Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el fin de pesquisar y describir las lesiones pulmonares en Lobos marinos (Otaria flavescens), se realizó un estudio radiográfico simple de tórax a 20 ejemplares cachorros y juveniles. También se realizaron lavados traqueales para la obtención de muestras que fueron analizadas para la búsqueda de bacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis, mediante la prueba de Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR), con el objetivo de investigar la presencia de tuberculosis pulmonar. Para ambos estudios los animales se encontraban bajo anestesia general mediante la utilización de Isofluorano, con buena respuesta a la inducción y recuperación. Se logró estandarizar la técnica radiográfica, kVp y mAs, y se extrapoló técnica de lavados traqueales de caninos a lobos marinos. Los resultaron mostraron que 11 animales (55%) presentaban algún tipo de lesión pulmonar, en 10 individuos (50%) se observó un infiltrado del parénquima pulmonar, en 5 de ellos este infiltrado es de tipo difuso, mientras que en los 5 restantes es de tipo celular. En cuanto a la presencia de broncogramas aéreos positivos (BAP), éste estuvo presente en 9 de los individuos en estudio (45%). En lo referente la prueba de PCR, ésta arrojó resultados negativos en la totalidad de los animales, probablemente, debido a que los animales no se hayan encontrado infectados con alguna bacteria del complejo M. tuberculosis

A Mycoplasma pneumoniae se le atribuye entre un 15 a 20% de las neumonías adquiridas en la comunidad en los adultos mayores. Este estudio, el primero realizado en Chile para adultos mayores, se hizo para conocer la frecuencia, mediante la técnica de Reacción de la Polimerasa en Cadena, de Mycoplasma pneumoniae en este grupo etario y para probar la sensibilidad y especificidad analítica de ésta usando los partidores para el gen de la adhesina P1 y el gen del rRNA de 16S en el diagnóstico de dicho microorganismo, datos que no han sido estandarizados, como sí lo son las pruebas diagnósticas de Serología. Sin embargo, las pruebas de Serología no cuentan con una sensibilidad lo suficientemente buena, por lo que es necesario aplicar técnicas más sensibles y rápidas para la detección de Mycoplasma pneumoniae como lo es la Reacción de la Polimerasa en Cadena. Para llevar a cabo el estudio se tomaron muestras de expectoración y de sangre a 84 adultos mayores con neumonía adquirida en la comunidad, pertenecientes al Hospital Clínico de la Universidad de Chile, entre Agosto de 2002 a Septiembre de 2004, a los cuales se les realizó la técnica de Reacción de la Polimerasa en Cadena para ambos genes y la técnica de Serología Inmunofluorescencia Indirecta para IgM e IgG. A partir de los datos obtenidos se determinó que el porcentaje de Mycoplasma pneumoniae presente en los pacientes con neumonía fue de 8.3%, cifra inferior a la citada por la literatura y a la obtenida mediante la complementación de las técnicas de Reacción de la Polimerasa en Cadena y serología. Entre ambos partidores no existen diferencias significativas en cuanto a su sensibilidad y especificidad analítica. No obstante, se requiere de más estudios que verifiquen la calidad de estas técnicas para que lleguen a estandarizarse y constituir así técnicas de diagnóstico rápido de Mycoplasma pneumoniae, lo cual contribuiría importantemente a la clínica.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la producción de carne para consumo humano, una de las características más importantes del producto para los consumidores es la terneza de la carne, la cual posee un componente genético asociado, genes que codifican las enzimas que participan en el proceso de degradación de la carne en el postmortem y que pueden sufrir cambios en sus secuencias, del tipo polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), que generan cambios en estas enzimas y por ende cambios en la característica del producto. Este hecho, hace muy importante el tener una herramienta de detección eficiente y rápida de estas variaciones genéticas. Muestras de semen de toros procedentes del catálogo de inseminación artificial de INDAP, 2007 y muestras de tejido de novillos híbridos de Wagyu, fueron sometidas a extracción de DNA, comprobando la efectividad de ésta mediante medición de concentración de DNA en espectrofotómetro. Se implementó una técnica de reacción de polimerasa en cadena alelo específica (AS – PCR), la cual fue aplicada a las muestras con alta concentración de DNA extraído, utilizando partidores sintetizados para los SNP CAPN1 – 316, CAPN1 – 530 y CAST – 2959. Los resultados del AS – PCR fueron confirmados con secuenciación de varias muestras. La extracción de DNA fue más efectiva en las muestras de tejido de novillos Wagyu que en las muestras de semen, probablemente por el estado de conservación de la muestra, el grado de condensación del DNA en los espermatozoides y la presencia de inhibidores en el semen. La implementación y ajuste de parámetros en el PCR se hizo de la misma forma que lo observado en la literatura, obteniendo resultados similares en frecuencias genotípicas y su asociación con el rasgo fenotípico, a estudios previos en el tema. La secuenciación de las muestras dejó en evidencia la eficiencia de la Taq polimerasa en la fase de extensión y además, identificó la presencia de una secuencia extra en el alelo C de CAPN – 316, compatible con los “directos repetidos” y con el proceso de arrastre de exones que ocurren durante la recombinación genética y la evolución de los genes. Todos los datos nos permiten concluir que la técnica de AS – PCR es una herramienta efectiva para determinar variaciones del tipo polimorfismo de un solo nucleótido en genes relacionados con características de importancia productiva. / Proyecto Bicentenario PSD23

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S.E) es el serotipo de Salmonella más involucrado en la presentación de enfermedades transmitidas por los alimentos en nuestro país, siendo los productos de la industria avícola la mayor fuente de infección para el hombre. Por esta razón, su diagnóstico y control se hace cada vez más importante en los productos de esta industria para evitar brotes que pongan en riesgo la salud de la población. El cultivo bacteriológico es la prueba diagnóstica tradicional para la detección de S.E en muestras de tejidos de animales, que a pesar de tener una sensibilidad y especificidad apropiada, presenta la gran limitante de tomar como mínimo 4 a 7 días para entregar resultados. Con el fin de reducir el tiempo de diagnóstico, sin disminuir la especificidad y sensibilidad, es que se han desarrollado metodologías alternativas, entre las cuales el PCR ha ocupado un lugar privilegiado, logrando reducir los tiempos de detección y procesar una gran cantidad de muestras en forma simultánea. El objetivo de este trabajo fue implementar la prueba de PCR convencional, para la detección de S.E, utilizando partidores específicos para detectar el gen invA, y un tratamiento de muestras que incluyó la incubación de éstas en caldo Rappaport Vassiliadis 37ºC por 48 horas y un complejo proceso de extracción de ADN bacteriano, para evitar la acción de inhibidores. Para esto, se realizó una primera etapa en que se implementó la técnica, utilizando bacterias inoculadas en caldo de enriquecimiento, para luego establecer la cantidad de bacterias mínima detectable por la prueba, obteniéndose un mínimo de 101 UFC/ml. No se obtuvo bandas de amplificación con cepas de E. coli y Proteus spp. El caldo Rapapport Vassiliadis no evidenció la presencia de inhibidores ni tampoco los tejidos intestinales, ni órganos internos. Posteriormente se utilizó la prueba implementada para detectar S.E en 53 muestras de tejidos y contenido intestinal de pollos experimentalmente infectados, positivas al cultivo bacteriológico y en 126 muestras negativas. En el primer caso, todas las muestras presentaron amplificación del gen invA, mientras que en el segundo, de las 126 muestras negativas, sólo 6 fueron positivas a PCR (4,8%), correspondiendo 3 de ellas a un pool de órganos y 3 a intestino y contenido intestinal. Basado en estos resultados, se puede concluir que se logró implementar la prueba de PCR convencional para la detección de S.E en tejidos y contenido intestinal de pollos en forma exitosa, con una alta capacidad de detección bacteriana y con un tiempo de ejecución de un máximo de 3 días (de los cuales 2 corresponden a incubación en caldo de enriquecimiento), la cual debiese ser utilizada como complemento a la prueba tradicional actualmente utilizada

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El circovirus porcino tipo 2 (PCV2, del Inglés Porcine Circovirus Type 2) pertenece a la familia circoviridae, la cual está constituida por virus pequeños y sin envoltura, con un genoma de ADN circular de hebra simple. El genoma de PCV2 codifica en forma divergente para dos marcos de lectura abiertos (ORFs, del Inglés Open Reading Frames) involucrados en la formación de la cápside (cap) y el complejo de replicación viral. Este virus es considerado el agente etiológico principal de una enfermedad emergente en nuestro país, denominada Síndrome del Desmedro Multisistémico Postdestete (PMWS, del Inglés Postweaning Multisystemic Wasting Sindrome) en cerdos, el cual se caracteriza por generar una inmunosupresión severa, con pérdida progresiva de peso y deterioro general de la condición corpórea, lo que acompañado por una serie de infecciones concomitantes, llevan a la muerte prematura del animal, con las consecuentes pérdidas económicas en los países productores. Si bien es un síndrome ampliamente distribuido en el mundo y muy común en todos los planteles productores de cerdos, la presencia de PCV2 en Chile no ha sido del todo demostrada. El objetivo de esta memoria de título fue detectar la presencia de circovirus porcino tipo 2 en Chile y caracterizar su genotipo. La detección del virus se realizó por medio de PCR desde muestras de linfonodos inguinales superficiales de cerdos con signología PMWS, pertenecientes a 3 planteles porcinos de la zona central de Chile, analizándose al menos 5 casos por plantel. El gen orf2 del virus fue detectado en el 100 % de las muestras analizadas, tanto por PCR simple como por PCR semi-cuantitativo. Por otra parte, con el fin de realizar una caracterización genotípica del virus, el gen orf2 fue sometido a un análisis de la longitud de los polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction fragment length polymorphism), no encontrándose diversidad genética, intrae inter-planteles, entre las muestras analizadas, las cuales presentaron un patrón RFLP igual a un clon europeo usado como control. 5 Posteriormente se realizó la secuenciación nucleotídica en ambos sentidos, tras el clonamiento, de cuatro secuencias aisladas de los diferentes predios. Las secuencias presentaron un 94% de identidad nucleotídica entre si y su análisis filogenético las agrupó en un clado específico, junto con aislados suecos y algunos aislados chinos. Además, este análisis junto a revisión bibliográfica reciente, permitió diferenciar las secuencias en dos subgrupos o subgenotipos del virus, 1 y 2. De esta manera fue posible concluir que el circovirus porcino tipo 2 esta presente en nuestro país y que las cepas analizadas corresponden al subgrupo 1, presentando una estrecha relación con genotipos de origen Europeo / Bicentenario Banco Mundial-Conicyt PSD2; Iniciación en Investigación de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile VID I07/15-2 y el Fondo de Investigación Veterinaria FIV 2007 de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Fundamentos: Parvovirus B19 (PV-B19) pertenece a la familia Parvoviridae, género Eritrovirus. Es un virus ADN de hebra simple que presenta secuencias palindrómicas en sus extremos. Es muy prevalente en la población general, llegando a detectarse anticuerpos anti PV-B19 en más del 85% de la población geriátrica. Este virus es el agente causal de una amplia gama de manifestaciones clínicas, cuya severidad depende del estado inmunológico y hematológico del hospedero, e incluye el eritema infeccioso, problemas hematológicos y reumatológicos e hidrops fetal, entre otras. Objetivo: Se determinó la presencia de Parvovirus B19 en pacientes con manifestaciones clínicas asociadas a este virus. Materiales y Métodos: Se analizaron 262 muestras de sangre de pacientes provenientes de distintos centros hospitalarios de la Región Metropolitana y del Servicio de Diagnóstico del Programa de Virología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. De estas muestras, 211 fueron analizadas mediante la técnica de ELISA para la pesquisa de IgM anti PV-B19, 244 con PCR anidado (PCR-Nested), para detectar genoma viral y 185 muestras con ambas técnicas. Resultados: De las muestras analizadas mediante la técnica de PCR anidado, se detectó genoma viral en un 25% de éstas y de las muestras analizadas mediante la técnica de ELISA, se localizó IgM anti PV-B19 en un 19%. Considerando sólo las 185 muestras que fueron analizadas con ambas técnicas, se detectó un 31.9% de positividad. En los casos positivos para el virus, las manifestaciones clínicas prevalentes fueron síndrome febril y eritema infeccioso

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se compararon los partidores kinetoplastídicos (121-122) y nucleares (Tc1-Tc2), en la detección de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en el binomio madre-recién nacido (RN). Se analizó una muestra de 40 madres chagásicas crónicas y sus RN, procedentes de Provincia de Choapa, Región de Coquimbo, de quienes se extrajo sangre periférica en pre-parto y de cordón umbilical al momento del parto, respectivamente. Las madres se seleccionaron según resultados serológicos para enfermedad de Chagas realizados en el primer trimestre del embarazo mediante Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y ELISA IgG. Se conformaron grupos de estudio en base a los resultados de PCR kinetoplastídico (PCRk) aplicado a las madres previo al parto y se aplicó PCR con partidores nucleares (PCRn) a la totalidad de madres y RN, con el fin de determinar la utilidad de estos últimos en la pesquisa de T. cruzi. Los resultados fueron analizados mediante la prueba de Mc Nemar de muestras asociadas a través del programa SRSS. Se observó que en el 82,5% de las muestras correspondientes a madres con parasitemia positiva o negativa al pre-parto con PCRk, PCRn fue positivo. Considerando sólo las madres negativas a PCRk, PCRn detectó positividad en el 65% de los casos. En los 40 RN en estudio, PCRk fue positivo en el 7,5% de los casos, mientras que PCRn lo fue en el 50%. Dos casos congénitos, confirmados mediante serología convencional antes del año de vida, fueron positivos para ambos partidores (Indice de sensibilidad PCRk y PCRn 100%; índice de especificidad PCRk 100% y PCRn 50%). Estos resultados nos permiten concluir que los partidores nucleares Tc1-Tc2, detectan en el 42,5% de la sangre de cordón de RN, hijos de madres chagásicas, una banda de 166 pb que podría corresponder a trazas de ADN de T. cruzi, evidencia que debe ser confirmada por técnicas de secuenciación y/o PCR Tiempo Real. Se concluye además, que la parasitemia materna, no sería un factor relevante en la transmisión congénita de T. cruzi, puesto que de 20 madres con parasitemia evidente antes del parto, sólo en dos casos se confirmó la transmisión. En ausencia de diagnóstico parasitológico directo en el RN, la técnica de PCR es una alternativa para el diagnóstico de Chagas congénito, no obstante, este estudio confirma que el estudio serológico posterior a los 8 meses de vida en los hijos de madres chagásicas, es la estrategia más recomendable y factible de llevar a cabo en los centros asistenciales de la zona endémica de nuestro país / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1080445, 1100768 y proyecto 06/2009 Regón Valona de Bruselas-Bélgica

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El agente biológico Corynebacterium pseudotuberculosis es un patógeno animal cosmopolita que genera infecciones supurativas crónicas en diversas especies, siendo la linfoadenitis caseosa (LAC) en pequeños rumiantes el cuadro de mayor importancia, pero también se encuentra causando lesiones absedativas en otras especies, como los equinos. En Chile este patógeno se encuentra presente, sin embargo ninguna de las enfermedades que produce son de notificación obligatoria, ya que son cuadros de tipo debilitante, que no provocan mortalidad y las pérdidas económicas asociadas son difíciles de evaluar. Esto se relaciona con un desconocimiento de las características que presenta este agente, lo que trae consigo la falta de un diagnóstico adecuado y medidas de control para las enfermedades que este produce. En esta memoria se estudiaron las características fenotípicas, mediante pruebas microbiológicas y bioquímicas, y genotípicas, utilizando la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) y la secuenciación de un fragmento del gen rpoB ; de un total de 20 aislados nacionales de C. pseudotuberculosis obtenidas a partir de lesiones absedativas de caprinos y equinos. Se evidenció la existencia de diferencias entre los aislados equinos y caprinos en sus características fenotípicas, en la prueba de reducción de nitratos, todas las cepas caprinas fueron negativas y todas las cepas equinas positivas. También se observaron diferencias genotípicas en la secuencia del gen rpoB entre los aislados caprinos y equinos. La técnica de PCR simple como diagnóstico rápido, a partir de muestras clínicas; bajo las condiciones de este estudio, fue capaz de detectar solo el 15% de las cepas obtenidas por aislamiento bacteriológico. Sin embargo, la técnica de PCR múltiple a partir de cultivos puros, fue capaz de detectar a todas las cepas identificadas por aislamiento bacteriológico y pruebas bioquímicas, y en un menor tiempo que estas pruebas. Por lo tanto esta técnica implementada en el presente estudio se muestra como una eficiente alternativa para el diagnóstico de las enfermedades causadas por C. pseudotuberculosis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las infecciones nosocomiales de origen bacteriano constituyen una preocupación constante y creciente tanto en el ámbito de la salud pública como en el de la salud animal, debido a que condicionan altas tasas de morbilidad y mortalidad. Entre los factores que explican esta condición, está el aumento de la resistencia bacteriana a los antibióticos, siendo cada vez más frecuente el fenómeno de multiresistencia en las cepas involucradas. Entre los antimicrobianos que han visto reducida su efectividad se encuentra el grupo de las tetraciclinas, fármacos de amplio espectro utilizados con diferentes fines terapéuticos. Las bacterias resistentes a estos antimicrobianos presentan genes denominados tet, describiéndose en la actualidad 43 de ellos que codifican, principalmente, proteínas de eflujo activo y proteínas de protección ribosomal. El objetivo de este trabajo fue la detección de cuatro genes de resistencia a tetraciclinas- tet(A) y tet(B), involucrados en la codificación de proteínas de eflujo y tet(M) y tet(O), involucrados en la codificación de proteínas de protección ribosomal- mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en cepas bacterianas Gram negativas ambientales descritas como nosocomiales, previamente aisladas y caracterizadas en los años 2007 y 2008. La aplicación de esta técnica de biología molecular permitió detectar en cepas fenotípicamente resistentes mediante antibiograma por difusión en agar, al menos uno de los cuatro genes de resistencia a tetraciclinas. En un alto porcentaje de cepas con sensibilidad intermedia también se detectó al menos un gen de resistencia y en algunas cepas sensibles a tetraciclinas se obtuvo este mismo resultado. Los resultados de este trabajo señalan que la detección de genes tet complementaría la técnica del antibiograma de la Microbiología clásica en el estudio de la resistencia bacteriana a tetraciclinas

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Mycobacterium bovis es el microorganismo zoonótico causante de la tuberculosis bovina, patología infectocontagiosa de distribución mundial responsable de graves problemas económicos y de salud en el sector ganadero. Debido a que varios estudios han establecido la utilidad de las secuencias de inserción IS6110 e IS1081 en la identificación y tipificación de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis, el objetivo de este estudio fue establecer protocolos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la amplificación de las secuencias IS6110 e IS1081 y determinar la existencia de diferencias en su capacidad de detectar Mycobacterium bovis en tejidos bovinos. El análisis estadístico de los resultados sugirió que no existen diferencias significativas entre los ensayos de PCR convencional basados en IS1081 e IS6110, lo que contrasta con lo señalado por otros autores, quienes postulan que IS1081 está presente en mayor número de copias en cepas de Mycobacterium bovis, y por tanto, su utilidad en el diagnóstico es mayor. Debido a que la concordancia de ambas pruebas fue baja, se requieren nuevos estudios destinados a determinar la aplicabilidad de ambas secuencias en conjunto, por ejemplo en una prueba de PCR múltiple, ya que este trabajo sugiere que son complementarias para el diagnóstico de tuberculosis bovina / Proyecto FIV 121014019102003