Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-26T23:01:45Z No. of bitstreams: 1 TESE Francyelle Amorim Silva.pdf: 1932107 bytes, checksum: 00a84257e693b90952bd583265a56e17 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-26T23:01:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Francyelle Amorim Silva.pdf: 1932107 bytes, checksum: 00a84257e693b90952bd583265a56e17 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / FACEPE / O desenvolvimento de embalagens primárias comestíveis para conservação pós-colheita de frutas e hortaliças minimamente processadas tem motivado o desenvolvimento de novas tecnologias, a exemplo do emprego de pré-tratamentos químicos e o uso de filmes ou coberturas formadas com alginato e pectina, promovendo uma forma mais eficaz de retardar os danos causados pela injúria do corte aos tecidos vegetais. A preparação de filmes a partir de materiais biodegradáveis, como os polímeros naturais, tem surgido com a necessidade de substituir os polímeros sintéticos derivados do petróleo. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicação de biopolímeros combinados de alginato e pectina na conservação da manga ‘espada’ minimamente processada, devido à sua alta perecibilidade e tempo de vida pós-colheita relativamente curto. Testes preliminares foram realizados para verificação da melhor temperatura de armazenamento e tipo de tratamento químico fazendo uso de soluções a 1% de ácido ascórbico, ácido cítrico e cloreto de cálcio. As condições selecionadas foram empregadas em um planejamento experimental completo, tendo como variáveis independentes as concentrações de alginato, pectina e glicerol e como variável resposta a concentração de sólidos solúveis totais. Os frutos selecionados foram minimamente processados, tratados com uma solução a 1 % de ácido ascórbico, imersos na solução filmogênica e logo após em uma solução de cloreto de cálcio e glicerol, secados por 24 h e armazenados sob refrigeração a 9 ± 2 °C. Em seguida, novas formulações foram realizadas com base nos resultados do planejamento experimental, sendo selecionada a condição de 1 % (m/v) de alginato e 1,5 % (m/v) de pectina, a qual promoveu uma melhor conservação da fruta. As análises microbiológicas exigidas pela RDC n°12/2011 para coliformes termotolerantes e Salmonella indicaram que o produto está de acordo com os parâmetros exigidos pela legislação. / The development of edible primary packaging for post-harvest conservation of minimally processed fruits and vegetables has motivated the development of new technologies, such as use of chemical pretreatments and films or covers formed with alginate and pectin, promoting most effective way to slow the damage caused by cutting plant tissues. Films preparation from biodegradable materials, such as natural polymers, has arisen because of the demand in to replace synthetic polymers derived from petroleum. The aim of this study was to evaluate the application of biopolymers based on alginate and pectin on conservation minimally processed mango cv. ‘espada’, due to its high perishability and short post-harvest life. Preliminary tests were performed to verify the best storage temperature and chemical treatment using ascorbic acid, citric acid and calcium chloride 1 % solutions. The selected conditions were employed in a full experimental design, using alginate, pectin and glycerol concentrations as independent variables and total soluble solids as response variable. The selected fruits were minimally processed, treated with 1 % solution of ascorbic acid, immersed in the filmogenic solution and in a calcium chloride and glycerol solution, dried for 24 hours and stored under refrigeration at 9 ± 2 ° C. Then, new formulations were based on the results of the experimental design, being selected the condition of 1 % (w/v) alginate and 1.5 % (w/v) pectin, which promoted a better conservation of the fruit. Microbiological analysis required by RDC n°12/2011 for fecal coliforms and Salmonella indicated the conformity of the product with the parameters required by legislation.

Made available in DSpace on 2018-08-02T00:16:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_4388_Dissertação_Sabrina G.Broetto.pdf: 591525 bytes, checksum: 2dcadb12d1679ab6039c1bb169ffc62f (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade e a expressão gênica da pectinametilesterase, enzima relacionada às modificações da parede celular, e por consequência as alterações na qualidade dos frutos do mamoeiro (Carica papaya L.) cv. Golden durante o período pós-colheita, mantidos em condições naturais.Os frutos foram colhidos no estádio 2, higienizados e sanificados. Foram analisados durante 8 dias após a colheita (DAC) quanto às modificações no padrão de atividade das enzimas pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG), as características físicas como a firmeza e a expressão gênica da pectinametilesterase. Com o avanço dos dias de amadurecimento, a firmeza e a atividade enzimática foram avaliados quanto à sua inter-relação com os atributos qualitativos e observouse que estes se relacionam diretamente com algumas características pré e póscolheita. Os resultados obtidos comprovam a relação direta entre a atividade da pectinametilesterase com a perda de firmeza da polpa. A atividade da PME e da PG têm ação sinergística, sendo fundamentais para o adequado funcionamento dos mecanismos responsáveis por algumas das mudanças físicas ocorridas na polpa dos frutos. As análises da expressão gênica e da atividade da pectinametilesterase mostraram uma resposta antagônica durante a pós-colheita. O aumento da expressão da PME com o passar dos dias respondeu contrariamente à atividade da enzima que decresceu no mesmo período. Essa resposta sugere a rápida transcrição e utilização dos oligonucleotídeos para a transformação em proteínas ativas no processo de amadurecimento dos frutos.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacvao Silvio R C Barbosa 2008.pdf: 717228 bytes, checksum: d0896c3b0c9fa5a05f9d7107c2e59def (MD5) Previous issue date: 2008-05-30 / The fungus Sclerotinia sclerotiorum can interact with a great range of vegetable species as well as to obey to the discharge especificity and patogenic specialization . It is capable to digest the cellular wall of host plants using for such a series of biochemical mechanisms and morfogenetics that optimize the invasion. Several enzymes are produced during the interaction plant-host and among them they stand out the family of the poligalacturonases (PGs) and them beta glucanases. PGs catalyze the hydrolysis of the connection glycosídic bond - 1,4 and them beta glucanases liberate glucans and oligossacarídeos during the hydrolysis. Our work tried to characterize, besides the pH, the action of these enzymes, as well as the gene expression during the interaction with bean (Phaseolus vulgaris) and under different cultivation means, pectin 1%, wall extract 1% and glucose 1%. The activities were measured by the method DNS where the amount was measured of you sugar reducers in the middle and the gene expression through electrophoretic profiles analyzed after the technique of RT-PCR. The results showed variation of the activity of PGs in the interaction being the middle with pectin with larger expression of them. Them beta 1,3 and beta 1,4 glucanases were expressed in both culture means proposed, however there was larger production of beta 1,3 during the invasion. The variation of the expression of such enzymes in different culture means suggests complexity of specific biochemical roles for your production raising new approaches for the recognition of the roads that they promote the development of the disease / O fungo Sclerotinia sclerotiorum, pode interagir com uma grande gama de espécies vegetais bem como obedecer à alta especificidade e especialização patogênica. Ele é capaz de digerir a parede celular de plantas hospedeiras utilizando para tal uma série de mecanismos bioquímicos e morfogenéticos que otimizam a invasão. Várias enzimas são produzidas durante a interação planta-hospedeiro e dentre elas se destacam a família das poligalacturonases (PGs) e as beta glucanases. As PGs catalisam a hidrólise da ligação glicosídica α- 1-4 e as beta glucanases liberam glucanas e oligossacarídeos durante a hidrólise. Nosso trabalho procurou caracterizar, além do monitoramento do pH, a ação destas enzimas, bem como a expressão gênica durante a interação com feijão ( Phaseolus vulgaris ) e sob diferentes meios de cultivo, pectina a 1%, extrato de parede celular de plantas de feijoeiro a 1% e glicose 1%. As atividades foram medidas pelo método DNS onde mediu-se a quantidade de açucares redutores no meio e a expressão gênica através de perfis eletroforéticos analisados após a técnica de RT-PCR. Os resultados mostraram variação da atividade das PGs na interação sendo o meio com pectina com maior expressão delas. As beta 1,3 e beta 1,4 glucanases foram expressas em ambos os meios de cultura propostos, contudo houve maior produção de beta 1,3 durante a invasão. A variação da expressão de tais enzimas em diferentes meios de cultura sugerem complexidade de rotas bioquímicas específicas para sua produção suscitando novas abordagens para o reconhecimento dos caminhos que promovem o desenvolvimento da doença.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-05T13:20:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 754082 bytes, checksum: 9fbc505e90247c8c5cba11e335573762 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T13:20:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 754082 bytes, checksum: 9fbc505e90247c8c5cba11e335573762 (MD5) Previous issue date: 2002-03-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As mutações espontâneas na espécie Lycopersicon esculentum têm sido muito utilizadas pelos melhoristas como fonte de variabilidade genética com o objetivo de produzir tomates que apresentem maior resistência ao manuseio pós-colheita. Na região produtora de hortaliças de Viçosa, MG, identificaram-se plantas de tomate ‘Santa Clara’ cujos frutos apresentam coloração “amarelo-creme” quando imaturos e diversos aspectos de seu amadurecimento alterados. O objetivo do presente trabalho foi de estudar as alterações fisiológicas, visuais e ultraestruturais em frutos de tomateiro do cv. Santa Clara e seu mutante natural ‘Firme’ durante o amadurecimento na planta e o efeito da aplicação de etileno em frutos colhidos no estádio verde-maduro. Durante o amadurecimento na planta, os frutos ‘Santa Clara’ apresentaram mudança de cor da epiderme mais gradual e menos intensa do que os frutos mutantes, que apresentaram maior intensidade de cor vermelha nos últimos estádios de maturidade; observou-se aumento nos teores de carotenóides totais e licopeno de mais de 20 vezes tanto para frutos normais como para frutos mutantes. Os estudos de ultraestrutura evidenciaram que durante o amadurecimento de tomates ‘Santa Clara’ os cloroplastos pré-existentes se diferenciam em cromoplastos; por outro lado, no mutante ‘Firme’ a diferenciação em cromoplastos pode ocorrer inteiramente independente da presença de cloroplastos. Os frutos mutantes, durante o amadurecimento na planta, apresentaram menor produção de CO 2 e etileno em todos os estádios de amadurecimento; apesar da atividade da oxidase do ACC ter apresentado padrão de comportamento distinto durante o amadurecimento na planta entre frutos mutantes e normais, a magnitude da atividade foi a mesma. Frutos mutantes apresentaram atraso no aumento da atividade da enzima poligalacturonase em relação aos frutos normais. Os frutos normais acumularam açúcares durante seu amadurecimento na planta, enquanto que os frutos mutantes perderam açúcares com o amadurecimento, sendo que estes apresentaram teores de açúcares totais menores do que os de tomates normais tanto no pericarpo quanto no tecido locular. As mudanças fisiológicas características do amadurecimento dos frutos de tomate, como a perda de firmeza e a mudança de cor, foram influenciadas de maneira semelhante pela aplicação de etileno em frutos colhidos no estádio verde-maduro e armazenados a temperatura ambiente tanto para frutos normais como para frutos mutantes, o que indica que a sensibilidade do tecido ao etileno não foi alterada pela mutação. Os frutos mutantes apresentaram atraso na produção autocatalítica de etileno em relação aos frutos normais após a aplicação de etileno. A menor dose de etileno, 100 μL.L -1 , foi suficiente para acelerar o amadurecimento dos frutos do cv. Santa Clara assim como de seu mutante natural ‘Firme’. / Breeders have been using natural mutants of Lycopersicon esculentum species as source of genetic variability to enhance tomato fruit postharvest life. ‘Santa Clara’ tomato plants showing pale-yellow fruits and others fruit ripening aspects changed were found in Viçosa, MG. The aim of this work was to study the physiological, visual, and ultrastructural changes during ripening of ‘Santa Clara’ and ‘Firme’ fruits attached to the plant and the effect of exogenous ethylene on ripening of mature green fruit. ‘Santa Clara’ fruit showed a more gradual and less intense change on skin color than mutant fruit; we reported a rise higher than twenty fold in total carotenoids and lycopene levels during fruit ripening for ‘Santa Clara’ and ‘Firme’ fruits. Ultrastucture studies provide evidence that during ‘Santa Clara’ tomato fruit ripening chromoplast indeed differentiate from preexisting chloroplast; on the other hand, chromoplast differentiation in mutant fruit indicates that chromoplast development can be a process entirely independent of the chloroplast. Mutant fruit showed lower ethylene and CO 2 production at all maturity stages. ACC oxidase activity showed a distinct pattern during ripening of attached wild type and mutant fruits, nevertheless, the amount found for mutant and wild type were practically the same. Mutant fruit showed a delay on poligalacturonase activity rise comparing to wild type fruit. While wild type fruit showed a rise on total soluble sugars content during ripening mutant fruit showed a decrease on it, nevertheless, mutant fruit showed lower levels than wild type fruit for locular and pericarp total soluble sugars content at all maturity stages. Physiological changes during tomato fruit ripening, such as firmness loss and color change, were effected in a similar way by application of exogenous ethylene on mature green fruit stored at room temperature for mutant and wild type fruit, indicating that mutation did not change tissue ethylene-sensitivity. Mutant fruit showed a delay on autocatalytic ethylene production after application of exogenous ethylene when compared to ‘Santa Clara’ fruit. The lower ethylene concentration studied, 100 μLL -1 , enhanced ripening of ‘Santa Clara’ and ‘Firme’ fruits. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciane Curtes Porfirio da Silva.pdf: 404496 bytes, checksum: f4f290399b0bc83914b1512ccbe10ac6 (MD5) Previous issue date: 2008-08-22 / Refrigerated storage is the main technology for maturity control and for minimizing deterioration of the fruit. However, because kaki (‘Fuyu’) is sensitive to cold temperatures, it can develop physiological disorders depending on the temperature and period of storing. Thus, considering its commercial value, this study aims to contribute with knowledge related to its postharvest quality. Commercial product Promalin® was applied to a plant sample of the fruit whereas another sample did not receive the product. The harvested fruit were stored in cold chamber (4ºC, commercial use) and in room temperature (20 to 26 ºC). The quality loss of the fruit was monitored during the storage. The cold chamber kept good fruit firmness quality for commercialization over 16 days, for both treatments, without and with the Promalin® application in the orchard, while in room temperature the periods were 16 and 8 days respectively. And Promalin® contributed for the bettering of firmness of these stored fruit, during the same time period, in the cold chamber. The Promalin® product anticipated the loss of firmness at room temperature compared to fruit that did not receive this product, and the activity of the poligalacturonase (PG) enzyme was coincident. The enzyme activity was coincident, whereas to what concerned to the poliphenoloxidase (PFO) enzyme, as long as the fruit presented acceptable firmness for its commercialization in cold chamber, there were not significant changes in its activity neither in those fruit without Promalin® nor in those which received the application of this product in the orchard. The total soluble solids, measured as °Brix, did not suffer significant change during its storage in cold chamber. / O armazenamento sob refrigeração é a principal tecnologia para retardar o metabolismo e consequentemente controlar a maturação e minimizar a deterioração de frutos. No entanto, o caqui por ser sensível ao frio, pode desenvolver desordens fisiológicas, dependendo da temperatura e do período de armazenagem. Assim, considerando a importância comercial do caqui ‘Fuyu’, essa pesquisa teve por meta fazer uma contribuição ao conhecimento relacionado com a pós-colheita desse fruto. Em frutos de uma amostra de plantas de caqui foi aplicado o produto comercial Promalin® e outra amostra não recebeu esse produto. Os frutos colhidos foram armazenados em câmara fria (4ºC, uso comercial) e em temperatura ambiente (20 a 26ºC). A qualidade dos frutos foi monitorada durante a armazenagem. A utilização da câmara fria manteve a boa firmeza dos frutos para a comercialização acima de 16 dias, para ambos os tratamentos, sem e com a aplicação de Promalin® no pomar, enquanto que, na temperatura ambiente os tempos foram de 16 e 8 dias, respectivamente. E o Promalin® contribuiu para a melhoria da firmeza desses frutos armazenados, em igual tempo, na câmara fria. O produto Promalin® antecipou a perda de firmeza de frutos armazenados à temperatura ambiente, em comparação com frutos que não receberam esse produto, e, a atividade da enzima poligalacturonase (PG) foi coincidente. Com relação à atividade da enzima polifenoloxidase (PFO), enquanto o fruto apresentou firmeza aceitável para a comercialização em câmara fria não houve mudança significativa de sua atividade, tanto nos sem Promalin® como nos frutos que receberam a aplicação desse produto no pomar. Os sólidos solúveis totais, medidos como °Brix, não sofreram mudança significativa durante o armazenamento em câmara fria.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:17:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moacir Couto.pdf: 1480768 bytes, checksum: 4fb4ab95fcee8af72518a1e8af1c3f37 (MD5) Previous issue date: 2006-05-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O cúbio (Solanum sessiliflorum Dunal) é um fruto com elevado potencial agroindustrial devido à sua alta produtividade anual e características nutricionais (alto teor em fibras dietéticas). Além disso, as fibras estão contidas nos alimentos vegetais e têm funções preventivas de doenças crônico-degenerativas, a exemplo do diabetes mellitus e (ou) das dislipidemias, o que as situa na categoria de alimentos funcionais ou nutracêuticos. Não obstante, se, por um lado, algum conhecimento acerca do ciclo de vida do cúbio já foi desvendado (sobretudo no estádio de fruto maduro), assim como de sua utilidade na produção de diversos gêneros alimentícios (bebidas, geléias), por outro lado, há precariedade nos conhecimentos científicos relativos tanto à sua maturação fisiológica pré- e pós-colheita, quanto ao seu potencial toxicológico (produção de glicoalcalóides). Deste modo, neste trabalho pretendeu-se, primeiramente, verificar outros estádios de maturação viáveis do cúbio e, com isso, aumentar o seu potencial de utilização alimentar, com base em parâmetros abióticos (temperatura), na aparência (coloração em especial) dos frutos, em índices físicos de maturação (peso do fruto, diâmetros), e na manutenção, ou não, de seu frescor, utilizando frutos verdes provenientes da área de plantio da Estação Experimental de Olericultura Tropical (EEOT) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), em Manaus, AM, Brasil, com características geológicas de terra firme. Uma segunda etapa experimental foi constituída de análises físico-químicas: umidade, pH, acidez titulável, sólidos solúveis (ºBrix), relação Brix/acidez, carotenóides totais, açúcares redutores e não-redutores, lipídios, proteínas, cinza, fibras totais, sólidos insolúveis em álcool e pectina, com frutos oriundos de outra área de plantio situada no Ariaú, município de Iranduba, AM, Brasil, pertencente ao INPA e com características geológicas de várzea. Objetivou-se, então, verificar as mudanças dos índices físico-químicos de maturação de quatro estádios dos frutos colhidos (verde, de vez, maduro e muito maduro). Considerando que a textura dos frutos é grandemente influenciada pela atividade das enzimas pectinolíticas pectinesterases (EC 3.1.1.11) e poligalacturonases (EC 3.2.1.15), sobre os constituintes da parede celular substâncias pécticas, como a pectina sua análise constituiu uma parcela de grande interesse no presente trabalho. Enfim, uma análise qualitativa preliminar do teor de alcalóides totais nos diferentes estádios de maturação do cúbio serviu para melhor avaliar a relação risco/benefício de seu consumo diário. Os modelos de análise de regressão foram padronizados para 95% de confiança ou P (0,05). O formato predominante do cúbio foi cordiforme (1,2), mostrando-se um fruto resistente em atmosfera ambiente sem fatores estressantes no período pós-colheita, dado ter perdido o frescor só no sexto dia e mudado de cor a partir do sétimo dia. O estádio de fruto verde não se mostrou, todavia, adequado para a colheita, demonstrando ser o cúbio um fruto inteiramente dependente da planta para o seu perfeito amadurecimento em atmosfera ambiente. O fruto maduro mostrou-se crítico na manutenção da umidade, considerando que a partir desse estádio a perda de água tornou-se evidente (91,72% no fruto maduro para 91,42% no fruto muito maduro). Todos os índices físico-químicos de sabor mostraram tratar-se de um fruto ácido com baixo grau de doçura. Os carotenóides totais alcançaram um valor máximo de 0,217 mg% no estádio de fruto muito maduro. Os açúcares redutores alcançaram o maior nível (2,91 g por 100 g) no estádio de vez, justificando a classificação do cúbio dentre os frutos hipocalóricos (açúcares ≤ 5 g por 100 g). As outras macromoléculas com valor energético, como os lipídios e proteínas, elevaram-se do fruto verde ao muito maduro, sem, no entanto, atingirem um valor dietético significativo ≥ 1 g por 100 g. Os sólidos solúveis em álcool mostraram os níveis mais elevados nos estádios de fruto verde e de vez (4,0 g por 100 g), com um perfil paralelo àquele da pectina, cujo nível máximo situou-se no fruto verde de 2,54 g por 100 g, diminuindo até o muito maduro (1,57 g por 100 g), correlacionando-se fortemente com a atividade da pectinesterase (100%) e com aquela da poligalacturonase (100%). O pico de atividade da pectinesterase situou-se no estádio de fruto de vez, ao passo que o pico da poligalacturonase situou-se no estádio de fruto muito maduro, assemelhando-se esse perfil de atividade enzimática àquele de outras solanáceas muito consumidas, como o pimentão (Capsicum annum L.). As análises qualitativas dos alcalóides totais, com solução de MAYER, mostraram a resposta maior (+++/3) no fruto verde do que em outros estádios, confirmando o consenso da literatura especializada, segundo o qual a maior produção de alcalóides se encontra nas partes imaturas da planta. Com esse conjunto de informações correlatas pretendeu-se fornecer as bases bioquímicas que caracterizam a maturação do cúbio e, por conseguinte, a sua qualidade pós-colheita, com a finalidade de aprimorar o seu aproveitamento alimentar.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T20:04:36Z : No. of bitstreams: 1 freitas_pm_dr_rcla.pdf: 670514 bytes, checksum: 22df87c8cdf056a03825df30dc778c89 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas, produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 5,5 e em 55oC. A poligalacturonase bruta apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas de 55 a 60oC. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também ocorreu em pH 5,5 e a 55oC. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5, com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60oC. A enzima purificada foi totalmente inibida por Ca2+, Cu2+, Hg2+ e 80% inibida por Fe2+ e Ag+. Mg2+ estimulou a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem endo/exo misto. O Km com pectina de citrus foi 10,78mg mL-1 e a Vmax foi 2379,04μmolmin-1mg-1. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou modificação de material vegetal, aditivo... / Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase (18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72 hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55oC. Crude polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at pH 6.5, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60oC. This enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was 53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of 3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55oC. The purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to 100%, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60oC. The purified enzyme was totally inhibited by Ca2+, Cu2+, Hg2+ and 80% inhibited by Fe2+ and Ag+. Mg2+ increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%) was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage. The Km with citrus pectin was 10.78mg mL-1 and the Vmax was 2379.04μmolmin-1mg- 1. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents, textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material, animal feed additive and wine and juice processing.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6246.pdf: 4525981 bytes, checksum: 69b0012bfc897e466c42b6036376948c (MD5) Previous issue date: 2014-08-12 / Universidade Federal de Minas Gerais / Polygalacturonases (PGases) are enzymes which hydrolyze glycosidic linkages - 1,4 between pectic acid residues, and are produced by plants, fungi, bacteria and yeasts. The fungus L. gongylophorus, Atta sexdens ant mutualist, secretes enzymes with PGase activity. The project was developed in two approaches: study with recombinant and native PGase. The activity on polygalacturonic acid of native PGase in fungus culture medium was determined, and its purification from crude extract was performed by (NH4)2SO4 precipitation and molecular exclusion chromatography. PGase kinetic parameters (Vmax and KM), optimal pH and temperature were determined, and the enzyme was immobilized on magnetic particles, proved to be a good method to future work inhibitors search. A cDNA library was constructed from total RNA obtained from L. gongylophorus culture in induction medium. 816 clones from the library were sequenced, allowing the identification of enzymes sequences involved in the plant cell wall degradation, some already in cloning and expression in our laboratory. Using a deposited L. gongylophorus PGase (PGase-Lg) sequence (GenBank: ADV30326.1), primers were designed to amplify the PGase-Lg gene, with cleavage sites for EcoRI, HindIII and NotI enzymes, respecting the pETSUMO (for E. coli expression) and pPICZA (for P.pastoris expression) reading phase vectors. From the cDNA, the PGase-Lg ORF encoding was amplified by PCR and cloned in both vectors. The clones were confirmed by plasmid DNA extraction and PCR. E. coli expression experiments of pETSUMO-PGase-Lg construction showed a great expression of His.tag-SUMO.tag-Lg-PGase fusion protein in the insoluble form and many expression and solubility assays were inefficient in solubility of expressed fusion protein. The protein refolding was performed and this was obtained in soluble form but lacks PGase activity, showing that folding may not have been correctly or E. coli fusion protein expressed does not undergo post-translational modifications to have enzymatic activity. The rPGase-Lg expressed in P. pastoris showed PGase activity on polygalacturonic acid and electrophoresis analysis suggest more than one enzyme expression, with different glycosylation content. / Poligalacturonases (PGases) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas -1,4 entre resíduos de ácido péctico, e são produzidas por plantas, fungos, bactérias e leveduras. O fungo L. gongylophorus mutualista da formiga Atta sexdens, secreta enzimas com atividade PGase. O projeto foi desenvolvido sob duas abordagens: estudo com a PGase nativa e recombinante. A atividade sobre ácido poligalacturônico da PGase nativa foi determinada no extrato bruto do fungo, e sua purificação foi feita por precipitação com (NH4)2SO4 e cromatografia de exclusão molecular. Temperatura e pH ótimos e parâmetros cinéticos Vmax e KM foram determinados, e a PGase foi imobilizada em partículas magnéticas, mostrando ser um bom método na busca de inibidores. Construiu-se uma biblioteca de cDNA a partir de RNA total obtido de cultura de L. gongylophorus em meio indutor. Foram sequenciados 816 clones da biblioteca, permitindo identificar sequências de enzimas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, algumas em fase de clonagem e expressão em nosso laboratório. Utilizando uma sequência de PGase de L. gongylophorus (PGase-Lg) depositada (GenBank: ADV30326.1), foram desenhados oligonucleotídeos para a amplificação do gene da PGase-Lg, com sítios de clivagens das enzimas EcoRI, HindIII e NotI, respeitando a fase de leitura dos vetores pETSUMO (para expressão em E.coli) e pPICZA (para expressão em P.pastoris). A partir do cDNA, a ORF codificante da PGase-Lg foi amplificada por PCR e clonada nos dois vetores. Os clones foram confirmados por extração de DNA plasmidial e PCR. Experimentos de expressão em E. coli da construção pETSUMO-PGase-Lg apresentaram grande expressão da proteína em fusão His.tag-SUMO.tag-PGase-Lg na forma insolúvel, e vários ensaios de expressão e solubilidade se mostraram ineficientes na solubilidade da proteína em fusão expressa. Realizou-se o refolding da proteína e esta foi obtida na forma solúvel, porém sem atividade, mostrando que o enovelamento pode não ter ocorrido corretamente ou que a proteína em fusão expressa pela E. coli não sofre as modificações pós-traducionais necessárias. A rPGase-Lg expressa em P. pastoris apresentou atividade PGase em ácido poligalacturônico, e análise em eletroforese sugere a expressão de mais de uma proteína, com conteúdos diferentes de glicosilação.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4425.pdf: 4096750 bytes, checksum: d77921e33ac24b167ed701cea4759eb0 (MD5) Previous issue date: 2012-04-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant cell walls are composed of approximately 65% cellulose microfibrils and pectin. The latter is proteolytically degraded by the so-called pectinases enzymes (also known as pectinolytic enzymes). Pectinases may be either depolymerizing. They are produced by plants, filamentous fungi, bacteria, and yeast. Due to the wide commercial use of pectinase, one has testified a growing number of studies devoted to understand the activities of such enzymes. Bioinformatics tools were employed throughout this work in order to study fungal polygalacturonase (PG) under two aspects. Firstly, all stored fungal PG sequences in databases (2093) were analyzed in order to evaluate through searching for sequential motifs and phylogenetic studies the possibility to classifying the enzymes as either Endo- or Exo-PG. After excluding those with less than 70 amino acids, those that corresponded to the hypothetical protein , and those that were neither PG nor fungal PG, there were 957 sequences left. Those sequences were separated according to genus and species. For each group, multiple sequence alignments were made by using ClustalW software. The alignments were analyzed and the sequences displaying 100% identity were then expunged, thus resulting in a database of unique sequences of fungal PG. By means of the alignment, the study of structural motifs, and the construction of phylogenetic trees, one was able to classify all the sequences according to their mode of action in either Endo- or Ex-PG. Throughout the second part of our research, protein homology-modeling methods were employed while constructing a three-dimensional model of a L. gongylophorus fungal polygalacturonase, symbiont of leaf-cutting ant. The model was validated by PROCHECK, VERIFY 3D, and WHAT IF software. By analyzing the 3D model of the L. gongylophorus PG, a catalytic mechanism of the enzyme was outlined, which may take place by inverting the configuration of sugar anomeric carbon (substrate). / A parede celular de células de plantas é composta de aproximadamente 65% de rede de celulose e rede de pectato. Essa última é proteoliticamente degradada por enzimas chamadas pectinases ou enzimas pectinolíticas. As pectinases podem ser despolimerizantes ou desesterificantes e são produzidas por plantas, fungos filamentosos, bactérias e leveduras. Impulsionado pelas aplicações comerciais que pectinases representam, é crescente o estudo para o melhor entendimento sobre as atividades dessas enzimas. Ferramentas de bioinformática foram usadas neste trabalho para estudar poligalacturonases (PG) de fungos, sob dois aspectos. Na primeira parte do trabalho, todas as sequências de PG de fungos depositadas em bancos de dados (2093) foram analisadas e avaliadas quanto à possibilidade de classificação das enzimas em Endo- ou Exo-PG através de busca de motivos sequenciais e estudos filogenéticos. Após exclusão daquelas com menos de 70 aminoácidos, das que correspondiam a 'proteína hipotética' e ainda das que não eram PG ou mesmo não eram PG de fungos restaram 957 sequências. Essas sequências foram separadas por gênero e espécie e para cada grupo foram realizados alinhamentos múltiplos de sequências usando o programa ClustalW . Os alinhamentos foram analisados e as sequências com 100% de identidade foram retiradas, resultando em um conjunto de dados com 417 sequências únicas de PG de fungos. Através dos alinhamentos, do estudo de motivos estruturais e da construção de árvores filogenéticas foi possível classificar todas as sequências de acordo com seu modo de ação em Endo- ou Exo-PG. Na segunda parte do trabalho foi usado o método de modelagem por homologia na construção do modelo tridimensional de uma poligalacturonase do fungo L. gongylophorus, simbionte de formigas cortadeiras. O modelo foi validado com os programas PROCHECK, VERIFY 3D e WHAT IF. Através da análise do modelo 3D da PG do L. gongylophorus foi possível propor um mecanismo de ação da enzima, que deve ocorrer com inversão da configuração do carbono anomérico do açúcar (substrato).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-25Bitstream added on 2014-06-13T20:08:23Z : No. of bitstreams: 1 monteiro_ac_me_rcla.pdf: 419901 bytes, checksum: 6e17ba68310913d5db3d8de5269a40dd (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As pectinases são enzimas com importantes aplicações econômicas, especialmente na indústria alimentícia. Pectinases termoestáveis, produzidas por microrganismos termofílicos, apresentam uma série de características que favorecem sua aplicação em processos industriais, como, por exemplo, estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura e maior tolerância a agentes químicos desnaturantes de proteínas. Contudo, os principais microrganismos empregados na produção de poligalacturonases (PGs) são fungos mesofílicos. O presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo comparativo de produção de PGs em fermentação em estado sólido (FES) por fungos mesofílicos e termofílicos. Foram utilizados os fungos mesofílicos Aspergillus niger NRRL 3112 e Penicillium itallicum IZ 1584, reconhecidos como bons produtores de PGs, os termofílicos Thermomyces lanuginosus ROB e Rhizomucor pusillus A13.36 e o termodúrico Aspergillus fumigatus N31. Os microrganismos foram cultivados em FES em farelo de trigo, os mesofílicos a 27ºC e os demais a 45ºC, por períodos de 10 a 15 dias. Os maiores produtores de PG foram P. itallicum IZ 1584 (51U/g) e A. fumigatus N31 (59,40 U/g). As PGs dos fungos termofílicos apresentaram maiores valores de temperatura ótima e maior termoestabilidade que as dos mesofílicos. T. lanuginosus produziu PG com maior valor de temperatura ótima (70ºC). A. fumigatus produziu a PG mais termoestável, que conservou 100% da atividade original após 1 h de incubação a 50ºC em ausência de substrato. Cromatografias em filtração em gel e zimogramas revelaram a expressão de 7 isoformas de PG em A. niger NRRL 3112, 3 isoformas em P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB e R. pusillus, e 2 isoformas em A. fumigatus N31. / Pectinases are enzymes with important economic applications, especially in food industry. Termostable pectinases, produced by termophilic microorganisms, display an array of characteristics that support their application in industrial processes, such as stability through a wide pH and temperature range, as well as higher tolerance to protein denaturating chemical agents. However, the major microoganisms employed in polygalacturonases (PGs) prodution are mesophilic fungi. The present work aimed to make a comparative study of PG production by mesophilic and thermophilc fungi in Solid-State Fermentation (SSF). The fungi employed were the mesophilic Aspergillus niger NRRL 3112 and Penicillium itallicum IZ 1584, both known as good PGs producers, the thermophilic Thermomyces lanuginosus ROB and Rhizomucor pusillus A13.36 and the termoduric Aspergillus fumigatus N31. The fungi were bred in wheat bran in SSF, the mesophilic at 27ºC and the others at 45ºC, during periods of 10 to 15 days. The higher PGs producers where P. itallicum IZ 1584 (51U/g) and A. fumigatus N31 (59,40 U/g). PGs of thermophilc fungi have shown higher values of optimum temperature and termostability than mesophilic PGs. T. lanuginosus produced PG with the higher value of optimum temperature for activity (70ºC). A. fumigatus have shown the most thermostable PG, which mantained 100% of its original activity after 1 h of incubation at 50ºC in absence of substrate. Gel filtration chromatography and zymograms revealed the expression of 7 PG isoforms for A. niger, 3 isoforms for P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB and R. Pusillus, and 2 isoforms for A. fumigatus N31.