Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Identifica genotípicamente los FV: Fimbria tipo 1, Fimbria P y α- Hemolisina en E. coli aisladas de urocultivos del Hospital Nacional San Bartolomé. Así mismo, determina la frecuencia de los genes fimH, papE/F y hlyA mediante la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y describir la susceptibilidad antibiótica acompañante. Estudia un total de 269 aislados de E. coli en urocultivo durante el periodo de febrero y abril del 2015. A todos los aislados se les realizó la detección genotípica de los genes fimH, papE/F y hlyA a través de la técnica de PCR multiplex. Encuenta que de 269 aislados estudiados existe una frecuencia de 90% para el gen fimH, 33,5% para el gen papE/F y 18,2% para el hlyA. También se encuentra una relación entre FV y la susceptibilidad a algunos de los antibióticos evaluados; asi como diferencias significativas entre la susceptibilidad antibiótica de aislados ExPEC BLEE y no BLEE. Concluye en que existe una alta frecuencia del gen fimH, así como presencia de los genes papE/F y hlyA en los aislados de E. coli evidenciando el rol importante que cumple esta adhesina en las ITU. Existe relación entre FV y la susceptibilidad a algunos antibióticos evaluados. / Tesis

Les proteïnes bacterianes associades al nucleoide (NAPs) juguen un paper clau en l’organització, la replicació, la segregació, la reparació i l’expressió del cromosoma. L’estudi de nous membres de les famílies de NAPs, així com de proteïnes paràlogues a les ja conegudes, és important per entendre millor el seu paper biològic. Aquest projecte d’investigació té com a objectiu avançar en l’estudi de paràlegs a Escherichia coli de la proteïna Hha. Les proteïnes objecte d’estudi han estat YdgT, la subunitat θ de l’ADN polimerasa III (també anomenada en aquest treball HolE) i la proteïna YmgB. Pel que fa referència a YdgT, proteïna considerada fins al moment paràloga d’Hha, s’ha dut a terme una anàlisi transcriptòmica de mutants hha i ydgT per tal de comparar els corresponents patrons d’expressió gènica. Els mutants senzills hha i ydgT mostren un patró d’expressió gènica més diferent del que s’esperaria. De fet, el patró del mutant hha conté molts gens induïts mentre que en el mutant ydgT la majoria estan reprimits. Per tant, en general Hha té una funció repressora mentre que YdgT actuaria principalment com un activador. Dins del capítol dedicat a l’anàlisi de mutants hha i ydgT i durant l’estudi del fenotip del doble mutant hha ydgT, es van obtenir uns resultats prou rellevants com per ser considerats un nou apartat dins del present treball. Es tracta de la detecció i anàlisi de l’origen de clons no hemolítics que apareixen en mutants hha ydgT portadors del plasmidi hemolític pANN202-312R en plaques d’agar sang que contenen l’antibiòtic kanamicina. La presència de kanamicina (marcador de la mutació hha) és la causant de l’aparició de colònies sense halo d’hemòlisi. En el present estudi s’han identificat les regions per on es produeix l’escissió i s’ha observat que pertanyen a seqüències d'inserció IS91 parcials. Aquest procés s’ha estudiat també en una soca salvatge amb un plasmidi parental de baix número de còpies (pHly152) en presència de concentracions subinhibitòries de kanamicina i d’ampicil•lina. Pel que fa a la subunitat θ del nucli de l’ADN polimerasa III, s’ha detectat una similitud estructural amb la proteïna associada al nucleoide Hha. En aquest cas, també s’ha realitzat l’anàlisi transcriptòmica del mutant en aquesta subunitat (holE). Això ha permès comprovar que el conjunt de gens alterats en un mutant holE és molt més similar al del mutant ydgT que al del mutant hha. Una part significativa dels gens comuns alterats en els mutants holE i ydgT pertanyen a operons de motilitat, seqüències intergèniques i ARN petits. Aquests resultats i la recent publicació dels estudis que relacionen la sobreexpressió d’ydgT amb la complementació del fenotip de recuperació de la polaritat transcripcional en mutants rho, han permès atribuir també a la subunitat θ de l’ADN polimerasa III un paper en processos de terminació prematura de la transcripció. En el cas de la proteïna YmgB, els estudis duts a terme en aquest treball estableixen noves relacions entre aquesta proteïna i les proteïnes associades al nucleoide H-NS/Hha. Els resultats més interessants que aporta aquest treball s’han obtingut sobreexpressant ymgB. L’anàlisi de l’efecte de la sobreexpressió d’ymgB sobre el patró d’expressió de proteïnes ha permès evidenciar la regulació d’enzims relacionats amb la resistència a l’àcid (lisina descarboxilasa i glutamat descarboxilasa) i de la proteïna ribosomal L2, la qual sembla jugar un paper en la traducció. A més, la sobreexpressió d’ymgB té efectes sobre l’expressió de les proteïnes associades al nucleoide H-NS i Hha, així com sobre l’expressió de gens regulats per aquestes (bgl, proU i hly). / The bacterial nucleoid-associated proteins (NAPs) play a key role in the organization, replication, segregation, repair and expression of the chromosome. The study of new members of NAP families, as well as paralogue proteins of the ones which are already known, is important in order to understand their biological roles better. This research project aims to advance the study of paralogues of protein Hha in Escherichia coli. The proteins which were studied were YdgT, the θ subunit of DNA polymerase III and the protein YmgB. With regard to YdgT, a protein considered until now a paralogue of Hha, we carried out a transcriptomic analysis of hha and ydgT mutants and we compared the corresponding patterns of gene expression. We found out that in general Hha has a repressor function, while YdgT acts mainly as an activator. In the chapter which is dedicated to the analysis of hha and ydgT mutants and during the study of the phenotype of the double mutant hha ydgT, we obtained results relevant enough to be considered as a new section in the present work. This is the detection and analysis of the origin of non-hemolytic clones appearing in hha ydgT mutants carrying the hemolytic plasmid pANN202 312R in blood agar plates containing the antibiotic Kanamycin. Looking at the θ subunit of DNA polymerase III, initially we could detect a structural similarity to the Hha protein. In this case, we also performed a transcriptomic analysis of the mutant in this subunit (holE). This has revealed that the set of genes altered in a holE mutant is much more similar to the set of the ydgT mutant than the one of the hha mutant. A significant proportion of common genes altered in the holE and ydgT mutants belongs to motility operons, intergenic sequences and small RNA. These results and the recent publication of studies that link overexpression of ydgT to the complementation of the phenotype of recovery of transcriptional polarity in rho mutants, have allowed us to attribute to HolE a role in the process of premature transcription termination. Finally and regarding the protein YmgB, research conducted in this study establishes new relationships between this protein and nucleoid-associated proteins H-NS/Hha. The most interesting results provided by this study were obtained by overexpressing ymgB.

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) és un colonitzador habitual del tracte respiratori superior dels humans. Es tracta d’un patogen comú de l’espècie humana que presenta una elevada taxa de morbiditat i mortalitat arreu del món. El bacteri pot causar otitis mitjana, sinusitis o infeccions de tracte respiratori superior, (per contigüitat) però també pot causar malaltia invasiva, quan habita en un territori habitualment estèril, produint pneumònia, bacterièmia, septicèmies i meningitis, entre d’altres. La malaltia pneumocòccica és un important problema de salut pública i és la principal causa individual de mortalitat infantil en el món. Segons dades de la Organització Mundial de la Salut (OMS), s’estima que a l’any 2000 es van produir 14.5 milions d’episodis greus de malaltia pneumocòccica, que va resultar en 826 000 morts en nens menors de dos anys. Un 61% d’aquestes morts es van produir a l’Àfrica subsahariana i al sud-est asiàtic. Tanmateix, en aquests països i, en especial a les zones rurals, les capacitats de diagnòstic són limitades o inexistents i la identificació de l’agent etiològic es basa en signes i símptomes clínics. És molt important aïllar l’agent etiològic causant de malaltia per tal de poder avaluar el millor tractament possible. No obstant, les tècniques actuals per al diagnòstic de la malaltia presenten una limitada sensibilitat i especificitat. El cultiu microbiològic, com a mètode de diagnòstic clàssic, té una baixa sensibilitat per a detectar el pneumococ. L’objectiu d’aquesta tesi és avaluar el potencial de les tècniques moleculars per al diagnòstic i caracterització de la malaltia pneumocòccica i discernir si l’ús de tècniques moleculars com la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) poden suposar un avantatge tant per la rapidesa del mètode com per la detecció del patogen present en una mostra a baixa concentració. L’aplicació d’aquest tipus de tècniques en mostres biològiques impregnades en paper de filtre (dried-spot) i conservades a temperatura ambient poden ser un excel•lent sistema per a la detecció i serotipat de S. pneumoniae en països en vies de desenvolupament on la falta de recursos econòmics esdevé una de les principals limitacions. La capacitat del pneumococ de causar malaltia depèn de la presència d’una càpsula polisacàrida que impedeix la fagocitosi. Tot i que la presència de la càpsula és un requisit perquè produeixi malaltia, no és suficient per conferir virulència, sinó que són necessaris una varietat de factors determinants addicionals, com ara les adhesines, les proteases, les toxines, els sistemes de transport i enzims que modifiquen el medi extracel•lular. Recentment, s’ha descobert un determinant de virulència del pneumococ que és la proteïna rica en repeticions de serina, PsrP (Pneumococcal-serine rich protein). Es tracta d’una adhesina que intervé en l’adhesió del pneumococ a les cèl•lules pulmonars. PsrP és un important factor de virulència capaç de causar malaltia i un potencial candidat a una nova vacuna proteica. / Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) is a common colonizer of the upper respiratory tract of humans. This is a major human pathogen and leading cause of morbidity and mortality worldwide. The bacteria can cause otitis media, sinusitis or upper respiratory tract infections (contiguity) but can also cause invasive disease, when living in an area usually sterile, causing pneumonia, bacteraemia, sepsis and meningitis, among others. According to the World Health Organization, in 2000, pneumococcal disease was estimated to have caused about 14.5 million severe episodes. There were approximately 826 000 deaths from pneumococcal disease in children under five years and 61% of these deaths occurred in sub-Saharan Africa and Southeast Asia. However, in these countries, especially in rural areas, diagnostic capabilities are limited or nonexistent and agent identification is based on clinical signs and symptoms. It is very important to isolate the etiologic agent of disease in order to assess the best treatment possible. However, present techniques for the diagnosis of the disease have a limited sensitivity and specificity. Microbiological culture, considered the “gold-standard” in microbiological diagnosis has low sensitivity to detect pneumococcus. The aim of this Thesis is to evaluate the potential of molecular techniques for diagnosis and characterization of pneumococcal disease and to discern whether the use of molecular techniques such as PCR, can be an advantage both for the speed of method as for the detection of the pathogen present in a sample in low concentration. The application of these techniques in biological samples impregnated filter paper (dried-spot) and kept at room temperature can be an excellent system for the detection and serotyping of S. pneumoniae in developing countries where lack of financial resources is a major constraint. The ability of the pneumococcus to cause disease depends on the presence of a polysaccharide capsule that prevents phagocytosis. Although the presence of the capsule is a requirement to produce disease, is not sufficient to confer virulence, but need a large number of additional factors such as adhesins, proteases, toxins, transportation systems and enzymes that modify the extracellular medium. One recently identified pneumococcal virulence determinant is the pneumococcal serine-rich repeat protein (PsrP). This is an adhesin involved in adherence of pneumococci to lung cells. PsrP is an important virulence factor capable of causing disease and a potential new vaccine candidate protein.

La sangre obtenida en el matadero es un producto altamente contaminado que requiere un procesamiento inmediato si se pretende utilizarla como insumo alimentario en la fabricación de productos destinados al consumo humano. Si bien es cierto que los sistemas de higienización podrían ser muy eficientes desde el punto de vista de calidad microbiológica, su instalación en la línea de sacrificio comportaría muchas dificultades desde el punto de vista técnico y en algún caso sería muy costoso. La bioconservación podría ser una alternativa para mejorar la calidad microbiológica de la sangre, alargar su vida útil y reducir las posibilidades de procesamiento inmediato. El presente estudio nos permitiría formular la posibilidad de aplicar la bioconservación en sangre de cerdo procedente de matadero industrial, utilizando bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo bioprotector, para lo cual se aislaron cepas de BAL autóctonas y se confeccionaron dos colecciones una de BAL mesófilas y otra de psicrótrofas.Se evaluó el potencial antagonista de la colección de BAL mesófilas y psicrótrofas a 30ºC y a 15ºC respectivamente frente a bacterias contaminantes habituales de este subproducto. Las BAL que demostraron antagonismo en placa (7,1% a 30ºC y 11% a 15ºC) fueron seleccionadas para evaluar el potencial antagonista en sangre, donde el efecto inhibitorio se vio favorecido por la adición de un 2% glucosa. S.aureus y P. fluorescens fueron los indicadores más inhibidos por las cepas mesófilas, en algunos casos con reducciones superiores a 7 unidades logarítmicas. En condiciones psicrótrofas la bacteria más sensible a la presencia de BAL fue Bacillus sp., donde 8 de las 11 BAL ensayadas permitieron reducciones superiores a 4 logs y 1cepa incluso superiores a 7 logs; se obtuvieron reducciones máximas de 3 logs de E.coli y Pseudomonas fue inhibida por todas las BAL ensayadas, en algún caso con reducciones superiores a 5 logs.Las 5 que cepas que presentaron el espectro de inhibición más amplio en condiciones mesófilas y 7 en condiciones psicrótrofas frente a los microorganismos indicadores contaminantes de sangre de matadero se identificaron mediante técnicas moleculares por comparación de la secuencias correspondientes al gen que codifica la síntesis de 16S ARNr (16S ADNr) con las secuencias publicadas en las bases de datos. De las 7 cepas antagonistas en condiciones psicrótrofas 5 se identificaron como Lactococcus garvieae y 2 como Enterococcus malodoratus/gilvius raffinosus. Todas las BAL con potencial antagonista en condiciones mesófilas pertenecían al género Lactobacillus, 3 de elllas se identificaron como Lactobacillus murinus/animalis y una se identificó como Lactobacillus reuteri. TA20 que tuvo un gran espectro de inhibición a ambas temperaturas se identificó como Lactococcus garvieae.En este estudio se evaluaron tres métodos de conservación a largo plazo de las cepas que mostraron potencial antagonista. Se comparó la liofilización, la atomización frente a la congelación a -80ºC que era método que se había utilizado hasta el momento para conservar ambas colecciones de BAL. En general, los métodos de deshidratación (atomización y liofilización) y mantenimiento en refrigeración a 5ºC de los cultivos deshidratados se han mostrado más eficaces que la congelación. / Blood from slaughtered animals is a product with a high contamination level that requires an immediately processing after collection if the object is to use it as a food ingredient destined to human consumption. Nevertheless, even if hygienic collection systems used in abattoirs were be efficient enough to control the microbiological quality, their installation in the slaughtered line would be technically complicate and in some case would be so expensive.Bioconservation is an alternative to improve microbiological quality, to extend its shelf life and reducing the possibility of immediate processing after collection.The present study would permit us to formulate the possibility to applicate bioconservation in porcine blood from industrial abattoirs, using lactic acid bacteria (LAB) strains as biopreservative cultures. So a mesophylic and a psicrotrophyc LAB strains collections were confectioned.The antagonistic capacity toward usual contaminant bacteria in blood of the mesophylic and psicrotrophyc collections at 30ºC and 15ºC respectively were investigated. The LAB that demonstrated the widest inhibitory spectrum in agar plate evaluation (7,1% at 30ºC and 11% at 15ºC) were screened in order to evaluate their inhibitory activity in blood, where was observed that the addition of glucose at 2% had a positive effect in the inhibitory levels. The most sensible indicators to the mesophylic LAB were S. aureus and P. fluorescens. In some cases it was obtained reductions of 7 logarithmic units. In psicotrophic conditions the most sensible bacteria to LAB presence was Bacillus spp. where 8 of the 11 strains assayed inhibited in more than 4 logarithmic units and 1 of them inhibited this indicator in 7 logarithmic units..It was obtained maxim reductions of 3 logs versus E. coli. P. fluorescens was inhibited by all the assayed strains and in some case it was obtained reductions superior to 5 logs.The 5 mesophylic and 7 psictrophyc strains that demonstrated the widest inhibitory spectrum toward the indicators microorganisms from abattoir blood were identified using molecular techniques though comparison of the gene sequences that codify the synthesis of 16S RNAr (16S DNAr) with the sequences in the data base.5 from the 7 strains with antagonistic capacity in psicotrophyc conditions were identified like Lactococcus garvieae and the other two strains were identified like Enterococcus malodoratus/gilvius/raffinosus. All the antagonistic LAB in mesophylic conditions belonged to genus Lactobacillus, 3 of them were identified like Lactobacillus murinus/animalis and one of them as Lactobacillus reuteri. TA20 that had a widest spectrum at both assay temperatures was identified as Lactococcus garvieae.In this study there were evaluated three methods of conservation of cultures belonged to those LAB that demonstrated antagonistic capacity. It was compared freeze-drying, spray drying against freezing at -80ºC, that is the method used to conserve both LAB collections. Generally, the dehydration methods (freeze-drying and spray drying) and maintaining in refrigeration at 5ºC of dehydrated cultures showed to be better than freezing at -80ºC.

In Schizosaccharomyces pombe, the MAPK pathway Sty1 is activated upon several stress situations, like osmotic and oxidative stress, stationary phase, UV radiation or heat shock. Since the modulation of gene expression is one of the main outputs of this response, we focused this Thesis work on the charactherization of the transcription regulation by the activation of the Sty1 pathway and through the transcription factors Atf1 and Pcr1. Moreover, we extend our field of interest investigating how stress–related chromatin remodelers are affecting the stress defence transcription of the cells. / En Schizosaccharomyces pombe, la vía de la MAPK Sty1 es activada ante diferentes situaciones de estrés, como son el estrés oxidativo u osmótico, fase estacionaria, radiación UV o choque de calor. Al ser la modulación de la expresión génica uno de los más importantes objetivos de esta respuesta, hemos focalizado el trabajo de esta Tesis doctoral en la caracterización de la regulación transcripcional mediada por la activación de la ruta de Sty1 y los factores de transcripción Atf1 y Pcr1. Además, hemos ampliado nuestra área de interés investigando el papel de remodeladores de cromatina relacionados con la respuesta a estrés y cómo a participan en la transcripción estrés-dependiente.

Se identificaron taxonómicamente los microorganismos aislados de la fermentación espontánea de ají charapita “Capsicum frutescens” mediante técnicas moleculares, fenotípicas y microbiológicas. Para ello, se realizó el seguimiento al proceso fermentativo mediante técnicas fisicoquímicas y microbiológicas tanto de bacterias ácido lácticas (BAL) y levaduras en medios MRS y YPD. En la identificación molecular de especies bacterianas se utilizaron los genes ribosómicos 16S amplificados y cortados con AluI, HaeIII y MseI; y para levaduras se amplificó la región 5.8S con los espaciadores intergénicos colindantes (ITS) y se cortaron con HinfI, CfoI y HaeIII. De igual forma, se realizó la genotipificación de cepas, bacterias y levaduras mediante la técnica REP - PCR usando el primer (GTG)5. Asimismo, se realizó la secuenciación parcial de los genes ribosómicos amplificados 16S y la región 5.8S - ITS para bacterias y levaduras respectivamente. Además, se analizó la microbiota del ají charapita sin fermentar. De este modo, se identificó a Lactobacillus plantarum, Leuconostoc pseudomesenteroides y Weissella confusa, la última especie se aisló solo en el ají charapita sin fermentar. Con respecto a las levaduras se identificaron a Kodamaea ohmeri, Hanseniaspora opuntiae, Debaryomyces nepalensis, Pichia kudriavzevii y Candida parapsilosis. En conclusión, mediante técnicas microbiológicas y moleculares, se identificaron a las BAL y levaduras, siendo Lactobacillus plantarum predominante en la fermentación espontánea del ají charapita. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú). Fondo para la Innovación, la Ciencia y la Tecnología (FINCyT) / Tesis

Tesis por compendio / [EN] The selective and sensitive detection of single nucleotide variations is essential for early diagnosis, individualized therapy, and disease prognosis. The SARS-CoV-2 pandemic has highlighted the pressing need to develop reliable, rapid and simple detection methods for mass diagnosis. Likewise, there is a growing demand for genomic biosensors that are selective, multi-analyte and low-cost and allow the detection and identification of certain oncological biomarkers. This doctoral thesis has focused on the development of integrated systems of isothermal amplification, selective hybridization and optical biosensing for detection of point mutations in the PIK3CA, KRAS and BRAF genes associated with colorectal cancer. These predictive biomarkers are related to increased cell proliferation, apoptosis, and resistance to monoclonal antibody treatments (Cetuximab and Panitumumab). Isothermal DNA amplification methods have been explored, as they are particularly suitable for the development of a new generation of diagnostic devices aimed at supporting precision medicine. Specifically, isothermal amplification by recombinase-polymerase (RPA) has been selected as an alternative to detection methods that require unique infrastructures. In addition, its integration with bioanalytical platforms has been investigated, which represents a great advance for the simplification of biorecognition processes and their optical detection. This methodology has presented advantages over other DNA detection systems, in terms of portability and equipment, as well as reduction of test times and the possibility of performing diagnostic tests outside the laboratory. This doctoral thesis, framed in this context, is structured in 4 chapters: In chapter 1 a new variant of recombinase-polymerase amplification is presented, called RPA-blocked, based on the enrichment of minority alleles by introducing a blocking agent. In addition, this research has developed an analytical support consisting of a polycarbonate chip with covalently anchored allele-specific probes.The integration of the method has allowed the development of a portable system for the simultaneous genotyping of mutations in exons 9 and 20 of the PIK3CA gene. in cell lines and tumor tissues of cancer patients. In Chapter 2, the development of a genosensor that incorporates magnetic particles conjugated to allele-specific probes for the concentration and detection of the selective amplification product derived from RPA-blocked is described. With this genosensor, hybridization times and reaction volumes have been reduced. This approach has resulted in a portable and low-cost system for genotyping the KRAS gene applicable to solid tumor samples. Chapters 3 and 4 focus on the development of thermoplastic surfaces for the covalent anchoring of allele-specific probes mediated by dendrimeric molecules, with the aim of increasing the immobilization density. Thus, the covalent anchoring to activated polycarbonate and cycloolefin thermoplastic surfaces of allele-specific probes has been studied, mediated by carboxylic dendrimers through carbodiimide chemistry and by dendrons through the chemoselective reaction of the thiol-ino group. These multiplexed genosensors have allowed the genotyping of the V600 codon of the BRAF gene and the H1047 codon of the PIK3CA gene, in biopsied tissue samples. The research carried out in this thesis has given rise to new methodological contributions of interest based on obtaining integrated biosensor systems. These platforms will contribute to the development of massive diagnostic tools. / [ES] La detección selectiva y sensible de variaciones de nucleótido único es fundamental para el diagnóstico precoz, la terapia individualizada y el pronóstico de enfermedades. La pandemia SARS-CoV-2 ha puesto de manifiesto la necesidad acuciante de desarrollar métodos de detección fiables, rápidos y sencillos para el diagnóstico masivo. Asimismo, existe una demanda creciente de biosensores genómicos que sean selectivos, multianalito y de bajo coste y permitan detectar e identificar ciertos biomarcadores oncológicos.La presente tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de sistemas integrados de amplificación isoterma, hibridación selectiva y biosensado óptico para la detección de mutaciones puntuales en los genes PIK3CA, KRAS y BRAF asociadas al cáncer colorrectal. Estos biomarcadores predictivos se relacionan con un incremento de la proliferación celular, apoptosis y resistencia a tratamientos con anticuerpos monoclonales (Cetuximab y Panitumumab). En este contexto, se han explorado los métodos isotermos de amplificación de ADN, dado que son particularmente adecuados para el desarrollo de una nueva generación de dispositivos de diagnóstico dirigidos a apoyar la medicina de precisión. En concreto, se ha seleccionado la amplificación isoterma por recombinasa-polimerasa (RPA) como una alternativa a los métodos de detección que requieren de infraestructuras singulares. Además, se ha investigado su integración con plataformas bioanalíticas, lo que supone un gran avance para la simplificación de los procesos de biorreconocimiento y su detección óptica. Esta metodología ha presentado ventajas frente a otros sistemas de detección de ADN, en términos de portabilidad y equipos, así como reducción de tiempos de ensayo y la posibilidad de realizar las pruebas de diagnóstico fuera del laboratorio. La presente tesis doctoral, enmarcada en este contexto, se estructura en 4 capítulos: En el capítulo 1 se presenta una nueva variante de la amplificación por recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloqueada, basado en el enriquecimiento de alelos minoritarios mediante de la introducción de un agente bloqueante. Además, en esta investigación se ha desarrollado un soporte analítico formado por un chip de policarbonato con sondas alelo-específicas ancladas covalentemente.La integración del método ha permitido desarrollar un sistema portátil para el genotipado simultáneo de mutaciones en los exones 9 y 20 del gen PIK3CA en líneas celulares y en tejidos tumorales de pacientes oncológicos. En el capítulo 2, se describe el desarrollo de un genosensor que incorpora partículas magnéticas conjugadas a sondas alelo-específicas para la concentración y detección del producto de amplificación selectivo derivado de la RPA-bloqueada. Con este genosensor, se han reducido los tiempos de hibridación y los volúmenes de reacción. Esta aproximación se ha concretado en un sistema portátil y de bajo coste para el genotipado del gen KRAS aplicable a muestras de tumores sólidos. Los capítulos 3 y 4 se centran en el desarrollo de superficies termoplásticas para el anclaje covalente de sondas alelo-específicas mediado por moléculas dendriméricas, con el objetivo de incrementar la densidad de inmovilización. Así, se ha estudiado el anclaje covalente a superficies termoplásticas de policarbonato y cicloolefina activadas, de sondas alelo-específicas, mediado por dendrímeros carboxílicos mediante la química de la carbodiimida y por dendrones mediante la reacción quimioselectiva del grupo tiol-ino. Dichos genosensores multiplexados han permitido el genotipado del codón V600 del gen BRAF y el codón H1047 del gen PIK3CA, en muestras de tejido biopsiado. Las investigaciones desarrolladas en la presente tesis han dado lugar a nuevas aportaciones metodológicas de interés basadas en la obtención de sistemas biosensores integrados. Estas plataformas, contribuirán al desarrollo de herramientas de diag / [CAT] La detecció selectiva i sensible de variacions de nucleòtid únic és fonamental per al diagnòstic precoç, la teràpia individualitzada i el pronòstic de malalties. La pandèmia SARS-CoV-2 ha posat de manifest la necessitat apressant de desenvolupar mètodes de detecció fiables, ràpids i senzills per al diagnòstic massiu. Així mateix, existeix una demanda creixent de biosensors genòmics que siguen selectius, multianàlit i de baix cost i permeten detectar i identificar uns certs biomarcadors oncológics. La present tesi doctoral s'ha centrat en el desenvolupament de sistemes integrats d'amplificació isoterma, hibridació selectiva i biosensat òptic per a la detecció de mutacions puntuals en els gens PIK3CA, KRAS i BRAF associades al càncer colorectal. Aquests biomarcadors predictius es relacionen amb un increment de la proliferació cel·lular, apoptosi i resistència a tractaments amb anticossos monoclonals (Cetuximab i Panitumumab). S'han explorat els mètodes isoterms d'amplificació d'ADN, atés que són particularment adequats per al desenvolupament d'una nova generació de dispositius de diagnòstic dirigits a donar suport a la medicina de precisió. En concret, s'ha seleccionat l'amplificació isoterma per recombinasa-polimerasa (RPA) com una alternativa als mètodes de detecció que requereixen d'infraestructures singulars. A més, s'ha investigat la seua integració amb plataformes bioanalítiques, la qual cosa suposa un gran avanç per a la simplificació dels processos de biorreconeiximent i la seua detecció òptica. Aquesta metodologia ha presentat avantatges enfront d'altres sistemes de detecció d'ADN, en termes de portabilitat i equips, així com reducció de temps d'assaig i la possibilitat de realitzar les proves de diagnòstic fora del laboratori. La present tesi doctoral, emmarcada en aquest context, s'estructura en 4 capítols: En el capítol 1 es presenta una nova variant de l'amplificació per recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloquejada, basat en l'enriquiment d'al·lels minoritaris mitjançant de la introducció d'un agent bloquejant. A més, en aquesta investigació s'ha desenvolupat un suport analític format per un xip de policarbonat amb sondes al·lel-específiques ancorades covalentemente.la integració del mètode ha permés desenvolupar un sistema portàtil per al genotipat simultani de mutacions en els exons 9 i 20 del gen PIK3CA en línies cel·lulars i en teixits tumorals de pacients oncològics. En el capítol 2, es descriu el desenvolupament d'un genosensor que incorpora partícules magnètiques conjugades a sondes al·lel-específiques per a la concentració i detecció del producte d'amplificació selectiu derivat de la RPA-bloquejada. Amb aquest genosensor, s'han reduït els temps d'hibridació i els volums de reacció. Aquesta aproximació s'ha concretat en un sistema portàtil i de baix cost per al genotipat del gen KRAS aplicable a mostres de tumors sòlids. Els capítols 3 i 4 se centren en el desenvolupament de superfícies termoplàstiques per a l'ancoratge covalent de sondes al·lel-específiques mediat per molècules dendrimériques, amb l'objectiu d'incrementar la densitat d'immobilització. Així, s'ha estudiat l'ancoratge covalent a superfícies termoplàstiques de policarbonat i cicloolefina activades, de sondes al·lel-específiques, mediat per dendrimers carboxílics mitjançant la química de la carbodiimida i per dendrones mitjançant la reacció quimioselectiva del grup tiol-ino. Dits genosensors multiplexats han permés el genotipat del codó V600 del gen BRAF i el codó H1047 del gen PIK3CA, en mostres de teixit biopsiat Les investigacions desenvolupades en la present tesi han donat lloc a noves aportacions metodològiques d'interés basades en l'obtenció de sistemes biosensors integrats. Aquestes plataformes, contribuiran al desenvolupament d'eines de diagnòstic massiu. / Martorell Tejedor, S. (2021). Desarrollo de métodos integrados para la determinación de biomarcadores genéticos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176006 / Compendio

En la levadura S. cerevisiae, un incremento de la osmolaridad extracelular activa la vía de Hog1, lo que produce una compleja respuesta adaptativa. Entre las respuestas adaptativas que Hog1 coordina, está un importante cambio en el partón de expresión génica. La tesis presentada se centra en la respuesta a nivel de regulación génica, y en ella se ponen de manifiesto nuevos mecanismos por los cuales Hog1 regula la transcripción para inducir genes necesarios para la adaptación celular en respuesta a estrés osmótico. Este trabajo demuestra que Hog1 controla la iniciación y la elongación de la transcripción, interacciona con la RNA polimerasa elongando, y es reclutado en toda la región codificante de los genes que se inducen por estrés osmótico a traves del 3'UTR. Asimismo, Hog1 recluta el complejo remodelador de cromatina RSC para promover un dramático cambio en el posicionamiento de nucleosomas, permitiendo una correcta inducción de la expresión génica. / In the yeast S.cerevisiae, an increase in extra cellular osmolarity activates the Hog1 Pathway, which produces a very complex adaptive response. Among these adaptive responses coordinated by Hog1, there is an important change in the gene expression pattern. The presented Thesis focuses on the response triggered at the genomic level, showing novel mechanisms by which Hog1 regulates transcription to efficiently and properly induce a subset of genes critical for the cellular adaptation to osmotic stress. This work demonstrates that Hog1 promotes and regulates transcription not only at the initiation level, as was previously described, but it also interacts with the RNA Polymerase while elongating, and travels along the coding regions of genes induced upon osmotic stress through recognition of the 3'UTR. Furthermore, Hog1 recruits a chromatin-remodeling complex known as RSC to promote a dramatic change in nucleosome positioning of target genes, allowing a proper induction of the transcription

Regulation of transcription by Stress Activated Protein Kinases (SAPKs) is an essential aspect for adaptation to extracellular stimuli. In mammals, the activation of the p38 SAPK results in the regulation of gene expression through the direct phosphorylation of several transcription factors. However, how p38 SAPK regulates the proper gene expression program of adaptation to stress as well as the basic mechanisms used by the SAPK remains uncharacterized. The results displayed in this manuscript show that the p38 SAPK plays a central role in the regulation of gene expression upon stress, as up to 80% of the upregulated genes are p38 SAPK dependent. Moreover, we also observed that a specific set of genes were upregulated in response to each specific stimuli, and just a small set of genes were commonly up-regulated by several stresses, which involves mainly transcription factors. In addition, we observed that, to proper regulate gene transcription, the p38 SAPK is recruited to stress-induced promoters via its interaction with transcription factors. Additionally, p38 activity allows the recruitment of RNA polymerase II and the MAPKK MKK6 to stress-responsive promoters. The presence of active p38 SAPK at open reading frames also suggests the involvement of the SAPK in elongation. Altogether, the results showed in this manuscript establish the p38 SAPK as an essential regulator in the transcriptional response to stress, as well as define new roles for p38 in the regulation of transcription in response to stress. / La regulación de la transcripción por las Proteínas Quinasas activadas por Estrés (SAPKs) es un aspecto esencial para la adaptación a los estímulos extracelulares. En mamíferos, la activación de la SAPK p38 da lugar a la regulación de la expresión génica a través de la fosforilación de varios factores de transcripción. Sin embargo, cómo p38 SAPK regula el programa de expresión génica de adaptación al estrés así como los mecanismos utilizados por la SAPK permanece sin caracterizar. Los resultados presentados en este manuscrito muestran que p38 SAPK juega un rol central en la regulación de la expresión génica en respuesta a estrés, ya que hasta el 80% de los genes inducidos son dependientes de p38 SAPK. También observamos que en respuesta a cada tipo de estrés se induce un grupo de genes específicos, y sólo hay una pequeña respuesta de genes comunes a los diferentes tipos de estrés la cual engloba principalmente factores de transcripción. Además, hemos observado que para regular la transcripción, p38 se recluta a los promotores de respuesta a estrés a través de su interacción con factores de transcripción. Asimismo, la actividad de p38 permite el reclutamiento de la RNA Polimerasa II y de la MAPKK MKK6 a los promotores inducidos por estrés. La presencia de p38 activa en las regiones codificantes sugiere su participación durante la elongación. En conjunto, los resultados mostrados en este manuscrito establecen a p38 como un regulador esencial de la transcripción en respuesta a estrés, así como definen nuevas funciones de p38 en la regulación de la transcripción en respuesta a estrés.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 106.pdf: 11011427 bytes, checksum: 47de23ce5361c89a3fe418a1ea675e43 (MD5) Previous issue date: 2006 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Cinco cepas P1/Sabin, 20 cepas P2/Sabin e 2 cepas P3/Sabin isolados a partir de amostras do meio ambiente no Brasil foram analisadas. Neste estudo todos os isolados foram caracterizadas pelo seqüenciamento parcial da região 5 não codificante (NCR) e pelo seqüenciamento completo do gene da proteína VP1, com o objetivo de demonstrar mutações, as quais são importantes para a reversão à neurovirulência. O seqüenciamento parcial da região 5'NCR revelou que todos os poliovírus isolados do sorotipo 1 apresentaram populações de revertentes G480 ->A e os 2 isolados do sorotipo 3 apresentaram a reversão U472 ->C. Nenhum isolado do sorotipo 2 apresentou mutação A481 ->G. O completo seqüenciamento da região de VP1 demonstrou que nenhum isolado P1/Sabin apresentou substituição nucleotídica, as 2 cepas P3/Sabin apresentaram VP1-6 (Thr ->Iso) e 16 cepas P2/Sabin apresentaram VP1-109 (Lys ->Arg). O isolado P2/26183 também apresentou mutações VP1-103 (Ser ->Lys) e VP1-116 (Val ->Gly), enquanto P2/26184 apresentou VP1-155 (Cys ->Tyr). As regiões 2C e 3D do genoma foram investigadas pelo uso de primers que hibridizam nestas áreas com o objetivo de verificar a presença de recombinação. Nenhuma cepa envolvida no estudo foi identificada como recombinante. Nenhum poliovírus derivado da vacina foi detectado. / Five strains of P1/Sabin, 20 strains of P2/Sabin and 2 strains of P3/Sabin isolated from environmental samples in Brazil were analyzed. In this study all isolates were characterized by partial genomic sequencing of the 5’ noncoding region (NCR) and the complete VP1 protein gene VP1, with the objective of finding mutations, which are important for neurovirulence reversion. Partial sequencing of 5’NCR revealed that all type 1 poliovirus isolates had the G→A substitution at the nt 480 and the 2 type 3 poliovirus isolates had the U→C substitution at the nt 472. None type 2 isolate had A→G substitution 481. The complete sequencing of the VP1 region showed that none P1/Sabin strain had nucleotide substitution, the 2 P3/Sabin strain had VP1"6 (Thr→Iso) and 16 P2/Sabin strain had VP1"109 (Lys→Arg). The isolate P2/26183 also presented mutations VP1"103 (Ser→Lys) and VP1"116 (Val→Gly), while P2/26184 showed VP1"155 (Cys→Tyr). The 2C and 3D regions of the viral genome were investigated by the use of primers that hybridize in these areas with the objective to verify the presence of recombination. None of the strain involved in this study was identified as recombinant. None vaccine derived poliovirus was detected.