Toxoplasma gondii und Plasmodium Spezies sind obligat intrazelluläre Parasiten, die Zucker zur Energiehomöostase als auch für die Synthese lebenswichtiger Makromoleküle verwenden. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass der Glukosetransporter von T. gondii, TgGT1, und die homologen Transporter von P. falciparum und P. berghei, PfHT1 und PbHT1, neben Glukose auch Mannose, Fructose und Galactose transportieren. Toxoplasma Tachyzoiten exprimieren neben TgGT1 noch einen weiteren putative Zuckertransporter (TgST2) an der Parasitenoberfläche. Beide Proteine sind nicht essentiell, wie durch ihre individuelle und gleichzeitige Gendeletion belegt wird. Die Deletion von TgGT1 bewirkt einen geringen Wachstumsdefekt. Die Mutante ?tggt1 zeigt keine Glukoseaufnahmeaktivität und folglich eine verminderte glukoseabhängige Motilität. In ?tggt1 Parasiten wird ein verstärkter Glutaminstoffwechsel nachgewiesen, der ausreichend ist dessen Motilität und Replikationsaktivität zu erhalten. Die ?tggt1 Mutante gewährt Einblick in die Anpassungsfähigkeit von T. gondii an unterschiedliche Wirtszellen. Im Gegensatz zu T. gondii benötigen erythrozytäre Plasmodien Glukose und der Transporter PfHT1 wird derzeit als drug-target eingestuft. Hier wird gezeigt, dass das PfHT1-Homolog, PbHT1, essentiell in Blutstadien des Nagerparasiten Plasmodium berghei ist, jedoch auch während des gesamten Lebenszyklus des Parasiten exprimiert wird. Ein PfHT1- und PbHT1-spezifischer Inhibitor (Compound 3361) kann die Entwicklung von P. berghei Leberstadien und Okineten stark hemmen. Um zukünftig PfHT1-Inhibitoren im Hochdurchsatzverfahren zu identifizieren und testen zu können, wurden auf Saccharomyces cerevisiae und P. berghei basierende Expressionssysteme für PfHT1 entwickelt. Abschließend stellt diese Arbeit die Unterschiedlichkeit des zentralen Kohlenstoffwechsels von Toxoplasma und Plasmodium Parasiten durch bisher unbekannter Aspekte heraus. / Toxoplasma gondii and Plasmodium species are obligate intracellular pathogens that utilize host sugars for energy homeostasis and macro molecular synthesis. Here, we report that the T. gondii glucose transporter, TgGT1, and of its homologs of P. falciparum and P. berghei (PfHT1 and PbHT1) transport glucose, mannose, galactose and fructose. Besides TgGT1, Toxoplasma harbours one additional surface localized putative sugar transporter (TgST2). Surprisingly both Proteins are nonessential and only the deletion of TgGT1 inflicts a mild defect in the parasite replication. The ?tggt1 mutant is unable to import glucose and consequently displays an attenuated glucose-dependent motility, which is completely rescued by glutamine. ?tggt1 performs increased glutamine metabolism that is sufficient to sustain motility and replication. The ?tggt1 strain provides a model for further investigating its adaptation to disparate host cells. In contrast to T. gondii, erythrocytic stages of Plasmodium species critically depend on glucose uptake, and the PfHT1 transporter is considered as a drug target against human malaria. Here, we report that PbHT1 (a PfHT1 homolog) is also essential for blood stage development in the rodent malaria parasite P. berghei. PbHT1 is expressed throughout the life cycle. Moreover, a PfHT1- and PbHT1-specific sugar analogue, compound 3361, can inhibit the hepatic development and ookinete formation in P. berghei. These results signify that PbHT1 and exogenous glucose are also required during the ex-erythrocytic stages of P. berghei. To permit a high-throughput screening of selective PfHT1 inhibitors and their subsequent in vivo assessment, we have established a PfHT1-expressing Saccharomyces cerevisiae mutant and generated a PfHT1-dependent ?pbht1 of P. berghei strain. This thesis underscores various previously unknown aspects of sugar metabolism in Toxoplasma and Plasmodium, and unravel their metabolic differences.

A MSP-1 de Plasmodium vivax (PvMSP-1), o principal alvo para o desenvolvimento de uma vacina contra a malária, é constituída por seis domínios altamente polimórficos flanqueados por seqüências conservadas. Apesar de evidências de que a divergência na seqüência da PvMSP-1 é está sendo mantida por mais de cinco milhões de anos por seleção balanceada exercida pela imunidade adquirida pelo hospedeiro, a especificidade dos anticorpos adquiridos naturalmente contra a PvMSP-1 ainda é pouco estudada. Este trabalho mostra que 15 proteínas recombinantes que correspondem às variantes da PvMSP-1 comumente encontradas em parasitos locais foram pouco reconhecidas por 376 indivíduos não-infectados com idade entre 5 e 90 anos expostos à malária na Amazônia rural; menos de 30% dos indivíduos tiveram anticorpos IgG detectáveis contra no mínimo uma variante dos blocos 2, 6 e 10 que foram expressas, embora 54,3% reconheceram o domínio conservado C-terminal PvMSP-119. Apesar da proporção de respondedores às variantes da PvMSP-1 ter aumentado substancialmente durante infecções agudas subseqüentes por P. vivax, os anticorpos não foram necessariamente específicos para as variantes da PvMSP-1 encontradas nos parasitos infectantes. São discutidos a contribuição relativa do polimorfismo antigênico, a fraca imunogenicidade e o pecado antigênico original (a tendência de a exposição a uma nova variante antigênica induzir resposta de anticorpos com especificidade pré-existente) para os padrões observados de reconhecimento por anticorpos da PvMSP-1. É sugerido que a resposta de anticorpos ao repertório de domínios variáveis da PvMSP-1 em indivíduos continuamente expostos é induzida somente após algumas infecções repetidas e requerem re-estímulo freqüente, com claras implicações para o desenvolvimento de subunidades de vacinas baseadas na PvMSP-1. / The merozoite surface protein 1 of Plasmodium vivax (PvMSP-1), a major target for malaria vaccine development, contains six highly polymorphic domains interspersed with conserved sequences. Although there is evidence that the sequence divergence in PvMSP-1 has been maintained over five million years by balanced selection exerted by host?s acquired immunity, the variant-specificity of naturally acquired antibodies to PvMSP-1 remains little investigated. Here we show that 15 recombinant proteins corresponding to PvMSP-1 variants commonly found in local parasites were poorly recognized by 376 noninfected subjects aged 5-90 years exposed to malaria in rural Amazonia; less than onethird of them had detectable IgG antibodies to at least one variant of blocks 2, 6 and 10 that were expressed, although 54.3% recognized the invariant C-terminal domain PvMSP-119. Although the proportion of responders to PvMSP-1 variants increased substantially during subsequent acute P. vivax infections, the specificity of IgG antibodies did not necessarily match the PvMSP-1 variant(s) found in infecting parasites. We discuss the relative contribution of antigenic polymorphism, poor immunogenicity, and original antigenic sin (the skew in the specificity of antibodies elicited by exposure to new antigenic variants due to preexisting variant-specific responses) to the observed patterns of antibody recognition of PvMSP-1. We suggest that antibody responses to the repertoire of variable domains of PvMSP-1 to which subjects are continuously exposed are only elicited after several repeated infections and may require frequent boosting, with clear implications for the development of PvMSP-1-based subunit vaccines.

Malaria wird durch den einzelligen Parasiten Plasmodium verursacht. Hierbei handelt es sich um einen obligat intrazellulären, eukaryotischen Erreger, der zum Phylum der Apicomplexa gehört. Apicomplexa zeichnen sich durch das einzigartige Vorhandensein eines ungewöhnlichen Plastids, genannt Apicoplast, aus. Die Exklusivität dieser Organelle und ihre metabolische Notwendigkeit für das Parasitenwachstum haben sie als attraktives pharmakologisches Ziel bestätigt. In dieser Arbeit wurden, unter Anwendung des Nagetier-Malariaerregers Plasmodium berghei, zwei verschiedene Aspekte von Apicoplast Proteinfunktionen untersucht. Zum Ersten wurde ein bislang unbeschriebenes Plasmodium Apicoplast Protein, Plasmodium-specific Apicoplast protein important for Liver Merozoite formation (PALM), charakterisiert. Drei voneinander unabhängige palm— Parasitenlinien, wurden durch zielgerichtete Gendeletion generiert. Die PALM Knockout-Mutanten entwickelten sich während eines Großteils des Lebenszyklus normal, jedoch war die Abgabe von Merozoiten in den Blutstrom und die Fähigkeit eine Blutstadien-Infektion zu etablieren signifikant beeinträchtigt. Experimentelle Immunisierung von Mäusen mit palm— Sporozoiten bewirkte einen starken und langanhaltenden Schutz gegen Reinfektion mit Malaria. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Parasiten mit einem Arrest in den finalen Schritten der Bildung von Leberstadien-Merozoiten einen Vorteil gegenüber genetisch attenuierten Parasiten der ersten Generation haben, die in der frühen Leberstadienentwicklung arretiert sind. Zum Zweiten wurden die sechs Nucleus-kodierten Komponenten der [Fe-S] Cluster Biosynthese im Apicoplast systematisch durch experimentelle Genetik analysiert. Insgesamt zeigen meine Studien, dass bisher unbekannte Ziele im Plasmodium Apicoplast für Interventionsstrategien gegen Malaria geeignet sind. / Malaria is caused by Plasmodium, an obligate intracellular eukaryotic pathogen that belongs to the phylum Apicomplexa. Apicomplexan parasites harbor an unusual plastid organelle, termed apicoplast. Because this unique organelle is indispensable for parasite growth it is a validated and attractive drug target. Using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei, two different aspects of apicoplast protein functions were analyzed in this study. Firstly, a previously uncharacterized Plasmodium apicoplast protein, Plasmodium-specific Apicoplast protein important for Liver Merozoite formation (PALM), was investigated. Three independent palm— knockout parasite lines were generated by targeted gene deletion. While the resulting knockout mutants developed normally for most of the life cycle, merozoite release into the blood stream and the ability to establish an infection was severely impaired. Experimental immunization of mice with palm— sporozoites elicited unprecedented potent and long-lasting protection against malaria re-infection. The results indicate that a tailor-made arrest in the final steps of hepatic merozoite formation could be an improvement over first-generation early liver-stage genetically arrested parasites (GAPs). Secondly, the six nuclear-encoded components of the apicoplast [Fe-S] cluster biosynthesis pathway were systematically targeted by experimental genetics. Together, my studies show that the Plasmodium apicoplast harbors previously unrecognized targets for anti-malaria intervention strategies.

A detecção microscópica de gametócitos pode subestimar sua prevalência e induzir uma avaliação errônea do potencial de transmissão da malária em áreas endêmicas, mantendo desconhecida a proporção de indivíduos infectados que são potenciais transmissores da doença. Este trabalho teve como objetivo a padronização de métodos moleculares para detecção e quantificação de gametócitos de P. falciparum e P. vivax. Descrevemos um método de qRT-PCR, que tem como alvo transcritos do gene pvs25 e pfs25. Detectamos transcritos de pvs25 em 96,4% das amostras sanguíneas provenientes de indivíduos infectados por P. vivax. qRT-PCR foi mais sensível do que a RT-PCR convencional, que tem como alvo o mesmo gene. Descobrimos que a maioria (61,9%) dos portadores de gametócitos são assintomáticos ou tem parasitemias subpatentes e não teriam sido detectados pelas estratégias de controle de rotina da malária. Porém, esses portadores de gametócitos não identificados, geralmente possuem baixas densidades de gametócitos e contribuem com até 4% da carga global de gametócitos na comunidade. / The microscopic detection of gametocytes may underestimate their prevalence, leading to an inaccurate assessment of the potential for malaria transmission in receptive areas and a poor estimate of the proportion of infected individuals who are infectious. We aimed to standardize molecular methods for detection and quantification of gametocytes of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax. Here, we describe a qRT-PCR that targets transcripts of the mature gametocyte-specific pvs25 gene. We found mature gametocytes in 53 of 55 (96.4%) P. vivax infections diagnosed during an ongoing cohort study in a farming settlement located in the southern of Amazonas state. SYBR green qRT-PCR was more sensitive than a conventional RT-PCR that targets the same gene. Most (61.9%) gametocyte carriers were either asymptomatic or had subpatent parasitemias, and would have been missed by routine malaria control strategies. However, potentially undiagnosed gametocyte carriers usually had low-density infections and contributed up to 4% to the overall gametocyte burden in the community.

Durante a ativação policlonal induzida pelo P. chabaudi a maior fonte de IL-2 são as células CD4+ ativadas, além disso, acorre a expansão de células Treg. No dia 7 após a infecção, a ausência de células Treg leva a uma exacerbação da ativação de células CD4+, além de altos níveis de anticorpos anti-P.chabaudi e auto-anticorpos. A neutralização da IL-2, com Mab anti-IL-2 JES6-1, na fase aguda da infecção leva a uma redução no número de células Treg. No dia 20 de infecção, a freqüência de células CD4+ ativadas esteve elevada e as células Treg voltaram aos níveis basais. Experimentos in vitro mostraram que a neutralização da IL-2 não altera a proliferação antígeno-específica de células CD4+ da fase aguda da infecção, porém, em tempos tardios da infecção houve um drástico aumento na freqüência de células CD4+ que proliferam em resposta a eritrócitos parasitados. Podemos concluir que a IL-2 e as células Treg são capazes de limitar a ativação policlonal induzida pelo P. chabaudi ainda que com cinéticas distintas. / Polyclonal activation during P. chabaudi infection results on a huge IL-2 production by activated CD4+ T cells, besides a considerable expansion of Treg cells. At day 7 after infection in the absence of Treg cells there is an enhanced response of activated CD4+ T cells, an increase of Abs anti-P.chabaudi and autoantibody production. Neutralization of IL-2 with Mab anti-IL2 JES6-1 during acute infection reveals a markedly reduction in Treg-cells number. At day 20 of infection we can observe an increase on activated CD4+ T cells frequency. Moreover, Treg cells return to values similar to controls. IL-2 in vitro assays during acute infection results on Ag-specific CD4+ T cells proliferation, on the other hand, at the late infection, we observed a huge increase of CD4+ T cells frequency that strongly response to PRBC. Our findings suggest that IL-2 and Treg cells are capable of restricting PLA during P.chabaudi infection, although with different kinetics.

A malária transmitida por transfusão sanguínea permanece como uma das infecções mais relevantes para os serviços de hemoterapia. Dados sobre a frequência de malária transfusional mostram valores que variam de menos que 0,2 casos por milhão de unidades de sangue em países não endêmicos a 50 casos ou mais em áreas com transmissão ativa. Embora no Brasil a incidência de malária por transfusão sanguínea não seja conhecida, este evento pode contribuir para a disseminação da doença em casos de falha na triagem clínico-epidemiológica ou na ocorrência de doadores assintomáticos nos bancos de sangue. Doadores que ocasionaram malária transfusional geralmente apresentavam parasitemias muito baixas com estimativa de um a 10 parasitos presentes por unidade de sangue, o que requer metodologias mais sensíveis para o diagnóstico e prevenção. O presente estudo de corte transversal e de abrangência nacional, visou a estimar a prevalência de marcadores específicos para malária em grande número de amostras de doadores de sangue agrupadas em pools, através de diferentes metodologias moleculares e um teste sorológico. Participaram 147 serviços hemoterápicos brasileiros, públicos e/ou privados localizados em áreas endêmicas e não endêmicas para malária e 13.338 doadores de sangue aprovados pelos métodos de triagem locais. As amostras foram agrupadas em pools de 10 totalizando 1299 pools. Esses pools foram processados por quatro técnicas diferentes de PCR em tempo real e uma técnica de nested PCR. Também foi empregado um teste rápido para detecção de anticorpos. Os pools positivos pelas PCRs foram ensaiados individualmente para detectar o(s) doador(es) positivo(s). Foram identificados 43 pools com amplificação para Plasmodium pela PCR em tempo real, sendo 4,72% de pools positivos da Região Amazônica e 3,19 da Extra-Amazônica. A nested PCR conseguiu identificar quatro pools com P. vivax, dois pools contendo P. falciparum e um pool com P. malariae, todos de doadores de Região Extra-Amazônica. Amostras dos pools positivos foram processadas individualmente e a PCR em tempo real mostrou amplificação em 25 doadores, uma positividade de 6,94% em 360 amostras individuais analisadas, sendo apenas uma de doador de Região Amazônica. A nested PCR identificou P. malariae em um doador e P. vivax em outro. O teste rápido revelou presença de anticorpos contra P. vivax em 13 pools de área não endêmica e 3 pools de área endêmica, sendo somente em um pool positivo pela PCR em tempo real. Limitações do estudo foram a descontinuação do teste rápido no Brasil que impediu a análise individual dos pools positivos e a problemas relativos à conservação das amostras de sangue individuais, o que dificultou a identificação de algumas amostras. A técnica de PCR em tempo real apresentou o melhor desempenho e foi capaz de identificar Plasmodium mesmo em amostras agrupadas em pool de 10, diminuindo desta forma o tempo e o custo do processamento. Os resultados deste estudo, que analisou amostras de sangue de doadores de áreas endêmicas e não endêmicas brasileiras, constituindo um painel nacional, revelaram o risco de malária transfusional em nosso país e a necessidade de validação de protocolos sensíveis para detecção de baixas parasitemias. Estes resultados poderão subsidiar as tomadas de decisões das agências reguladoras hemoterápicas, minimizando desta forma a transmissão de malária em bancos de sangue brasileiros / Malaria transmitted by blood transfusion remains one of the most important infections for hemotherapy services. Data on the frequency of transfusion malaria show values ranging from less than 0.2 cases per million units of blood in nonendemic countries to 50 or more cases in areas with active transmission. While in Brazil the incidence of malaria by blood transfusion is unknown, this event may contribute to the spread of the disease in cases of failure in the clinical and epidemiological screening or due to the occurrence of asymptomatic donors in blood banks. Donors that caused transfusion malaria mostly showed very low parasitemia with an estimated rate of 1 to 10 parasites per unit of blood, which requires sensitive methods for the diagnosis and prevention. This cross-sectional study with samples from whole country, aimed to estimate the prevalence of specific markers for malaria in large number of samples from blood donors grouped into pools, using different molecular methods and one serologic test. It was included 147 Brazilian public or private blood banks located in endemic and nonendemic areas for malaria with 13,338 blood donors that have been accepted by the local methods of screening. The samples were grouped into pools of 10 totalizing 1,299 pools that were processed by four different techniques of real time PCR and one nested PCR. It was also used a rapid test for antibody detection. Samples from the positive pools were tested individually by PCR to detect positive donors. Real-time PCR revealed amplification for Plasmodium in 43 pools with samples from Amazon Region (4.72%) and Extra-Amazon Region (3.19%). Nested PCR was able to identify four pools with P. vivax, two pools with P. falciparum and one pool with P. malariae, all related to samples from Extra-Amazon Region. Samples from positive pools were processed individually and real-time PCR revealed amplification in 25 donors, showing a positivity rate of 6.94% in 360 individual samples, with only one donor from Amazon Region. Nested PCR showed amplification in samples from two donors, one harboring P. malariae and one P. vivax. The rapid diagnostic test revealed the presence of antibodies against P. vivax in 13 pools from non-endemic area and in three pools from endemic area. Only one of the PCR positive pools resulted positive in the rapid diagnostic test. Limitations of this study were related to the unavailability of the rapid test in Brazil for processing the individual samples from the positive pools and problems concerning the storage of individual blood samples. Real-time PCR showed the best performance and was able to identify Plasmodium in pools of 10 samples, reducing time and cost of processing. The results of this study, which analyzed blood samples from donors from endemic and non-endemic Brazilian areas revealed the risk of transfusion malaria in our country and the need for sensitive validated protocols for detection of low parasitaemia. These results may support the decision making of blood donor screening criteria by regulatory agencies, in order to reduce malaria transmission in Brazilian blood banks

A malária permanece um sério problema de saúde em países subdesenvolvidos. O estágio sanguíneo da infecção é responsável por todos os sintomas associados com a malária. Recentemente, tem sido mostrado que receptores imunes inatos são capazes de detectar sinais de dano, tais como a adenosina trifosfato ATP. O receptor P2X7 detecta altas concentrações de ATP extracelular. Ao avaliarmos a parasitemia e os parâmetros clínicos da doença em camundongos C57BL/6 e P2X7-/-, observamos uma semelhança em ambos os grupos até o dia 7 p.i., mas após este período os camundongos P2X7-/- tiveram dificuldade de controlar a parasitemia e restaurar os parâmetros clínicos. O ineficiente controle da parasitemia durante o período agudo e crônico em camundongos P2X7-/- foi associado com a baixa produção de IFNγ. Além disso, o receptor P2X7 aumenta a expressão de T-bet em células Th1 e controla o número de células Tfh. Este estudo mostra que o equilíbrio mediado pelo receptor P2X7 entre os fatores de transcrição Bcl-6 e T-bet ajusta a imunidade celular e humoral na malária. / Malaria remains a serious healthcare problem in developing countries. The blood stage of infection is responsible for all symptoms associated with malaria. Recently, it has been shown that innate immune receptors are able to detect signals as adenosine triphosphate (ATP). P2X7 receptor detects high levels of extracellular ATP. Evaluating the parasitemia and clinical parameters in C57BL/6 (B6) and P2X7-/- mice, we observed a similarity in both groups to day 7 p.i., but after this period the P2X7-/- mice had difficulty in controlling the parasitemia and restoring the clinical parameters. The inefficient parasite control in acutely and chronically infected P2X7-/- mice was associated with low production of IFNγ. Furthermore, P2X7 receptor increases the expression of T-bet in Th1 cells and controls the Tfh cell number. This study provides a new insight into immunology by showing that the balance between T-bet and Bcl-6 transcriptional factors tunes the cellular and humoral immunity in malaria.

Le développement d'un vaccin anti-paludique est limité par notre connaissance incomplète des effecteurs agissant contre P.falciparum. Nous avons mis en évidence que les cellules T Vγ9Vδ2 sont activées par la forme intra-érythrocytaire (schizonte) et par les phosphoantigènes de P.falciparum, et peuvent inhiber la croissance du parasite in vitro par un mécanisme dépendant de la granulysine ciblant la forme invasive du parasite (mérozoïte). Ces résultats suggérent que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 jouent un rôle dans le contrôle précoce de la charge parasitaire. Cependant, le mécanisme médiant l’interaction entre les schizontes, les mérozoïtes les cellules T Vγ9Vδ2 et reste élusif. L'objectif de cette thèse est d’étudier les interactions entre les stades sanguins de P. falciparum et les cellules T Vγ9Vδ2, afin de mieux comprendre leurs activités anti-parasitaires, dans le but à long terme d’une utilisation clinique. Dans ce travail, nous étudions l'importance du contact direct avec les parasites dans l’activation et les activités anti-parasitaires des cellules T Vγ9Vδ2, par des approches de microscopie confocale et de cytométrie en flux. Nous suggérons que les cellules T Vγ9Vδ2 forment peu ou pas de contacts avec les mérozoïtes, et très peu de contacts avec le schizonte. De plus, nous montrons que, contrairement à une lignée cellulaire tumorale cible (Daudi), le contact avec les schizontes n'affecte pas l'activation des cellules T Vγ9Vδ2, suggérant que les phosphoantigenes du parasite sont libérés dans le milieu. Nous démontrons que les phosphoantigènes produits par la voie DOXP sont probablement libérés par un processus actif, dépendant des new permeation pathways (NPP). Ensembles, ces résultats suggèrent que l'activation et l'activité antiparasitaire des cellules T Vγ9Vδ2 n’est pas dépendante du contact, mais est médié par des facteurs solubles. / The limited knowledge of immune effector against Plasmodium falciparum precludes the development of a malaria efficient vaccine. We have recently evidenced that Vγ9Vδ2 T cells act as a new immune effector early in malaria infection. These cells are activated by the mature intraerythrocytic form (schizont) and by parasite-derived antigens (phosphoantigens). After activation, they inhibit in vitro parasite growth by targeting the extraerythrocytic invasive form (merozoite), by a granulysin-dependent mechanism. However, the mechanism by which Vγ9Vδ2 T cells are activated by schizonts and target merozoites remains elusive. The aim of this PhD project is to describe the interactions between P.falciparum blood stages and γδ T cells, in order to better understand their anti-parasitic activities and in the long term goal to manipulate these cells to prevent malaria. In the work, we investigate the importance of cell to parasite contact in Vγ9Vδ2 T cell activation and anti-parasitic activity by time-lapse and fixed confocal imaging, and cytometry. We suggest that Vγ9Vδ2 T cells form little or no contacts with merozoites, and very few contacts with the mature intraerythrocytic (schizont) form of the parasite. Moreover, we show that cytotoxic activities are elicited by schizonts, but that contrary to a known tumor cell line (Daudi cells), contact has no effect on the level of activation, suggesting that parasite-derived phosphoantigens are secreted in the microenvironment. We pursue the characterization of the parasite-derived phosphoantigens and demonstrate that they are produced by the DOXP pathway. Lastly, we show that phosphoantigens are most likely released by an active process, dependent on the new permeation pathways. Altogether, these results shed light on an unconventional mode of activation by P.falciparum blood stages and antiparasitic activity of Vγ9Vδ2 T cells, which is not contact-dependent, but rather is mediated by soluble factors.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-13T12:58:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao_SusceptibilidadeExperimentalAnopheles.pdf: 428229 bytes, checksum: abd7aec5037cb5ccb35ee10d8bd4e6ee (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-04-22T17:03:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_SusceptibilidadeExperimentalAnopheles.pdf: 428229 bytes, checksum: abd7aec5037cb5ccb35ee10d8bd4e6ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-22T17:03:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_SusceptibilidadeExperimentalAnopheles.pdf: 428229 bytes, checksum: abd7aec5037cb5ccb35ee10d8bd4e6ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2006 / A importância do An. nuneztovari como vetor primário de malária já foi comprovado em países da América do Sul como Venezuela, Colômbia e Peru. Na Amazônia brasileira, embora tenha sido encontrado naturalmente infectado com Plasmodium vivax e P. falciparum e em alta densidade, é ainda considerado vetor secundário desta doença. O objetivo deste presente trabalho foi avaliar a susceptibilidade do An. nuneztovari à infecção por plasmódios humanos. Para isso exemplares da geração F1, obtida em laboratório, de An. nuneztovari e An. darlingi (espécie controle) foram alimentados, em alimentador artificial, com sangue de pacientes com diagnóstico inicial de malária causada por P. falciparum, cuja revisão resultou no diagnóstico de infecção mista. Todas as amostras sangüíneas dos pacientes infectaram espécimes das duas espécies, não mostrando diferença significativa entre elas quanto à susceptibilidade. Para detecção de infecção malárica nos mosquitos foi usado o teste ELISA (Enzime – Linked Imunosorbent Assay) cujos resultados foram discordantes do diagnóstico laboratorial, já que o teste detectou infecções pelo P. falciparum, P. vivax VK210 ou P. vivax VK247entre os mosquitos positivos sugerindo que os pacientes apresentavam infecção mista. Também foi observado o curto período de desenvolvimento de oocistos e esporozoítos, de quatro a cinco dias, o que pode ser explicado pela alta temperatura (>30°C) que os mosquitos foram expostos. Assim nossos resultados sugerem possível envolvimento do An nuneztovari na transmissão de malária humana na área estudada e alertam para o papel deste, como possível vetor principal de malária humana na região amazônica brasileira. / The importance of the An. nuneztovari as malaria primary vector had already been confirmed in different South America countries such as Venezuela, Colombia and Peru. In the Brazilian Amazonian, although this specie had been found naturally infected by Plasmodium vivax and P. falciparum and in high densities, it is considered a secondary vector of this disease. The aim of this study was to evaluate the susceptibility of the An. nuneztovari to the infection by human Plasmodium species. For that, mosquitoes specimens of F1 progeny, obtained under laboratory conditions, of the An. nuneztovari and An. darlingi (control) were fed on an artificial feeding apparatus, using human blood that had been found carrying the malaria parasite, P. falciparum, whose revision had resulted as mixed infection. All blood samples from patients had infected specimens of both mosquitoes species tested, and no significant statistical difference was found related to the susceptibility. For the detection malaria infection in mosquitoes specimens it was conducted the ELISA (Enzime – Linked Imunosorbent Assay) test, whose results were divergent from the diagnostic one, since it has identified mosquitoes specimens infected by P. falciparum, P. vivax VK210 and/or P. vivax VK247, which suggests that the donors patients had mixed infection. It was also observed the short period of development of the oocysts and sporozoites, from four to five days, fact that can be explained by the high temperature (>300C) that the mosquitoes were exposed. Thus, our results suggest the probable enrollment of the An. nuneztovari in the human malaria transmission in the study area and point out the role of this mosquito specie as human malaria primary vector in the Brazilian Amazon region.

A MSP-1 de Plasmodium vivax (PvMSP-1), o principal alvo para o desenvolvimento de uma vacina contra a malária, é constituída por seis domínios altamente polimórficos flanqueados por seqüências conservadas. Apesar de evidências de que a divergência na seqüência da PvMSP-1 é está sendo mantida por mais de cinco milhões de anos por seleção balanceada exercida pela imunidade adquirida pelo hospedeiro, a especificidade dos anticorpos adquiridos naturalmente contra a PvMSP-1 ainda é pouco estudada. Este trabalho mostra que 15 proteínas recombinantes que correspondem às variantes da PvMSP-1 comumente encontradas em parasitos locais foram pouco reconhecidas por 376 indivíduos não-infectados com idade entre 5 e 90 anos expostos à malária na Amazônia rural; menos de 30% dos indivíduos tiveram anticorpos IgG detectáveis contra no mínimo uma variante dos blocos 2, 6 e 10 que foram expressas, embora 54,3% reconheceram o domínio conservado C-terminal PvMSP-119. Apesar da proporção de respondedores às variantes da PvMSP-1 ter aumentado substancialmente durante infecções agudas subseqüentes por P. vivax, os anticorpos não foram necessariamente específicos para as variantes da PvMSP-1 encontradas nos parasitos infectantes. São discutidos a contribuição relativa do polimorfismo antigênico, a fraca imunogenicidade e o pecado antigênico original (a tendência de a exposição a uma nova variante antigênica induzir resposta de anticorpos com especificidade pré-existente) para os padrões observados de reconhecimento por anticorpos da PvMSP-1. É sugerido que a resposta de anticorpos ao repertório de domínios variáveis da PvMSP-1 em indivíduos continuamente expostos é induzida somente após algumas infecções repetidas e requerem re-estímulo freqüente, com claras implicações para o desenvolvimento de subunidades de vacinas baseadas na PvMSP-1. / The merozoite surface protein 1 of Plasmodium vivax (PvMSP-1), a major target for malaria vaccine development, contains six highly polymorphic domains interspersed with conserved sequences. Although there is evidence that the sequence divergence in PvMSP-1 has been maintained over five million years by balanced selection exerted by host?s acquired immunity, the variant-specificity of naturally acquired antibodies to PvMSP-1 remains little investigated. Here we show that 15 recombinant proteins corresponding to PvMSP-1 variants commonly found in local parasites were poorly recognized by 376 noninfected subjects aged 5-90 years exposed to malaria in rural Amazonia; less than onethird of them had detectable IgG antibodies to at least one variant of blocks 2, 6 and 10 that were expressed, although 54.3% recognized the invariant C-terminal domain PvMSP-119. Although the proportion of responders to PvMSP-1 variants increased substantially during subsequent acute P. vivax infections, the specificity of IgG antibodies did not necessarily match the PvMSP-1 variant(s) found in infecting parasites. We discuss the relative contribution of antigenic polymorphism, poor immunogenicity, and original antigenic sin (the skew in the specificity of antibodies elicited by exposure to new antigenic variants due to preexisting variant-specific responses) to the observed patterns of antibody recognition of PvMSP-1. We suggest that antibody responses to the repertoire of variable domains of PvMSP-1 to which subjects are continuously exposed are only elicited after several repeated infections and may require frequent boosting, with clear implications for the development of PvMSP-1-based subunit vaccines.