Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es uno de los principales agentes bacterianos responsables de toxiinfecciones alimentarias, siendo los diferentes productos de la industria avícola la mayor fuente de infección para el hombre. Esto hace necesario un constante monitoreo de Salmonella en los productos avícolas, para evitar brotes de Salmonelosis en la población. El aislamiento de Salmonella mediante el cultivo bacteriológico estándar implica como mínimo 4 a 7 días, después de procesos de pre-enriquecimiento y enriquecimientos en las etapas preliminares, antes de su identificación con pruebas bioquímicas y serológicas. Para reducir los tiempos y costos que involucra la utilización del cultivo bacteriológico estándar, se han desarrollado técnicas rápidas de detección de Salmonella spp. El Lightcycler PCR (Roche) de tiempo real permite reducir los tiempos de detección, procesar hasta 32 muestras simultáneamente y realizar el diagnóstico con una alta especificidad y sensibilidad. El objetivo de este trabajo fue comparar el PCR de tiempo real con detección por sondas fluorescentes, mediante la utilización de un kit diagnóstico comercial diseñado originalmente para muestras de alimentos, con el cultivo bacteriológico estándar, para la detección de Salmonella typhimurium en los dos tipos de muestras que oficialmente son remitidas, directamente desde las plantas faenadoras, al Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) del Ministerio de Agricultura. Las muestras de piel de cuello y agua de lavado de canales de pollos fueron inoculadas experimentalmente con 104 ufc/ml de S. typhimurium nal r rif r. De las 132 muestras de piel de cuello de pollo analizadas por PCR tiempo real, 46 muestras (34,8%) fueron positivas y 86 muestras (65,2%) fueron negativas. De las 132 muestras de agua de lavado de canales de pollo analizadas por PCR tiempo real, 116 muestras (87,9%) fueron positivas y 16 muestras (12,1%) fueron negativas. Todas las muestras analizadas por cultivo bacteriológico estándar fueron positivas. Basado en estos resultados, se puede afirmar que existen diferencias significativas en la detección de Salmonella spp. entre el cultivo bacteriológico estándar y el PCR tiempo real realizado con un kit diagnóstico comercial originalmente diseñado para muestras de alimentos, por lo que el ensayo diagnóstico más apropiado para la detección de Salmonella spp. desde piel de cuello y agua de lavado de canales de pollos es el cultivo bacteriológico estándar / Financiada parcialmente por Laboratorio Roche Chile S.A.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los serotipos de Salmonella tradicionalmente se han clasificado mediante métodos serológicos que determinan antígenos somáticos y flagelares específicos. Sin embargo, este método diagnóstico es caro y tarda mucho tiempo en dar un resultado ya que requiere implementar una batería de anticuerpos para detectar los más de 2.500 serotipos de Salmonella enterica que se han identificado. Por otra parte, la identificación molecular de los genes responsables de la expresión de antígenos flagelares son más rápidos y más sensibles que la identificación serológica. Es por esto que, en la presente memoria se implementaron pruebas de PCR para identificar S. enterica serotipos Typhimurium y Hadar, ambas incluidas en un plan nacional de control de Salmonella en establecimientos comerciales de aves. Se analizaron 135 cepas, 50 correspondientes a S. Typhimurium, 50 a S. Hadar y 35 enterobacterias como controles negativos. Estas cepas, previamente serotipificadas en el Instituto de Salud Pública (ISP), fueron sometidas a la prueba de PCR para determinar si existen diferencias de diagnóstico entre ambas técnicas. Del total de cepas analizadas, sólo 46 cepas de S. Typhimurium dieron positivas a la prueba de PCR y cuatro dieron negativas, mientras que las 50 cepas de S. Hadar dieron positivas a las dos pruebas de PCR. Las 35 enterobacterias dieron negativas a las 3 pruebas de PCR. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio, la detección de antígenos mediante serotipificación y PCR para las cepas de S. Typhimurium fue menor al esperado (92%), a diferencia de lo que ocurrió con las cepas de S. Hadar en que hubo 100% de acuerdo entre ambas técnicas, sugiriendo que esta prueba de detección de Salmonella es posible reemplazarla por los métodos tradicionales de identificación y así poder acelerar el diagnóstico de esta bacteria de gran importancia para la salud pública

Determina la dinámica poblacional de bacterias ácido lácticas (BAL) en la fermentación controlada de Capsicum frutescens, ají “charapita” por qPCR y los métodos tradicionales. Previamente, se determinó la especificidad de los cebadores WLAB1 y WLAB2 con cepas BAL aisladas de frutos de la región Loreto, así como se elaboró una curva estándar de L. plantarum ATCC 14917 a partir del cultivo en medio MRS y fermentación formulado para determinar los límites de detección de la qPCR. Durante la fermentación, se realizaron análisis microbiológicos para enumerar las BAL por recuento en microscopio, placa y qPCR. Así mismo, se determinaron los azúcares reductores, acidez total titulable y pH. Los recuentos de BAL por microscopía y qPCR fueron similares durante la fermentación. Sin embargo, el recuento de colonias en agar MRS fue menor a los obtenidos con las otras técnicas empleadas. En conclusión, qPCR permitió detectar y cuantificar BAL en la fermentación controlada de chile "charapita". / Tesis

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias Mención Sanidad Vegetal / La Enfermedad del Mosaico de la Higuera está ampliamente distribuida en el mundo y ha sido reportada en varios países, especialmente en la cuenca del Mediterráneo. Sin embargo, para Chile no existe ningún registro de la situación viral de la higuera. En este trabajo se realizó una prospección en los principales cultivos comerciales de este frutal distribuidos en las Regiones de Coquimbo (IV), Valparaíso (V), Libertador Bernardo O´Higgins (VI) y Región Metropolitana. Las variedades “Black Mission” (higo negro) y “Kadota” (higo blanco) fueron encontradas más comúnmente. La detección en las 120 muestras estudiadas se realizó mediante la técnica de RT-PCR. Los virus prospectados fueron FLMaV-1, FLMaV-2, FMV, FMMaV, FFkaV, AFCV-2, FBV-1, FCV, FLV-1 y AFCV-1, de los cuales no fueron detectados los tres últimos. El virus que fue encontrado con mayor frecuencia fue FBV-1 (84,03%), seguido por FMV con una incidencia de 69,75% y FLMaV-1 en 62,18% de las muestras. Las infecciones virales fueron simples (20%), dobles (20,83%), triples (29,17%), cuádruples (25,83%) o quíntuples (0,83%), y 3,33% de las plantas no presentaron ninguno de los virus prospectados. Finalmente, se realizó una caracterización molecular de los aislados virales encontrados en Chile para los virus FMV, FLMaV-1, FLMaV-2, FFkaV, FMMaV y AFCV-2, que confirman esta prospección y clasifican a estos virus a nivel molecular con otras cepas encontradas en diversos países. / The Fig Mosaic Disease (FMD) is widely distributed worldwide and it has been reported in several countries, especially around the Mediterranean basin. However, there is no record of the viral situation of fig trees in Chile. In this research, a viral prospection was done in the main commercial fig orchards, distributed in the regions of Coquimbo (IV), Valparaíso (V), Libertador Bernardo O´Higgins (VI) and Metropolitan Region. “Black Mission” (black fig) and “Kadota” (white fig) were the fig varieties that were most commonly found. 120 samples were analyzed and the detection was made with RT-PCR. FLMaV-1, FLMaV-2, FMV, FMMaV, FFkaV, AFCV-2, FBV-1, FCV, FLV-1 and AFCV-1 were analyzed in each sample, and the last three viruses named here were not found. The most frequent virus was FBV-1, found in 84,03% of the samples, followed by FMV (69,75%) and FLMaV-1 (62,18%). The viral infections were simple (20%), double (20,83%), triple (29,17%), quadruple (25,83%) or quintuple (0,83%), and 3,33% of the plants did not present any of the analyzed virus. Finally, a molecular characterization of the viral isolates found in Chile was conducted for FMV, FLMaV-1, FLMaV-2, FFkaV, FMMaV and AFCV-2, which confirms the results of this prospection and classifies these viruses at a molecular level with viral isolates of other countries.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa un panel de marcadores genéticos de tipo microsatélite en muestras de ADN de los cuatro tipos de camélidos sudamericanos; alpacas, llamas, vicuñas y guanacos. Así mismo se busca conocer la estructura poblacional de alpacas y llamas y su relación con la vicuña y guanaco (especies silvestres). Para ello se evalúa un panel de 11 marcadores microsatélites y un marcador mitocondrial. Del análisis se confirma la existencia de sólo dos haplotipos para los camélidos sudamericanos (I y II) y la presencia de alpacas y llamas híbridas entre ellas. Además, se confirma las relaciones genéticas entre alpacas con vicuñas y llamas con guanacos, contribuyendo a entender el origen de los camélidos domésticos. Los marcadores microsatélite evaluados permiten confirmar que los dos fenotípos de alpacas (huacaya y suri) constituyen un solo grupo genético y que los dos tipos de llamas evaluadas (Q´ara y ch´aku) son genéticamente distintas. Finalmente los análisis desarrollados permiten identificar alpacas y llamas híbridas, animales que podrían poner en riesgo la conservación de nuestros recursos genéticos animales. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú) Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias, Mención Sanidad Vegetal / Entre los frutales de carozo, las principales especies cultivadas son ciruelo (Prunus domestica L.), duraznero (Prunus persica L.), nectarino (Prunus nucipersica L.), almendro (Prunus dulcis L.) y cerezo (Prunus avium L.), siendo los frutos de éste último el más comercializado y con mejor retorno económico. La producción mundial de cerezas en la temporada 2014-2015, alcanzó 2,41 millones de toneladas, cifra que va en aumento, siendo el principal productor Turquía, con 20,7% de la producción mundial en la última temporada, por otro lado, los países que muestran un mayor incremento en su producción son China y Chile (ODEPA, 2015b).

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La piscirickettsiosis es una enfermedad bacteriana producida por Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) que provoca severas pérdidas económicas a la industria del salmón en el sur de Chile por conceptos de mortalidad, tratamientos antimicrobianos y el uso de vacunas. Debido a que su signología no es patognomónica se debe recurrir a pruebas de laboratorio para determinar la presencia de su agente etiológico con el fin de establecer medidas de control y tratamientos adecuados. A pesar de que la enfermedad fue descrita en 1989, la patogénesis y las vías de transmisión de la bacteria se encuentran insuficientemente descritas, por lo que la presente Memoria de Título tuvo como uno de sus objetivos determinar la presencia y asociación de P. salmonis en distintas muestras de 19 peces de la especie salmón coho (Oncorhynchus kisutch) afectados por piscirickettsiosis. En esta Memoria de Título se determinó la presencia de P. salmonis mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa anidada (PCR anidado) en el 79%, 95% y 87% de las muestras de hígado, riñón y heces respectivamente. El análisis estadístico realizado mediante el coeficiente de Kappa, determinó que hígado-riñón y riñón-heces están considerablemente asociados, mientras que hígado-heces poseen una moderada asociación. Adicionalmente, de cada órgano estudiado se realizó un análisis por separado de tres fragmentos de tejido con el fin de establecer si existía consistencia en el diagnóstico entre ellas. Los resultados (analizados también con el coeficiente de Kappa), indicaron débil asociación entre las muestras analizadas, lo que sugiere un riesgo para la detección del agente según el fragmento que se utiliza. Al aumentar la cantidad de tejido analizado se demostró que aumenta la posibilidad de detección de la bacteria. Por otra parte, este estudio constituye el primer reporte de la presencia de la bacteria en heces de salmón coho en condiciones de cultivo en mar a través de la técnica de PCR anidado. No obstante lo anterior, son necesarios más estudios para establecer la viabilidad de la bacteria en el contenido fecal. / Piscirickettsiosis is a bacterial disease caused by Piscirickettsia salmonis. It causes severe economic losses in the salmon industry in southern Chile by concepts of mortality, antimicrobial treatments and the use of vaccines. The clinical signs are not pathognomonic and because of that laboratory tests are required to determine the presence of its causative agent in order to establish control measures and treatments. Piscirickettsiosis was described in 1989 but up to this day, the pathogenesis and transmission routes of the bacteria are still inadequately described, because of that reason one of the main objectives of this work was to determine the presence and association of P. salmonis in different samples of 19 coho salmon (O. kitsuch) affected by piscirickettsiosis. The presence of P. salmonis was determined by the technique of Nested Polymerase Chain Reaction (nested PCR) in 79%, 95% and 87% of the samples of liver, kidney and feces respectively. The statistical analysis performed using the Cohen's Kappa coefficient, found that liver-kidney and kidney-feces are significantly associated, whereas liver-feces have a moderate association. Additionally, separate analysis was made of three pieces of tissue in order to establish whereas the diagnosis between them was consistent. The results (also analyzed with Cohen's Kappa coefficient) indicated weak association between the samples analyzed, suggesting a detection risk according to the fragment analyzed. It was demonstrated that increasing the amount of analyzed tissue increases the detectability of the bacteria. Moreover, this study is the first report about the presence of P. salmonis in coho salmon feces in sea farming conditions through technical of nested PCR. Further studies are necessary to establish the viability of the bacteria in the fecal content. / Financiamiento: Laboratorio Nacional de Referencia para el Diagnóstico de Enfermedades de Especies Hidrobiológicas, U. de Chile. Salmones Humboldt Ltda.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La brucelosis canina es una enfermedad zoonótica causada por Brucella canis, la cual produce signos reproductivos como abortos en hembras e infertilidad en machos, siendo transmitida al hombre a través de contacto con perras que hayan parido o abortado recientemente o por exposición a la bacteria en laboratorios. La enfermedad actualmente presenta tres puntos críticos y que afectan directamente su control y prevención: i) no existen vacunas comerciales, ii) no hay tratamientos antimicrobianos exitosos y iii) existen problemas en el diagnóstico por cultivo tradicional debido a su lento crecimiento e intermitencia en la bacteremia, y problemas en la sensibilidad y especificidad de las técnicas serológicas en el diagnóstico indirecto. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) surge entonces como una opción de diagnóstico por ser altamente sensible y específica, otorgando además una pesquisa rápida. En el presente estudio se estableció la sensibilidad analítica de un protocolo de PCR convencional con partidores diseñados en el país en cultivo puro, muestras de sangre y orina para el diagnóstico de B. canis. La sensibilidad analítica en cultivo puro fue de 22,24 fg/μL de DNA y en muestras de sangre y orina experimentalmente contaminadas de 4,4x100 UFC/mL. La elevada sensibilidad analítica determinada sugiere que este protocolo puede ser utilizado como una alternativa de alto valor para el diagnóstico de B. canis en las muestras mencionadas, siendo importante continuar con esta línea de investigación, orientando estos hacia un estudio más detallado de especificidad y estudios de sensibilidad analítica en otras matrices. / Canine brucellosis is a zoonotic disease caused by Brucella canis, which produces reproductive signs such as abortion in bitches and infertility in dogs. These being transmitted to humans by contact with bitches that have recently given birth or aborted or by exposure to the bacteria in laboratories. Currently, the disease has three critical points that, to date, have not been resolved and that directly affect the control and prevention of this: i) there are no commercial vaccines, ii) no successful antimicrobial treatments and iii) problems in diagnosis; existing both difficulties to isolate the agent because of its slow growth and intermittent bacteremia in bacterial culture, and sensitivity and specificity problems in the numerous serological techniques. The PCR, thus, emerges as a diagnostic option due to its highly sensitive and specific nature, providing a fast diagnosis as a result. In the present study, the analytical sensitivity of conventional PCR protocol with primers designed in the country in pure culture, blood and urine samples for diagnosis of B. canis was established. The analytical sensitivity in pure culture was 22,24 fg/μL of DNA, and in experimentally contaminated blood and urine samples 4,4x100 UFC/mL. Given the high analytical sensitivity suggests that this protocol can be used as a highly valuable alternative for the diagnosis of this disease in the samples mentioned, understanding - consequently -, the major importance to continue this line of research, orienting these to a more detailed study of specificity, and analytical sensitivity studies in other matrices.

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencias de la Acuicultura / La creciente demanda mundial de productos pesqueros y el estancamiento de la pesca extractiva, ha llevado a la acuicultura a la búsqueda de nuevas especies para ser cultivadas. Nowadays, en la región del Bío Bío se potencia al Camarón de Roca como recurso cultivable. La presente investigación genera información base para desarrollar su cultivo, estableciendo parámetros de diversidad genética de sus poblaciones naturales y determinando su grado de estructuración genética. Para ello se utilizaron marcadores moleculares tipo RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) y el gen mitocondrial de la Citocromo Oxidasa subunidad I (COI). Las zonas de muestreadas fueron Guayacán (29°58’0,02”S, 71°21’0,312”W), Zapallar (32º33’01,5”S, 71º27’35,6”W) y Chome (36º46’26”S; 73º12’47”W). De un total de 186 individuos colectados, 170 fueron genotipados con 5 primer RAPD identificándose 34 fragmentos polimórficos. En cuanto a COI se analizaron 54 secuencias que contienen 18 haplotipos. Los resultados de los estadísticos genéticos en el caso de los marcadores RAPD (GST, FST (θ) y Nm) al comparar todas las poblaciones fueron de 0,0425, 0,0486 y 11,27 respectivamente, observándose además identidades genéticas de Nei de 0,926 (Chome- Guayacán), 0,952 (Zapallar-Guayacán) y 0,966 (Chome-Zapallar). Para el caso de COI, el índice de diversidad genética total fue de 0,786. El estadístico FST fluctuó entre -0,029 y - 0,017, las correlaciones de distancias genéticas con las geográficas mediante pruebas de Mantel resultaron ser bajas 0,32 (RAPD) y 0,62 (COI). En el análisis network usando la aproximación Median Joining, se observa una forma de estrella, patrón consistente con una expansión poblacional geográfica reciente. Los análisis realizados indican que no hay presencia de estructuración genética entre las localidades muestreadas. Este estudio es una primera aproximación al conocimiento a nivel genético de esta especie y su estructura poblacional. El análisis de la estructura genética poblacional brindó información importante con respecto a la forma en que se encuentra distribuida la diversidad genética dentro y entre las áreas muestreadas y que estaría apoyando la hipótesis de que no existe estructuración poblacional a una escala geográfica, no obstante para tomar decisiones de manejo en esta especie se recomienda incluir un mayor número de localidades a lo largo de la distribución de la especie. La información aquí expuesta nos permite inferir además la forma de plantear futuros programas de selección asistida por marcadores (MAS) en esta especie. / The growing global request for sea food and the decrease of capture fisheries, aquaculture has led to the search for new species for cultivate. Actually, the rock shrimp (Rhynchocinetes typus) in the Bío Bío is enhanced as the resource rock shrimp cultivation. This research generates basic information to develop this commodity, determining parameters of genetic diversity in natural populations and their degree of genetic structuring. For this objective we used molecular markers RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) and the mitochondrial gene Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). The areas sampled were Guayacán (29 ° 58'0, 02 "S, 71 ° 21'0, 312" W), Zapallar (32 º 33'01, 5 "S, 71 º 27'35, 6" W) and Chome (36 ° 46'26 "S, 73 º 12'47" W). From a total of 186 individuals collected, 170 were genotyped with 5 RAPD primers identifying 34 polymorphic fragments. Regarding COI 54 sequences were analyzed containing 18 different haplotypes. The results of genetic analysis in the case of RAPD markers (GST, FST (θ) y Nm) when comparing all populations were 0.0425, 0.0486, and 11.27 respectively, also the observed Nei genetic identities were 0.926 (Chome-Guayacán), 0.952 (Zapallar- Guayacán) y 0.966 (Chome-Zapallar). For the case of COI, the total genetic diversity index was 0.786. The FST statistic ranged between -0.029 and -0.017, genetic correlations with geographic distances using Mantel tests were found to be low 0.32 (to RAPD markers) and 0.62 (COI gene). In network analysis using Median Joining approximation, there is a starshaped pattern consistent with a recent geographic population expansion. Analyses indicate no presence of genetic structure among localities sampled. This study is a first approach to knowledge at the genetic level of this species and its population structure. Analysis of population genetic structure provided important information regarding the manner in which genetic diversity is distributed within and between sampled areas, that would support the hypothesis that there is no population structure at a geographical scale, however to take management decisions in this species is recommended to include a greater number of locations along the distribution of the species. The information presented also allows us to infer how to approach future programs of marker assisted selection (MAS) in this species.

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