mecanismo de ação ainda não estão claros. Na malária, é provável que o ATP seja liberado no momento da ruptura dos eritrócitos, a partir de células danificadas do endotélio vascular ou de células do sistema imune mortas por ativação. Assim, neste estudo nós avaliamos o papel do ATP na ativação do sistema imune e no desenvolvimento da doença durante a infecção com P. chabaudi. Nossos resultados sugerem que, a concentração de ATP no soro e permeabilização de linfócitos do sangue é maior após a ruptura dos eritrócitos. Durante a infecção, as células T e as células dendríticas possuem uma capacidade exacerbada de resposta ao ATP, que pelo menos em parte depende do P2X7R. Além disso, a presença funcional de receptores purinérgicos parece ser importante para a fase inicial da resposta imune ao P. chabaudi. A inibição farmacológica do receptor reduziu o número de células, produção de IFN-<font face=\"Symbol\">g e injúria hepática. Desta forma a utilização do antagonistas do P2X7R poderia ser benéfico na resolução de problemas ocasionados pelo aumento acentuado do sistema imune. / It is estimated that malaria accounts for one million deaths annually, affecting mainly children. The immune system participates in both the protection against infection by the plasmodium, as in the development of the syndromes associated with malaria (anemia, cerebral malaria, metabolic acidosis and systemic shock). Recently, it has been shown that innate immune is able to detect signals released by damaged cells or tissues as ATP and uric acid. These danger signals appear to be important to promote the regulation of inflammation after trauma or injuries caused by pathogens. However, the physiological relevance of these signals in the immune response and its mechanism of action remain unclear. In malaria, it is likely that ATP is released upon rupture of erythrocytes, vascular endothelial cells damaged or dead cells of the immune system activation. In this study we evaluated the role of ATP in the activation of the immune system and the development of disease during infection with P. chabaudi. Our results suggest that ATP concentration serum and permeabilization of blood lymphocytes is higher after the rupture of erythrocytes. During infection T cells and dendritic cells have a heightened ability to respond to ATP which is partly dependent on P2X7R. Moreover, the presence of functional purinergic receptors appears to be important for the initial phase of the immune response to P. chabaudi. The pharmacological inhibition of the receptor reduced the number of cells, liver damage and IFN-<font face=\"Symbol\">g, thus the use of the P2X7 receptor antagonists could be beneficial in solving problems caused by the sharp increase in the immune system.

Insetos vetores apresentam diminuição na produção de ovos quando infectadas por plasmódios. Esse fenômeno foi demonstrado em diferentes modelos de laboratório utilizando mosquitos Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Anopheles stephensi. Durante o desenvolvimento de Plasmodium gallinaceum ocorrer alterações em diferentes processos fisiológicos de Aedes aegypti, tais como redução nos níveis de ecdisona (precursora do hormônio 20-hidroxiecdisona) na hemolinfa e alterações nos níveis transcricionais em genes envolvidos com vitelogênese, transporte de lipídeos e resposta imune. Os dados obtidos também mostram alterações nas quantidades de proteínas hemolinfáticas minoritárias e majoritárias em fêmeas infectadas. Embora maior parte do desenvolvimento do parasita acontece no trato digestivo, outros tecidos como corpo gorduroso, ovários e hemolinfa são afetados. Além disso, nossos dados sugerem fortemente que o parasita utiliza a lipoforina como fonte nutricional durante a esporogonia. / Insect disease vectors show decreased fecundity when infected with Plasmodium. This phenomenon has already been demonstrated in laboratory models such as Aedes aegypti, Anopheles gambiae and Anopheles stephensi . Some physiological processes of Aedes aegypti suffer changes when the vector is infected with Plasmodium gallinaceum . The ecdysone (20-hidroxyecdysone hormone precursor) level in the hemolymph is reduced and genes involved on vitellogenesis, lipid transport and immune response have their transcriptional pattern changed. The data obtained also show that these modifications also occur with major and minor hemolymph proteins. The fat body, ovaries and hemolymph are affected during infection, even though, the parasite development occurs mainly in the midgut. In addition, our results strongly suggest that parasites use lipophorin as a nutritional source for sporogony.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-09-20T13:42:20Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-16T11:34:15Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-10-16T11:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-02-28 / Devido à ampla distribuição da malária entre os continentes e ao elevado número de casos clínicos e óbitos registrados anualmente, o desenvolvimento de uma vacina antimalárica segura e eficaz contra a doença ainda é de extrema importância. Dentre os vários modelos propostos até o momento, aquelas compostas por parasitos vivos ou por extrato proteico têm sido as mais promissoras no desenvolvimento de imunidade antimalárica. Entretanto, ainda não claro se imunizações com cepas com baixo potencial de virulência seriam capazes de prevenir ou amenizar os sintomas associados à malária grave. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar se camundongos imunizados com extrato proteico de Plasmodium berghei NK65, cepa de baixa virulência e não indutora de malária cerebral nesse modelo, são protegidos contra o desenvolvimento de malária cerebral induzida pela cepa ANKA de Plasmodium berghei (PbA). Para isto, foram realizados dois ciclos de imunização utilizando extrato proteico de Plasmodium berghei associado ao adjuvante CPG-ODN, com intervalo de 21 dias, em camundongos fêmeas C57BL/6, com idade entre 6 e 8 semanas. Após 30 dias da última imunização foi realizado o desafio experimental utilizando a cepa ANKA de P. berghei e iniciado o acompanhamento diário dos animais para avaliação do seu quadro clínico e da carga parasitária. Diante da presença de sinais neurológicos (escore clínico < 5), os animais foram pesados e eutanasiados para realização da coleta de sangue, baço e cérebro, enquanto animais sem esses sinais continuaram por ser acompanhados diariamente e, então, sacrificados a partir do 13º dia. A partir das amostras coletadas, foram determinados os níveis de anticorpos sorológicos, a frequência da população celular esplênica (células T CD4+ e CD8+, e linfócitos B), níveis de citocinas teciduais e análise histopatológica do tecido nervoso. Observouse que 46% dos animais imunizados com extrato de PbN e 69% dos animais imunizados com extrato de PbA foram protegidos do desenvolvimento de malária cerebral e tiveram sua taxa de sobrevivência prolongada, entretanto, estes animais desenvolveram hiperparasitemia sanguínea, com níveis de até 38% de parasitos circulantes. Estes animais não apresentaram sinais clínicos neurológicos, o que foi confirmado macroscopicamente pela ausência de hemorragia e reduzida inflamação no cérebro em relação aos animais que evoluíram para malária cerebral. Histopatologicamente, os animais com hiperparasitemia apresentaram poucos leucócitos aderidos ao endotélio vascular e ausência de vasos obstruídos. Em relação aos níveis de citocinas (IL-10, TNF-α, IFN-) e número de linfócitos esplênicos (T CD4+ e CD8+, e linfócitos B), estes estiveram significativamente reduzidos nos animais que desenvolveram hiperparasitemia em relação aos que desenvolveram malária cerebral. Interessantemente, os animais imunizados foram capazes de reconhecer tanto antígenos homólogos quanto heterólogos ao utilizado durante o processo de imunização, porém, esses anticorpos pareceram não influenciar o padrão clínico apresentado pelos animais. Portanto, nosso estudo demonstra que imunizações com parasitos de baixa virulência podem induzir imunidade capaz de proteger contra cepas altamente virulentas, mas os fatores que medeiam essa proteção ainda precisam ser melhor investigados. / The broad distribution of malaria around of the globe and the large number of clinical cases/deaths attributed to this disease turns the discovery of a safe and effective malaria vaccine an essential tool to halt the spread of the disease. Vaccines focused on the use of live parasites and crude parasites antigens have shown good results on the induction of antimalarial immunity, although it is still not clear if immunizations with low virulent strains are capable to prevent the development of symptoms of cerebral malaria. This research aim to investigate if immunizations with crude antigen of Plasmodium berghei NK65 (PbN), a low virulence strain noninductive of cerebral malaria in C57BL/6 mice, are able to protect the animals against the development of cerebral malaria after challenge with Plasmodium berghei ANKA (PbA). Mice were immunized twice with crude antigen associated to CPG-ODN adjuvant. Thirty days after the second immunization animals were challenged with 105 red blood cells infected with P. berghei ANKA. Animals were daily monitored to evaluate the clinical score and parasitaemia levels. If the presence of neurological signs (score < 5) were detected, animals were euthanized and blood samples, spleen and brain were collected; animals without neurological commitment were followed daily until the 14 day post-infection. Antibodies and cytokines levels, splenic cellular population (T CD4+, T CD8+ and B lymphocytes) and histopathological analysis were performed. The results showed that 46% of the animals immunized with crude antigen of PbN and 69% of the animals immunized with crude antigen of PbA were protected from the development of cerebral malaria and had their survival rate prolonged, however, these animals developed hyperparasitaemia, with levels up to 38% of circulating parasites. These animals did not present neurological signs which were confirmed macroscopically by the absence of hemorrhage and reduce brain inflammation in relation to the animals that evolved to cerebral malaria. Histopathologically, the animals with hyperparasitaemia presented few adhered leukocytes in the vascular endothelium and absence of obstructed vessels. In relation to cytokine levels and number of splenic lymphocytes, these were significantly reduced in animals that developed hyperparasitism in comparison with those who developed cerebral malaria. Interestingly, the immunized animals were able to recognize both homologous and heterologous antigens used during the immunization process, however, these antibodies did not appear to influence at the clinical condition presented by the animals. Therefore, our study demonstrates that immunizations with low virulence parasites may induce immunity capable of protecting against highly virulent strains, but the factors that mediate this protection still need to be better investigated.