El documento digital no refiere asesor / Caracteriza a nivel molecular las cepas del virus de la Enfermedad de Newcastle (ENC) aislado de aves domésticas de diferentes regiones del Perú mediante la prueba de Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) y secuenciación del gen de la proteína de fusión. Las muestras clínicas de aves de traspatio, riña y granjas avícolas comerciales procedentes de brotes de ENC ocurridos en el país, fueron recolectados entre los años 2009 al 2011. Las pruebas de RT-PCR detectaron la presencia del virus de la ENC en todas las muestras de aves, se determinó cepas ENC de alta patogenicidad en aves de traspatio y riña y de baja patogenicidad en aves de traspatio y granjas avícolas comerciales. Con el propósito de evaluar la virulencia de los aislamientos virales, se amplificó y secuenció la principal región funcional del gen de la proteína de fusión, para así realizar el análisis filogenético y determinar el patotipo. La secuenciación del gen de la proteína de fusión de los aislamientos virulentos, presentó la secuencia 113RQKRF117 con aminoácidos básicos entre las posiciones 113 al 116 y una fenilalanina en la posición 117; lo cual es característico de los aislamientos virulentos velogénicos. Además, se agruparon en el genotipo VII y poseen mayor similitud con los virus Newcastle virulentos reportados en Perú y Malasia. La proteína fusión en las cepas de baja virulencia presentaron aminoácidos básicos en la posición 113 y 116 y una leucina en la posición 117, lo cual es característico de los virus ENC lentogénicos. Además se agruparon en los genotipos I y II, presentando ambos genotipos mayor similitud con los virus ENC de EEUU. / Tesis

La reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es un proceso ubicuo en laboratorios biológicos. Su uso específico que nos interesa en este trabajo es el de bio identificación de micro organismos en muestras biológicas ambientales, área conocida como metagenómica. Un PCR exitoso requiere pequeñas secuencias de nucleótidos llamadas “partidores”, las cuales deben satisfacer variadas condiciones termodinámicas y biológicas. El proceso de diseño de ellos es un tema de amplio estudio en bioinformática, pues es un proceso maduro y que necesita cada vez más contar con predicciones computacionales de su desempeño. El objetivo de esta memoria es desarrollar una herramienta de uso intensivo para el diseño de partidores de PCR en metagenómica, basándose en el trabajo previo del Laboratorio de Bioinformática y Matemática del Genoma (LBMG) de la Universidad de Chile. El sistema existente es una colección de programas, algunos de cómputo paralelo, que permiten definir un universo taxonómico, calcular partidores para dicho universo y simular su comportamiento numéricamente. Sin embargo, el sistema es de difícil operación e insuficiente extensibilidad. La metodología para este trabajo consiste de una revisión bibliográfica del estado del arte en la literatura científica y del LBMG, para posteriormente proceder a un re diseño que contemple las extensiones de interés y una re implementación del sistema acorde al re diseño. El resultado obtenido es el núcleo de la herramienta, con un diseño claro y escalable, junto con su correspondiente implementación, que tiene las mismas funcionalidades del sistema existente exceptuando la paralelización. Se obtiene además una especificación de las cualidades que se deben añadir o completar para contar con un sistema finalizado y operativo de uso intensivo. Se concluye que el trabajo realizado representa un avance importante en la sistematización del diseño de partidores para PCR sobre el cual basar trabajos futuros de extensión, aplicación a distintos dominios biológicos y como muestra de desarrollos concretos realizados íntegramente en el LBMG.

Detecta Mycobacterium tuberculosis en muestras de heces de niños del Instituto Nacional de Salud del Niño, mediante la técnica molecular de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para esto se toman muestras biológicas de heces de 236 niños menores de 12 años de edad pertenecientes al Instituto Nacional de Salud del Niño, estas muestras son sometidas a dos métodos de extracción de ADN una denominado “FastDNA® SPIN Kit for Soil” (Qbiogene) y el otro “Chelex 100”. Este estudio demuestra que se puede estandarizar la técnica de PCR para detección de M. tuberculosis en muestras de heces, y sus posibles aplicaciones como método rápido de diagnóstico, en una población en donde la naturaleza paucibacilar de las muestras convencionales no permite la detección inmediata del bacilo. / Tesis

Establece un protocolo de validación dirigido a la estandarización, optimización y validación de una prueba de PCR convencional para el diagnóstico confirmatorio del HTLV-1 en PBMCs. Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) o en tiempo real de tipo cuantitativa (qPCR) son propuestas debido a su versatilidad a materiales biológicos, alta sensibilidad y especificidad y relativo bajo costo. La detección del provirus del HTLV-1 por pruebas de PCR convencional tiene bajo costo y es aplicable a diversos formatos como placas de 96 pozos, tiras de 8 pozos y tubos individuales. En contraparte, las pruebas de qPCR generalmente usan master mix universales que limitan las oportunidades de optimización y requiere del uso de una placa de reacción de 96 pozos para el procesamiento de 16 muestras. Por tanto, se desarrolla una prueba de PCR convencional priorizando su utilidad como prueba cualitativa confirmatoria del HTLV-1 de bajo costo y aplicación a diversos formatos de procesamiento. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad viral de distribución mundial, letal y altamente contagiosa, producida por el Virus Distemper Canino, el cual afecta a un amplio rango de hospederos, como perros domésticos y representantes silvestres de distintas familias de carnívoros, comprometiendo drásticamente la conservación de especies amenazadas. Para el diagnóstico definitivo ante-mortem de la enfermedad, se han sugerido una gran variedad de parámetros clínicos y diferentes tipos de ensayos, sin embargo, debido al curso imprevisible y variable de ésta, el diagnóstico final para algunos animales continúa siendo incierto. En consideración a lo anterior y a que el desarrollo de técnicas moleculares ofrece diversos procedimientos para pruebas diagnósticas, el objetivo de esta memoria de título postuló la detección del gen de la proteína de la nucleocápside del Virus Distemper Canino mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a transcripción inversa, como una forma de diagnóstico rápido y específico para la detección del virus. La especificidad del método se evidenció por la amplificación del fragmento esperado en el 100% de los controles positivos a Virus Distemper Canino, tanto los tres controles vacunales (cepa Onderstepoort, Lederle y Snyder Hill), como los diez controles de RNA viral provenientes desde aislados nacionales, y en la no amplificación del fragmento esperado en los controles negativos (perros no infectados con y sin vacunación). Sumado a esto, los fragmentos de DNA amplificados fueron enviados a secuenciar y mediante el programa BLAST, se confirmó que éstos correspondían a Virus Distemper Canino. Además, se propone que el método podría tener una alta sensibilidad, debido a la amplificación del fragmento esperado en el 91% de las muestras de campo provenientes de perros sospechosos de Distemper Canino. En base a lo anterior, el método implementado puede colaborar con la prevención y el control del aumento de Distemper Canino, tanto en la población canina, como en otros animales susceptibles a la enfermedad / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Cadmio (Cd2+) es un contaminante ampliamente distribuido en el ambiente; la exposición de la población ocurre principalmente a través del humo de tabaco. Se han descrito efectos adversos en la salud, algunos de los cuales son dependientes del sexo. Específicamente, en crías expuestas durante la gestación, disminuye el peso de nacimiento (PN) lo que se asocia a una exposición fetal aumentada a glucocorticoides (GC). Los GC actúan a través de sus receptores específicos (GR) localizados en los tejidos blancos; en el hígado, la unión GC-GR activa la expresión de genes involucrados en el metabolismo de carbohidratos (CH) y lípidos. Entre éstos se encuentra el gen de la enzima fosfoenol piruvato carboxiquinasa (PEPCK, limitante en el proceso de gluconeogénesis) y el de la enzima acetil Co-A oxidasa (AOX, limitante en el proceso de β-oxidación peroxisomal). En este estudio, se postuló que el Cd2+ administrado durante la gestación induce en las crías neonatas una alteración en la expresión hepática del GR y consecuentemente, de sus genes blancos, PEPCK y AOX, con una concomitante alteración en los niveles hepáticos de glicógeno, triacilglicerol (TAG) y colesterol, de manera diferenciada en machos y hembras. El modelo de estudio utilizado fue ratas de la cepa Wistar tratadas con 10 ppm de Cd2+ (como CdCl2 en el agua de bebida) desde el destete hasta el cruzamiento, y luego con 50 ppm de Cd2+ durante toda la gestación. Posteriormente, en el hígado de las crías neonatas se determinó la expresión de GR (proteína, mediante Western Blot y mRNA por qRT-PCR), PEPCK (mRNA) y AOX (mRNA). También se analizó el contenido de glicógeno, TAG y colesterol. Los resultados indican que GR hepático aumenta su expresión en hembras y en machos disminuye. También hay efectos diferenciados en los niveles de mRNA para PEPCK, y AOX. Se concluye que la exposición a Cd2+ durante el desarrollo induce alteraciones tempranas en el patrón de expresión de genes relacionados con el sistema GC y metabolismo de CH y lípidos. Los efectos son dependientes del sexo y pueden inducir una reprogramación fetal a largo plazo explicando el desarrollo de ciertas patologías / Fondecyt No. 1071110

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus de la influenza porcina o SIV (Swine Influenza Virus), es un patógeno que afecta el sistema respiratorio y produce una de las enfermedades más prevalentes a nivel de industria porcina. Está distribuido en todo el mundo y genera importantes pérdidas económicas. Además, SIV se considera un patógeno zoonótico con potencial pandémico. A partir del brote de influenza humana A H1N1 ocurrida el año 2009, ha surgido la necesidad de conocer y entender las dinámicas de evolución y transmisión de este virus, para beneficio de la salud humana y animal. Realizar un estudio en Chile adquiere especial relevancia, ya que se necesita conocer la realidad actual de SIV en los planteles de producción intensiva de cerdos. El presente estudio tiene como objetivo detectar y aislar virus de Influenza A en la población de cerdos de la zona central de Chile, territorio en donde se concentra la gran mayoría de los planteles de producción intensiva. Para esto se obtuvieron muestras de hisopos nasales y fluidos orales desde 6 granjas ubicadas en esta zona (regiones V, RM, VI y VII) entre el año 2014-2015 en distintas épocas del año. Se utilizó RT-PCR en tiempo real para detectar el virus y se aisló mediante cultivo celular usando células MDCK. Los resultados obtenidos demostraron la presencia del virus en todos los planteles muestreados. Hubo al menos dos muestras positivas a RT-PCR en tiempo real por granja. De las muestras sometidas a RT-PCR en tiempo real un 22,26% de ellas fueron positivas. Además se lograron aislar con éxito un total de 20 virus desde hisopos nasales y 2 desde fluidos orales, que corresponden a un 8,30% de las muestras obtenidas. Estos resultados indican que SIV es un patógeno frecuentemente encontrado en planteles de producción intensiva en Chile y altamente distribuido a nivel geográfico (desde la V a la VII región), por tanto podría considerarse endémico. / Swine Influenza virus (SIV) is an important respiratory pathogen in intensive pig population, generating significant economic losses for the industry. Also, SIV is a zoonotic pathogen with pandemic potential. Since the 2009 human pandemic caused by a swine origin Influenza virus H1N1, the concern about this pathogen in pigs has been increased. Then, is urgent to understand the dynamics of evolution and transmission of this virus, for animal and public health. The information about SIV in Chile is scarce; therefore any effort to understand or evidence SIV in the country is highly valuable. The aim of this study was the detection and isolation of SIV in intensive swine farms in central Chile, place where most of the pig are raising. Nasal swabs and oral fluids were collected from six farms (V, RM, VI and VII Regions) during 2014-2015 at different seasons through the year. Samples were tested by real time RT-PCR and virus isolation was attempted in canine kidney cells (MDCK). The results showed the presence of SIV in all farms tested. At least 2 samples per farm tested positive by real time RT-PCR. Overall results by real time RT-PCR have shown a 22.3% positive samples. Also, virus isolation was succeeding in 20 nasal swabs and 2 oral fluids, corresponding to 8.30% of the samples collected. Results indicate that SIV is widespread in pig population in the region can be considered endemic. / Financiamiento: Proyecto Aislamiento, diagnóstico y caracterización de virus influenza A en producción intensiva porcina nacional, 2014 Zoetis-Favet Etapa 1.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / El documento digital no refiere asesor / Desarrolla una técnica de PCR para identificar la mutación 904_906delGAG/907_909delGAG del gen TORSINA1A. Utilizando 5 muestras de personas saludables (controles negativos) y 2 muestras de pacientes DYT1 (controles positivos). Se estandarizó dos protocolos de PCR convencional, uno con 4 y otro con 2 cebadores. Los cebadores fueron diseñados con el programa AmplifX. Los ensayos in vitro revelaron una baja especificidad de los cebadores 3 y 4 en el primer protocolo. El protocolo con 2 cebadores, mostró una banda adicional con un patrón de migración semejante a un fragmento de 250 pb, solo presente en controles positivos, y consistente con los resultados de PCR-RFLP, técnica estándar de oro para identificar esta deleción. Utilizando el protocolo PCR con dos cebadores, se identificó la deleción 904_906delGAG/907_909delGAG en 5 de 25 pacientes (20%) con sospecha de DYT1 atendidos en el servicio de Neurogenética del INCN. Un protocolo basado en PCR convencional con dos cebadores permite discriminar la presencia de la mutación 904_906delGAG/907_909delGAG del gen TORSINA1A vinculada a DYT1. Estudios posteriores que analicen la banda adicional obtenida con los cebadores 1 y 2, permitirían validar este procedimiento para diagnóstico en la práctica clínica. / Tesis

Determina la capacidad virulenta de una cepa aislada de la vesícula biliar de un cuy, con signos compatibles con salmonelosis, para identificar sus genes asociados a virulencia y resistencia a antibióticos. En este estudio, el genoma completo de S. Typhimurium cepa VET1 se sometió a un análisis in silico, que comenzó con el secuenciamiento mediante la plataforma Illumina HiSeq para generar lecturas de 2 × 101 pb. La calidad de los datos se verificó con FASTQC y los adaptadores fueron recortados con Trimmomatic. Las lecturas fueron ensamblados usando Velvet v.1.2.10 y se generaron 149 contigs con una cobertura de 111.0x, que dio como resultado un tamaño total del genoma de 4 905041 pb, con un contenido de G + C del 52.14%. La anotación génica mostró 4 885 genes, de los cuales 4 630 fueron CDS y 255 ARN, incluyendo 2 de ARNr, 56 ARNr y 197 ARNnc. Usando PHASTER, se identificaron tres regiones de profagos, incluyendo Gifsy-2, 118970_sal3 y RE-2010. La cepa VET1 fue asignada a ST19 utilizando el tipo de secuencia multilocus (MLST). Se identificó un total de 244 factores de virulencia. Entre ellos, 78 pertenecían a genes codificadores del sistema de secreción tipo 3 (T3SS), 68 a genes codificadores de la adherencia fimbrial y 51 a genes que codifican flagelos. Se consultó la base de datos CARD para identificar genotipos relacionados con la resistencia en el genoma de S. Typhimurium VET1. Se identificaron un total de 16 proteínas relacionadas a resistencia antimicrobiana, que pertenecen a 6 familias diferentes de genes de resistencia a antibióticos. Este estudio mostró que la cepa VET1 alberga genes que codifican adhesinas, proteínas flagelares, T3SS, sistemas de adquisición de hierro y genes de resistencia a antibióticos que pueden explicar la patogenicidad, capacidad de colonización y persistencia en el cuy. La existencia de elementos genéticos móviles sugiere que esta cepa podría adquirir y transferir material genético. El análisis genómico comparativo entre VET1 y otras cepas de Salmonella proporcionaría información fructífera para comprender la especificidad del huésped y desarrollar medidas de control contra la infección por S. Typhimurium. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú) / Tesis

Determina la presencia de Escherichia coli patógeno en carne de pollo, mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se usa 50 muestras de carne de pollo provenientes de 5 mercados y 2 supermercados de Lima Metropolitana. La extracción de ADN se realiza a partir de un cultivo de enriquecimiento de las muestras, mediante la técnica de lisis celular directa, los ADN genómicos extraídos son analizados por PCR múltiplex usando primers específicos para factores de virulencias de Escherichia coli patógena (BfpA, Eae, Stx1 y Stx2). Los resultados muestran la presencia de Escherichia coli patógena en todas las muestras recolectadas. El método de PCR es altamente especifico y muestra una detección temprana de Escherichia coli patógena. La normativa actual no considera la diferenciación entre las cepas comensales con las patógenas, sólo considera la presencia o ausencia de Escherichia coli mediante un recuento microbiológico y establece un límite. Este método podría evitar posibles brotes endémicos. En este estudio se detecta la presencia de Escherichia coli patógeno productor de la toxina shiga tipo 1 (STX1). / Tesis