El estrés oxidativo, el desequilibrio que se produce en el organismo entre sustancias oxidantes, principalmente especies reactivas del oxígeno (ROS), y antioxidantes, puede producir daños celulares que desencadenen diversos procesos patológicos. De ahí el creciente interés de la ciencia y la industria por obtener sustancias de origen natural (principalmente procedentes de residuos agrarios y de productos de desecho naturales) encaminadas a la prevención y tratamiento de estas alteraciones producidas por los ROS. Entre estas sustancias destacan los polifenoles y entre ellos, los flavonoides, con reconocidas propiedades antioxidantes y posible papel en la prevención de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cáncer.Se ha evaluado la citotoxicidad sobre células normales (no tumorales) y se ha caracterizado la actividad antioxidante de toda una serie de compuestos de naturaleza polifenólica obtenidos de diferentes fuentes naturales. Una primera serie de compuestos se obtuvo a partir de la despolimerización de flavanoles (catequinas) poliméricos procedentes de extractos vegetales, principalmente bagazo de uva, en presencia de cisteína y cisteamina. La segunda colección de compuestos está formada de fracciones polifenólicas (proantocianidinas) extraídas de bagazo de uva, de corteza de pino y de corteza del arbusto hamamelis; las diferencias estructurales de estas fracciones vienen dadas principalmente por el diferente grado de polimerización y diferente porcentaje de grupos galato que presentan.Se han planteado los siguientes objetivos y se han extraído las siguientes conclusiones de ellos: 1) El potencial efecto antioxidante de los derivados flavanólicos y los extractos de proantocianidinas se ha evaluado mediante su efecto protector frente a la hemólisis y la peroxidación lipídica inducida por radicales libres en eritrocitos y mediante la protección ejercida frente a la citotoxicidad por peróxido de hidrógeno en líneas celulares no tumorales. Tanto los derivados semisintéticos de epicatequina como los extractos de procianidinas, han mostrado, con diferente eficacia, una buena actividad antioxidante en los diferentes modelos celulares; en general, los grupos galato y el grupo no fenólico en el caso de los conjugados con aminoácidos y el grado de polimerización y porcentaje de galoización en el caso de las fracciones, son las principales características estructurales que determinan la actividad de estos compuestos. 2) La toxicidad se ha evaluado mediante ensayos de citotoxicidad utilizando el ensayo de viabilidad de captación del Rojo Neutro en fibroblastos 3T3 y en queratinocitos HaCaT y se ha caracterizando el potencial efecto genotóxico con la técnica del Comet. La presencia de galatos incrementa el efecto citotóxico de los compuestos y, en general, los compuestos más potentes como antioxidantes son también los más citotóxicos, debido al efecto prooxidante de los grupos galato; las concentraciones antioxidantes efectivas fueron inferiores a las concentraciones citotóxicas garantizando así la seguridad de estos productos. Los estudios previos de genotoxicidad muestran que los compuestos estudiados resultan genotóxicos para células no tumorales a concentraciones muy elevadas, alejadas de las concentraciones antioxidantes efectivas. 3) Finalmente, se ha iniciado la caracterización de la interacción de los derivados flavanólicos con la membrana eritrocitaria mediante estudios de morfología celular, de oxidación de proteínas y de fluidez de membrana. Los compuestos modificaron la fluidez de membrana y la morfología de los eritrocitos, pero no alteraron el patrón proteico ni se observó que revertieran los efectos nocivos de los oxidantes empleados.Así, se puede concluir que la galoización es una característica estructural fundamental para explicar los efectos de los compuestos de naturaleza polifenólica a nivel celular y que toda esta serie de sustancias polifenólicas procedente de diversas fuentes naturales, presenta actividad antioxidante en diversos modelos celulares en un rango de concentraciones seguro para células normales. / The imbalance between oxidant substances production, mainly reactive oxygen species (ROS), and antioxidants in the body, namely oxidative stress, is associated with several pathological processes. Therefore, there is an increasing interest in obtaining natural compounds (mainly from agricultural by‐products and other natural wastes) to deal with these ROS‐induced alterations. Among these substances, polyphenolic compounds and specially flavonoids, are recognized by their antioxidant properties and putative role in cardiovascular, neurodegenerative diseases and cancer prevention.We have evaluated the cytotoxicity on non tumoral cells and the antioxidant activity of a serie of flavanol cojugates (catechins), obtained from vegetable extracts through depolimerisation with cysteine derivatives, and several polyphenolic fractions extracted from grape pomace, pine bark and witch hazel ("Hamamelis virginiana") bark. 1) Antioxidant activity was studied by induction of oxidative stress in different cell models by radicals. All compounds showed antioxidant activity and the galloylated compounds were the most effective. 2) Cytotoxicity was evaluated using Neutral Red Uptake assay in fibroblast 3T3 and keratinocytes HaCaT. The strongest antioxidant products were also the most cytotoxic, especially due to the antioxidant power of the gallate group molecules, which is also responsible for the increase in their cytotoxicity.Compounds showed high antioxidant capacity in a concentration range that is not harmful to normal cells. Genotoxicity studies by Comet assay indicated that flavanic conjugates had genotoxic activity at high concentrations. 3) The characterization of the erythrocyte membrane interaction (by means of SEM, SDS‐Page electrophoresis and fluidity assays) showed that these compounds modified membrane fluidity and erythrocyte morphology but not their protein pattern.We can conclude that the flavanic conjugates with cystein derivatives and polyphenolic fractions from natural sources, presented antioxidant activity in several cellular models in a concentration range safe for normal cells. The compound structures mainly responsible for their activity were gallate groups and non phenolic moiety to flavanol conjugates, whereas percentage of galloylation and degree of polymerization were important in the case of polyphenolic fractions.

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és avaluar els efectes de les fraccions del vi (alcohòlica i no alcohòlica -principalment polifenols-) sobre els principals factors de risc cardiovascular en 67 homes amb un elevat risc de patir malalties cardiovasculars. Es va realitzar un assaig clínic, aleatoritzat i creuat en el qual tots els participants van rebre en un ordre aleatori les tres intervencions: 30 gr d'alcohol / dia en forma de vi negre, la mateixa quantitat de polifenols en forma de vi negre desalcoholitzat i 30gr d'alcohol / dia en forma de ginebra, durant 28 dies cada intervenció. Es van avaluar els efectes al final de cada una de les tres intervencions sobre els biomarcadors cel•lulars i sèrics d’inflamació relacionats amb l'aterosclerosi, el metabolisme glucídic, el perfil lipídic i la pressió arterial. El consum moderat d'alcohol (intervencions amb vi negre i ginebra) van incrementar la interleucina (IL) -10 i van disminuir la monocyte-derived chemoquine (MDC). Els polifenols del vi negre (intervencions amb vi negre i vi negre desalcoholitzat) van disminuir les concentracions sèriques de la intercellular adhesion molecule (ICAM) -1, E-selectina i IL-6, i també inhibiren l'expressió del lymphocyte function-associated antigen 1 ( LFA-1) en els limfòcits T i la de Mac -1, SLex (CD15) i CCR2 en la superfície dels monòcits. Tant l'etanol com els polifenols del vi negre varen disminuir les concentracions circulants de l’antigen i el lligand del CD40, CD40, IL-16, monocyte chemoprotein (MCP) -1 i vascular cellular adhesion molecule (VCAM) -1. La concentració de glucosa en dejú es va mantenir constant al llarg de l'estudi, mentre que la concentració d'insulina plasmàtica i, en conseqüència, l'índex HOMA va disminuir després del vi negre i el vi negre desalcoholitzat. El colesterol HDL, l'apolipoproteïna AI i A-II van augmentar després de les intervencions amb vi negre i ginebra. La lipoproteïna (a) plasmàtica només va disminuir després de la intervenció amb vi negre. A més, la pressió sistòlica i diastòlica només van disminuir significativament després de la intervenció amb vi negre desalcoholitzat, canvis correlacionats amb un augment de la concentració plasmàtica d'òxid nítric. La pressió sistòlica i diastòlica van disminuir i l'òxid nítric va augmentar, encara que no significativament, després de la intervenció amb vi negre i també comparat amb la ginebra encara que tampoc significativament. El consum moderat de ginebra no va tenir cap efecte en la pressió arterial ni en la concentració plasmàtica d'òxid nítric. Per tant, els polifenols del vi negre disminueixen l'expressió de molècules d'adhesió leucocitàries i la pressió arterial, així com també milloren la resistència a la insulina mentre que tant l'alcohol com els polifenols del vi negre modulen els mediadors inflamatoris solubles en homes d'alt risc cardiovascular, conferint al vi negre més efectes protectors sobre la patologia cardiovascular que altres begudes alcohòliques. / "Benefit / risk balance of polyphenols and alcohol content of wine: scientific basis of the effects of moderate wine consumption on the cardiovascular system" The objective of this thesis is to evaluate the effects of the fractions of the wine (alcoholic and non-alcoholic, mainly polyphenols) on major cardiovascular risk factors in 67 men with at high risk of cardiovascular disease. We performed a clinical, randomized, crossover in which all participants received in a random order the following three interventions: 30 g alcohol / day as red wine, the equivalent amount of dealcoholized red wine and 30g alcohol / day as gin, for 28 days each intervention. The effects at the end of the three interventions on serum and cellular biomarkers of inflammation associated with atherosclerosis, glucose metabolism, lipid profile and blood pressure were evaluated. Moderate consumption of alcohol (red wine interventions and gin) increased interleukin (IL) -10 and decreased monocyte-derived chemoquine (MDC). Polyphenols in red wine (red wine and dealcoholized red wine interventions) decreased serum concentrations of intercellular adhesion molecule (ICAM) -1, E-selectin and IL-6, and inhibited the expression of lymphocyte function-associated antigen 1 ( LFA-1) on T lymphocytes and Mac -1, sLex (CD15) and CCR2 on the surface of monocytes. Both ethanol and wine polyphenols decreased circulating levels of CD40a, CD40L, IL-16, monocyte chemoprotein (MCP) -1 and vascular cellular adhesion molecule (VCAM) -1. The fasting blood glucose concentration was constant throughout the study, whereas the concentration of plasma insulin and consequently the HOMA index decreased after the red wine and the dealcoholized red wine interventions. HDL cholesterol, apolipoprotein AI and A-II increased after the intervention with red wine and gin. Lipoprotein(a) decreased only after the intervention with red wine. Moreover, the systolic and diastolic pressure significantly decreased only after the intervention with dealcoholized red wine, changes correlated with an increased plasma concentration of nitric oxide. In conclusion, red wine polyphenols modulate the expression of leukocyte adhesion molecules, insulin resistance and blood pressure, while both alcohol and red wine polyphenols modulate the soluble inflammatory mediators in men at high cardiovascular risk, conferring to red wine greater protective effects on cardiovascular diseases than other alcoholic beverages.

Cancer is one of the leading causes of death in countries throughout the world. Increase in the production of Reactive Oxygen Species (ROS) has been implicated in many human disease processes, including aging and carcinogenesis. Detoxification of ROS in the cell is provided by both enzymatic and non-enzymatic systems, which constitute the antioxidant defence systems and is crucial to the survival of organisms. The cancer inhibitory propierties of antioxidant compounds such as polyphenols have been well established in experimental and epidemiological studies, showing the intake of these antioxidants within our diet can carry out an effective protective action toward the oxidative stress created in the body by imbalance between ROS and its endogenous defence mechanism. However, the molecular mechanisms responsibles for these effects are not so well known and more studies are needed to provide clear evidence of their protective effects.The aim of this study is to determine and compare the posible antitumoral properties of several polyphenolic fractions, obtained from the extraction and fractionation of wine by-products consisting of grape skins, seeds and stems. These polyphenolic fractions have high antiradical potential and are mainly composed by flavanol monomers with or without gallate groups, glycosylated flavonols and mostly procyanidin oligomers. The effect of these fractions is analysed on cancer cells at cellular and metabolic levels. Moreover, as solar radiation in the UV range is the major source of adverse reactions in the skin and is one of the most efficient environmental carcinogen known, the possible capacity of these fractions to protect against cellular damage induced by ultraviolet radiation is evaluated and compared. The results obtained in this study let us to confirm the polyphenolic fractions studied are very specific antiproliferative agents with very low cytotoxicity to non-proliferative normal cells, such as peripherial blood lymphocites (PBLs). Moreover, treatment with these fractions results in intracellular metabolic changes, restricting the ability of tumoral cells to proliferate and inhibiting glycolysis, being higher for the fraction rich in ECG containing oligomeric flavanols.Like for the study of antitumoral effect at cellular and metabolic levels, the results obtained in the analysis of the protective capacity of these polyphenolic fractions against UV-induced damage, confirm them as potential natural chemopreventive agents. Briefly, the results obtained in this study let us to conclude the polyphenolic fractions rich in procyanidin oligomers and gallate esters are the most efficient as antitumoral agents, active at both cellular and metabolic levels with low cytotoxicity. Additionally, polymerization and percentge of galloylation are also important in the efficacy of the polyphenolic fractions as protectors against damage induced by ultraviolet radiation, suggesting they may be useful for the prevention and treatment of a variety of solar UV light-induced human skin disorders.

Una dieta rica en frutas y verduras parece ser importante para la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo y por tanto es posible que alguno de sus compuestos constituyentes o la interacción de varios de ellos sean los responsables del efecto protector que presentan. Los flavonoides son los principales candidatos debido su abundancia en el reino vegetal y la actividad antioxidante que presentan en su estado natural. Existe una gran variedad de flavonoides que difieren en su estructura. Las pequeñas diferencias en la estructura química resultan en grandes diferencias en el efecto biológico. Además cuando los flavonoides son ingeridos sufren biotransformaciones que modifican la estructura química de los compuestos y por lo tanto, la actividad biológica se ve modificada. Una gran parte de los flavonoides que forman parte de frutas y verduras se encuentra en forma polimérica y fundamentalmente son proantocianidinas. Así, el objetivo general de la presente tesis fue contribuir al establecimiento de las bases científicas para el uso de fracciones polifenólicas y fibra dietética constituidas básicamente por proantocianidinas en la prevención de enfermedades como el cáncer. Para ello, se realizó un estudio de la relación entre el grado de polimerización y porcentaje de galoización y el efecto antioxidante y biológico de fracciones de proantocianidinas de diferente composición en diferentes medios físico-químicos. Así, fracciones obtenidas de corteza de pino (exentas de galato), de subproductos del prensado de la uva (porcentaje de galoización media) y de Hamamelis (de elevada galoización) fueron caracterizadas por despolimerización ácida y posteriormente se evaluó la capacidad antioxidante (método DPPH, TEAC), antirradicalaria (método del radical HNTTM, TNPTM), inhibición a la oxidación lipídica y el efecto antiproliferativo en una línea celular de melanoma (SK-MEL-28). Los resultados mostraron que los efectos químicos y biológicos en los que están implicadas las proantocianidinas están influidos de menor a mayor grado por el grado de polimerización, porcentaje de galatos y porcentaje de grupos pirogalol. Además se realizó un estudio de las biotransformaciones que sufren las proantocianidinas utilizando como muestra rica en proantocianidinas una fibra dietética procedente de subproductos del prensado de la uva. Para ello, se realizó previamente la identificación de los compuestos fenólicos mayoritarios y posteriormente con el fin de avanzar en el conocimiento de los posibles efectos beneficiosos de los polifenoles, se realizó un estudio de identificación de metabolitos tras la ingesta de fibra antioxidante de uva en ratas. Experimentos en tándem (LC-MS/MS) permitieron identificar 18 metabolitos procedentes de epicatequina monomérica y diversos ácidos fenólicos resultantes de la fermentación colónica. PALABRAS CLAVE: Radicales libres, Actividad antioxidante, Polifenoles, Fibra dietética, Procianidinas / Many epidemiological studies indicate that a diet rich in flavonoids from vegetables and fruits appear to be inversely related to several diseases and cancer mortality. Flavonoids in food have been shown to have powerful free-radical scavenging activity, antioxidant activity, and anti-tumor promoting effect. There are more than 5000 different types of flavonoids with numerous structural variations within. Small differences in their structure are converted into great differences in their biological activity. Moreover, polyphenols are extensively metabolized in the intestinal tract and liver. Thus, it is very important to examine the action of these compounds from different angles and evaluate their effects and risks. The main objective of the present PhD has been to contribute to the knowledge of the chemical and biological effects of polyphenols, especially proanthocyanidins. The influence of the degree of polimeration and percentage galloylation and the biological activities of proanthocyanidins fractions were evaluated. The results show that the most cytotoxic /antiproliferative fractions showed also the highest electron transfer capacity. The study of the metabolization of polyphenols after the intake of antioxidant dietary fiber (GADF) rich in proanthocyanidins resulted in the identification of more than 18 metabolites such a epicatechin mono, di-, tri- conjugates and also phenolic acids from colonic fermentation and even phenolic acids conjugates with sulfated and glucuronide. KEYWORDS: Free radicals, Antioxidant capacitiy, Polyphenols, Dieraty fiber, Procianidins

During aerobic cell metabolism, molecular oxygen is reduced to water through electron-transfer reactions, and the oxygen not completely reduced is transformed into a set of neutral and free radical molecules with high oxidant ability, generally denominated Reactive Oxygen Species (ROS). To regulate the cellular ROS content, organisms are endowed with an efficient endogen antioxidant system. The physiological ROS levels may be excessively increased by different factors including unbalanced diets, ionizing radiations, and tobacco smoke among others, leading to the oxidative stress, term referred to the imbalance between ROS production and its neutralization by the endogenous antioxidant system. More importantly, in vitro and in vivo studies reveal the relationship between suffering oxidative stress and the development of cardiovascular and respiratory diseases, diabetes, and cancer. To prevent and treat the oxidative stress and its adverse effects, exogenous, readily oxidizable molecules may help the organism to neutralize ROS into less dangerous species. The phenolic compounds or (poly)phenols, molecules very abundant in our diet (i.e. fruits, vegetables, and beverages such as tea and wine) may be responsible for this antioxidant activity of fruits and vegetables. Currently, (poly)phenols are regarded as natural antioxidant molecules with outstanding beneficial effects, including anti-aging activity, and the prevention of cancer and diabetes. The antioxidant activity of (poly)phenols is mainly associated with their radical scavenging activity, action conferred by the transfer of a hydrogen atom or an electron to a free radical, rendering a less reactive molecule. On the other hand, chemical probes and in vitro studies have demonstrated that some highly reacting (poly)phenols are able to generate small quantities of ROS. Phenolic compounds have shown antiproliferative activity which may be caused inter alia by their ability to scavenge or generate toxic radicals. To further understand the connection between the redox reactivity of (poly)phenols and their biological actions, studies with more sensitive and selective chemical probes may help to clarify the role of redox reactions in the physiological actions of phenolics and their metabolites. In this thesis, we have focused on the utilization of two stable radicals synthesized in our laboratory, the tris(2,4,6-trichloro-3,5-dinitropehnyl)methyl (HNTTM) and the tris(2,3,5,6-tetrachloro-4-nitrophenyl)methyl)radical (TNPTM), as chemical probes to determine the electron-transfer activity of dietary (poly)phenols and some metabolites. The different reducing potential of the two stable radicals facilitates the quantitative evaluation of the radical scavenging capacity of each (poly)phenol, as well as the establishment of the most reactive moieties. TNPTM is a useful tool to determine the most reactive (poly)phenols as electron transfer donors, (poly)phenols that cannot be differentiate with any other chemosensor. The results obtained are compared with two well-established methods for the quantification of electron-transfer capacity. The action of these (poly)phenols on cell cultures of a colon cancer cell line is also presented, showing a correlation between those (poly)phenols detected with TNTPM and with those that produce the highest antiproliferative activity. This cell line is particularly relevant because dietary (poly)phenols are in contact with epithelial cells of this kind during their transit along the digestive tract and may exert some preventive action on colon cancer. In addition, a chemoenzymatic strategy to prepare glucuronated metabolites of (-)-epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG), the most abundant and active (poly)phenol of green tea, was attempted, obtaining the acetylated and methylated precursor of the EGCG-4’’-glucuronide, the most abundant EGCG glucuronide obtained in the human metabolism. The final conjugated, the EGCG-4’’-glucruonide, was obtained albeit with not enough quantity to be purified. / "Estudi de la Transferència Electrònica de compostos fenòlics i la seva relació amb l’activitat biològica en cèl•lules canceroses" En el metabolisme i respiració dels organismes aeròbics, l’oxigen és utilitzat com a receptor electrònic reduint-se principalment a aigua. Una petita part d’aquest oxigen no és totalment reduint obtenint-se un conjunt d’espècies radicalàries i no radicalàries (ROS). Aquestes espècies en ser altament reactives poden malmetre macromolècules, activitat que està relacionada amb l’aparició de malalties com el síndrome metabòlic i el càncer. Per aquest motiu els organismes han desenvolupat un sistema de regulació de la seva concentració. En determinades situacions, aquest sistema no és suficient i per tant, antioxidants exògens poden ajudar a aquest sistema endògen. Els polifenols molècules abundants en la nostra dieta (fruita i verdures) són els principals candidats, i s’ha demostrat un efecte preventiu i terapèutic en la salut per la seva part. L’efecte beneficiós exercit pels polifenols pot tenir lloc per dos mecanismes de reacció; per transferència d’hidrogen i per transferència electrònica. Actualment, no hi ha cap mètode prou eficaç que ens permeti determinar la acció del polifenols exercida per transferència electrònica, mecanisme que també habilita als polifenols per a formar ROS. En el nostre laboratori hem sintetitzat dos radicals lliures estables, els radicals tris(2,4,6-tricloro-3,5-dinitrofenil)metil (HNTTM) i el tris(2,3,5,6-tetracloro-4-nitrofenil)metil (TNPTM) com a quimiosensors de transferència electrònica. Aquests radicals ens permeten mesurar la activitat antiradicalària dels polifenols, i el TNPTM ens permet detectar a aquells polifenols amb una reactivitat per transferència electrònica més elevada i que no poden ser diferenciats amb altres mètodes. S’han fet estudis d’antiproliferació per part dels polifenols en cèl•lules de càncer de còlon HT-29 i s’ha demostrat que els polifenols amb més activitat antiproliferativa són els que tenen activitat front al TNPTM. Per tant, el radical TNPTM permet determinar als polifenols amb una elevada reactivitat per a cedir electrons i es suggereix que els mecanismes de transferència electrònica juguen un paper important en els mecanismes d’ antiproliferació en cèl•lules de càncer de còlon HT-29. S’ha proposat metodologia sintètica per a obtenir els principals glucuronats de l’epigal•locatequin-3-O-gal•lat (EGCG) el més abundant i més actiu dels polifenols del te verd. S’ha obtingut el precursor acetil•lat i metil•lat del glucuronat majoritari de l’EGCG obtingut en el metabolisme humà, l’EGCG-4’’-glucurònid i s’ha obtingut el conjugat final però no amb una quantitat suficient com per a ser aïllat.