Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino (DC) es una de las patologías que provoca mayor tasa de morbilidad y mortalidad en los caninos domésticos a nivel mundial y representa también una importante enfermedad en varias familias de mamíferos terrestres: Canidae, Procyonidae, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ursidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae y algunos mamíferos marinos, como la foca cáspica (pusa caspica). Esta enfermedad es causada por el Virus Distemper Canino (VDC), un virus ARN de hebra simple y polaridad negativa, cuyo genoma constituido por seis genes, codifica para seis proteínas estructurales. Entre ellas, la Hemaglutinina codificada por el gen H, presenta la mayor variabilidad aminoacídica, induce la producción de anticuerpos neutralizantes sintetizados por el sistema inmune del hospedero. Basado en la variabilidad del gen H, se ha descrito que a nivel mundial existirían al menos catorce linajes distintos del VDC y en nuestro país se ha descrito la presencia de al menos dos linajes circulando entre nuestros perros enfermos con la patología: América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. Así, el objetivo de esta memoria de título fue implementar la detección del linaje América-1 del Virus Distemper Canino mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a transcripción reversa (RT-PCR) mediante partidores diseñados in silico. Para esto, los partidores se diseñaron a partir de las secuencias nucleotídicas usadas en el árbol filogenético del gen H de VDC realizado por (Ke et al., 2015, las que se encuentran en la base de datos Genbank®, Los partidores diseñados resultaron ser eficaces para la detección del VDC y la RT-PCR fue capaz de detectar un fragmento específico del gen H de las muestras positivas, por lo tanto se podría sugerir que estos partidores diseñados in silico efectivamente se pueden ocupar para detectar el linaje América-1 del VDC. / The Canine Distemper is one of the pathologies that causes the highest rate of morbidity and mortality in domestic dogs worldwide and represents an important disease in several families of terrestrial mammals: Canidae, Procyonidae, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ursidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae and some marine mammals, like the cape seal (pusa caspica). This disease is caused by Canine Distemper Virus (CDV), a single-stranded RNA virus with negative polarity, whose genome consists of six genes codifying for six structural proteins. Among them, the Hemagglutinin encoded by the H gene, has the highest amino acid variability, inducing the production of neutralizing antibodies synthesized by the host's immune system. Based on the variability of the H gene, it has been described that worldwide there would be at least fourteen different VDC lineages and in our country the presence of at least two lineages circulating among our sick dogs has been described with the pathology: America-1 and Europe-1/South America-1. The objective of this title report was to implement the detection of the America-1 lineage of the Canine Distemper Virus through the Polymerase Chain Reaction associated with reverse transcription (RT-PCR) by means of in silico designed primers. For this, the primers were designed using the nucleotide sequences used in the phylogenetic tree constructed using the VDC H gene performed by Ke et al., 2015, and stored in the Genbank® database. The designed primers were found to be effective for the detection of VDC and the RT-PCR was able to detect a specific fragment of the H gene from the positive samples, therefore it could be suggested that these in silico designed primers can effectively be used to detect the VDC lineage America-1.

Evalúa la capacidad de detección de Salmonella Typhimurium y Enteritidis mediante el método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo (utilizando secuencias blanco de los genes InvA, fliC y prot6E) y hallar la concordancia entre ésta y el método de detección microbiológico convencional que consta de preenriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, aislamiento en agar diferencial y pruebas bioquímicas. Se analizan simultáneamente mediante ambos métodos un total de 111 muestras de hígado de cobayos con diagnóstico presuntivo de Salmonelosis provenientes de Chancay (Lima) y El Mantaro (Junín), llegando a detectar Salmonella Typhimurium por PCR Múltiple en 54% (60/111) de muestras y por análisis microbiológico en 41% (45/111) de ellas. Las pruebas muestran una concordancia substancial con un valor de Kappa de 0.64 y la prueba de McNemar demuestra que los resultados de ambas pruebas son estadísticamente diferentes (p>0.05), por lo tanto se concluye que la PCR Múltiple a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo sirve como una prueba tamiz que detecta Salmonella Typhimurium en volúmenes grandes de muestras de hígado de cobayos, siendo esta menos laboriosa y más rápida que la detección microbiológica convencional, sin embargo se recomienda utilizar ambas técnicas en combinación para mejorar los resultados. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se desarrolló y validó un ensayo inmunoabsorbente ligado a un enzima (ELISA), usando antígeno lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de la cepa RB51 de Brucella abortus para el diagnóstico de infección con B. ovis en ovinos. Se probaron 2 tipos de placas de poliestireno NUNC 69620 y Maxisorp, 2 tipos de tampones de distinto pH con 2 diferentes conjugados: policlonal anti IgG-ovina (Sigma A3415) y monoclonal anti IgG-caprino/ovino (Sigma A9452), las diluciones del antígeno y del conjugado del trabajo se obtuvieron mediante una titulación en tablero de ajedrez. El ensayo se validó utilizando la placa NUNC 69620 con una sensibilización del antígeno 1:50 en el tampón carbonato-bicarbonato y el uso del conjugado monoclonal, en 55 sueros de ovinos positivos a examen clínico y a la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y 338 sueros de ovinos provenientes de un rebaño libre de la enfermedad, confirmados por medio de fijación del complemento (FC). Para comparar las placas, las densidades ópticas (DO) fueron llevadas a porcentajes de positividad (PP), el punto de corte fue un 39,5% utilizando la metodología “Receiver-Operator Characteristic” (ROC), estimando la sensibilidad y la especificidad en un 92.7% y un 98,5% respectivamente. Estos resultados permiten establecer que el ELISA desarrollado sea una alternativa real, para el diagnóstico serólogico de B. ovis en el país

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / Mycoplasma gallisepticum (MG) y Mycoplasma synoviae (MS) son patógenos que afectan el sistema respiratorio de las aves de producción y pueden ser transmitidos verticalmente a la progenie. Ambos forman parte de la lista de enfermedades de denuncia obligatoria a la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). La medida más efectiva para controlar la enfermedad, ha sido por muchos años la erradicación mediante la mantención de abuelas y reproductoras libres de la infección, generando una progenie libre de MG y MS. En Chile, el diagnóstico de la micoplasmosis en planteles avícolas es realizado mediante técnicas serológicas capaces de detectar anticuerpos contra MG y MS, utilizando las técnicas de enzimoinmunoensayo (ELISA) e inhibición de la hemoaglutinación (IHA). Además se utiliza la técnica de cultivo y aislamiento bacteriano. Estas pruebas son utilizadas en el Programa de Control de Mycoplasma sp. dirigido a los distintos estratos de aves, pertenecientes a empresas avícolas productoras de carne de pollo, carne de pavo y de huevos de mesa. Al ser MG y MS patógenos de denuncia obligatoria, se vuelve de suma importancia implementar nuevas técnicas de laboratorio capaces de brindar resultados fidedignos y en tiempos acotados. Con el propósito de que, de existir un brote de la enfermedad, se pueda poner en marcha rápidamente las medidas de control propuestas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG). La técnica de la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR), desarrollada más recientemente, ha sido introducida en los laboratorios de diagnóstico de Chile y de otros países como una herramienta útil para analizar el estado sanitario de las aves de corral, principalmente, para confirmar los resultados positivos expresados por las pruebas de ELISA e IHA. La PCR es capaz de identificar el DNA específico de MG y MS, de forma rápida y certera. En el siguiente estudio, se buscó implementar un protocolo de PCR en cepas de referencia de MG y MS en un laboratorio de diagnóstico autorizado por el SAG y participante del programa oficial de control de Mycoplasma sp. y posteriormente, puesto a prueba en muestras de campo. Las muestras recolectadas para poner a prueba el protocolo de PCR, fueron tomadas en una población de gallinas de postura comerciales, clínica y productivamente sanas, pertenecientes a un plantel de aves serológicamente positivas a MG y MS mediante la prueba de ELISA. Para cumplir con el propósito del estudio, se realizó un paso de extracción y purificación del DNA genómico. A continuación se realizó la PCR con partidores diseñados para amplificar un fragmento de la secuencia del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S de ambos patógenos. Posteriormente, se realizó la electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa al 2%, a 80 Voltios durante 40 minutos. Finalmente, se visualizaron las bandas de amplificación en un transiluminador UV, dejando registro fotográfico de las imágenes. El protocolo de PCR puesto en marcha demostró la capacidad de amplificar el DNA de las cepas de referencia, así como el DNA de MG y de MS presente en las muestras de campo. / Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) are two important pathogens that cause infections of the respiratory system of poultry. Also, they can be transmitted vertically to the progeny. Both are part of the reportable list of diseases to the World Organization for Animal Health (OIE). For many years, the main and most effective measure to control the disease has been the eradication of infection by maintaining batches of Grandparent lines and Parent Stock free of infection and thus generating a progeny free of MG and MS. The diagnosis of avian mycoplasmosis in poultry in Chile, is performed by serological methods capable of detecting antibodies against MG and MS, using the techniques of Immuno-Assays (ELISA) and hemagglutination inhibition (HI). Also, by employing cell culture and bacterial isolation. These tests are used as a part of the Mycoplasma sp. Control Program and are aimed at different types of birds of the Chilean Poultry Industry such as meat chicken, meat turkey and table eggs. Since MG and MS are pathogens notifiable to the OIE, it is very important to implement new laboratory techniques that are capable of providing reliable and fast results. In order to, in the case of an outbreak of the disease, begin as soon as possible with the control measures proposed by the Agriculture and Livestock Service. Developed more recently, the assay of Polymerase Chain Reaction (PCR) has been introduced in diagnostic laboratories of Chile and other countries as a useful tool for analyzing the health status of batches of poultry, and mainly, to confirm positive results expressed by the ELISA and HI. PCR test, is able to identify the specific DNA sequences of MG and MS, rapidly and accurately. In this study, we first implemented a PCR protocol with reference strains of MG and MS in a diagnostic laboratory authorized by the SAG and participant of the official program control Mycoplasma sp. and then we tested it with field samples. Tracheal swabs samples were collected, processed and tested with PCR protocol implemented. The samples were taken from a commercial population of laying hens, clinically and productively healthy, from a farm that was serologically positive to MG and MS by ELISA. To fulfill the purpose of this study, a preliminary step to extract and purify the genomic DNA was made. Then PCR was performed with primers designed to a fragment of the gene sequence coding for 16S ribosomal RNA of both pathogens. Subsequently, we performed 2% agarose gel electrophoresis, where the PCR products were subjected to a potential difference of 80 volts, for 40 minutes. We finally visualized the amplification bands on a UV lamp and kept photographic records. The protocol implemented demonstrated the ability to amplify DNA from both reference strains, as well as the DNA present in field samples for PCR of MG and MS.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las bacterias nosocomiales han tenido gran repercusión en la práctica médica al producir una alta morbilidad y mortalidad en pacientes inmunocomprometidos, debido principalmente a su capacidad fenotípica de multiresistencia a antimicrobianos. La información que permite a una bacteria desarrollar un mecanismo de resistencia se encuentra en su material genético, existiendo la posibilidad de traspasarlo en forma horizontal a otras bacterias. Adicionalmente, causan un gran costo para el paciente y los centros de atención al generar complicaciones y una mayor estancia hospitalaria. Así, es necesario realizar un seguimiento dinámico de las especies nosocomiales, para establecer una retroalimentación constante respecto de su existencia y la de los fenómenos medioambientales involucrados en su presentación, con la finalidad de mejorar los protocolos de control de los patógenos asociados a este tipo de infecciones. Este protocolo debe incluir la búsqueda de los genes responsables de la resistencia a los antimicrobianos en distintas especies y analizar su relación epidemiológica, buscando resguardar la salud pública y animal. El objetivo de este trabajo fue identificar los genes más frecuentemente descritos que otorgan resistencia a los antimicrobianos beta-lactámicos (ampicilina y meticilina), mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en sesenta y siete aislados ambientales obtenidos y caracterizados previamente, entre los años 2007 y 2008- desde unidades clínico Veterinarias de la Universidad de Chile. La implementación de la técnica de PCR permitió la detección de fragmentos de ADN compatibles con los descritos en la detección del gen blaTEM en bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas y en la detección del gen mecA, en bacterias Gram-positivas, encontrando indiscutiblemente un alto porcentaje de bacterias que poseerían estos genes, lo que debe generar una gran preocupación para los encargados de los recintos hospitalarios veterinarios de la Universidad de Chile y como medida preventiva, se deben realizar esfuerzos para controlar esta realidad / Financiamiento: FIV 4602016

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus herpes canino tipo 1 (CaHV1) provoca una enfermedad hemorrágica mortal en cachorros menores de cuatro semanas, mientras que en cachorros mayores de cuatro semanas produce algunos signos clínicos de menor gravedad como rinitis, faringitis o conjuntivitis. En adultos, es capaz de producir afecciones oculares y trastornos en la reproducción, y es un patógeno participante de la denominada “tos de las perreras”. El gen que codifica para gB, una glicoproteína presente en la envoltura viral, se encuentra descrito en una gran variedad de virus herpes, debido a que es esencial para el proceso de ingreso del virus a la célula y así definir la ruta de neuroinvasión. Este trabajo se realizó en los laboratorios de Virología y Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y su propósito fue contribuir a la caracterización molecular del aislado viral RP5, y confirmar la presencia de un virus herpes nativo, mediante la detección del gen de la glicoproteína B usando la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Los resultados obtenidos permiten demostrar una alta sensibilidad de la técnica implementada y una especificidad superior a otro protocolo de PCR implementado en otra memoria de título. Así, un porcentaje de identidad nucleotídica de 97% respecto de la secuencia publicada en GenBank permite calificar este protocolo como un serio aspirante a convertirse en un método diagnóstico para CaHV1 en Chile y por otra parte concluye que el aislado RP5 nativo corresponde a CaHV1. Finalmente, con este estudio confirmatorio el aislado RP5 podrá ser nombrado oficialmente como AFLC-61, la cepa chilena de CaHV1 / Financiamiento: Programa AUCAI, Universidad de Chile

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Brucelosis canina es una enfermedad infectocontagiosa zoonótica causada por la bacteria Brucella canis, afectando principalmente el sistema reproductivo de los perros en ambos sexos. Los signos de esta enfermedad no son evidentes clínicamente e incluso muchos pueden ser asintomáticos. Se caracteriza por producir aborto tardío en hembras y orquitis, epididimitis e infertilidad en machos, pero muchas veces estos signos pueden pasar desapercibidos. En este estudio se determina la sensibilidad analítica de un ensayo PCR tanto para muestras de sangre contaminadas como en cultivos puros para el diagnóstico de brucelosis canina, comparando dos métodos de extracción de DNA. Como resultado se obtuvo que la prueba PCR es capaz de detectar la bacteria en sangre pero obteniendo resultados positivos sólo con uno de los métodos de extracción, detectándose DNA hasta el nivel de los femtogramos / Proyecto FIV 121014019102003

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es una enfermedad parasitaria humana grave en América, causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos hematófagos de la subfamilia Triatominae. La detección de T. cruzi puede llevarse a cabo a través de diferentes metodologías como la observación directa al microscopio, el hemocultivo, el xenodiagnóstico y en la última década mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Pruebas moleculares con la técnica de PCR mostraron un 16,4% de infección por T. cruzi en insectos Mepraia spinolai de la Región de Atacama (Chile), un 16% en la Comuna de Til-Til (Chile) y un 44,5% en la Comuna de Colina en la Región Metropolitana (Chile). Nuestros resultados muestran algunas diferencias en los niveles de infección entre los distintos estadios ninfales, pero estas diferencias no son estadísticamente significativas. Se debe destacar una nota de precaución para indicar el papel potencial de M. spinolai en la transmisión de T. cruzi en las zonas donde el nivel de infección detectado por análisis moleculares es alto / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1085154

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En Chile, el virus herpes canino (CaHV-1) se ha detectado mediante técnicas clásicas de virología como aislamiento en cultivos celulares y posterior citólisis de las células afectadas, mediante inmunofluorescencia, por la presencia de cuerpos de inclusión o mediante estudios de cinética viral, lo cual ha permitido completar el análisis biológico de un aislado nacional denominado RP5. En contraste, en el presente trabajo se realizó la detección molecular del gen UL37 de CaHV-1, gen que codifica para la proteína UL37, presente en el tegumento del virus y que participa del ciclo replicativo viral. Para tal efecto, se utilizaron 6 inóculos virales obtenidos de sobrenadantes de cultivos celulares de la línea MDCK infectados con RP5. Para el PCR se utilizaron los partidores CHV-1: 5’-AAGAGCTCGTGTTAGTGAAAAT 3´ y CHV-2: 5’-TAAACCCGCTGGA TGATAC- 3’ (Erles et al., 2004). La visualización del amplicón se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. La electroforesis se llevó a cabo a 90 volts por 90 minutos. Como marcador de tamaño molecular se utilizó un estándar que contiene fragmentos de ADN entre 100 y 1000 pb. Luego de la electroforesis, el gel se incubó en bromuro de etidio (0,5 μg/ml), posteriormente lavado, colocado en un transiluminador de luz ultravioleta y finalmente fotografiado. Todos los sobrenadantes de cultivos celulares utilizados resultaron positivos al PCR descrito, observándose una banda de alrededor de 500 pb, lo cual concuerda con lo descrito en la literatura al utilizar esta metodología. Para tener una aproximación de la sensibilidad de la técnica empleada, se realizaron diluciones al décimo (10-1-10-8) del inóculo viral RP5 (DICT50 = 1,58 x 106/mL) y se determinó la dilución a la cual el PCR descrito no detectó el gen de la proteína UL37. Así, siete de las ocho diluciones resultaron positivas al PCR, observándose una banda de alrededor de 500 pb. Lo anterior indica que este método permitiría detectar hasta 0,00079 DICT50, lo que comparado con las 100DICT50 que se requieren para lograr la infección en células, sugiere una alta sensibilidad asociada al PCR. El producto amplificado fue purificado, secuenciado y se determinó el porcentaje de identidad nucleotidica respecto a un fragmento del gen de la UL37 de virus herpes canino (GenBank accession number AY582738). Así, se determinó que entre la secuencia del GenBank y la secuencia de consenso del amplificado nacional existe un 94% de identidad nucleotídica. Adicionalmente, se comparó la secuencia obtenida con las de otras seis secuencias del gen UL37 presentes en cepas de herpes virus existentes en el Genbank y no se estableció un porcentaje de identidad mayor al obtenido respecto de las secuencias comparadas, lo cual sugiere que la secuencia obtenida en esta memoria de título pertenece al CaHV1. Así, podemos concluir que esta metodología permite la detección de un amplicón de ADN con características compatibles con las descritas para el gen de la proteína UL37 del CaHV-1 mediante una herramienta molecular que cumple con las características del diagnóstico actual: rápido, sensible, específico y de bajo costo. Lo anterior, sin duda, permitirá contribuir para resolver un problema existente en los planteles reproductores caninos, al tener la posibilidad de ofrecer la detección del CaHV1 en pequeños animales como mascotas de compañía, un área de sostenido crecimiento

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se investigó la presencia de clones del parásito Trypanosoma cruzi, en tres zonas consideradas endémicas para la enfermedad de Chagas en Chile. Estas áreas investigadas presentaban un determinado patrón de distribución para los vectores del parásito; Triatoma infestans en Calera de Tango (Región Metropolitana), Mepraia spinolai en Reserva Nacional Las Chinchillas (Región de Coquimbo) y la existencia de ambos vectores en Putaendo (Región de Valparaíso). Sé capturó un total de 113 micromamíferos de las 3 áreas, incluyendo ejemplares de Abrocoma bennetti, Abrothrix longipilis, Abrothrix olivaceus, Octodon degus, Phyllotis darwini, Thylamis elegans, Rattus norvegicus, Rattus rattus, Oligoryzomys longicaudatus. Para detectar a los individuos parasitados se realizó la técnica de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) de muestra de sangre obtenida mediante punción cardíaca, posteriormente las muestras que resultaron positivas a la PCR, se tipificaron mediante la prueba Southern blot hibridando con sondas específicas para determinar cuál clon de T. cruzi presentaban los micromamíferos parasitados. Se detectó la presencia de T. cruzi en 28 (24,7%) de las 113 muestras totales, en donde 26 individuos (93%) presentaron una infestación única por el clon DTU 1 (TcI) de T. cruzi, y 2 individuos (7%) presentaron una infestación mixta por los clones DTU 1 (TcI) y DTU 2 (TcIIe)