Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La infección por parvovirus canino tipo 2 (CPV-2) es una de las principales causas de enteritis hemorrágica en perros de todo el mundo y contar con una técnica de diagnóstico que sea altamente sensible es fundamental para Médicos Veterinarios, dueños y criadores de perros. En este trabajo se implementó un protocolo que utiliza la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional para detectar un fragmento del ADN de CPV-2 a partir de heces de perros con signología clínica correspondiente a parvovirosis canina. En total se recolectaron y analizaron 12 muestras de heces que resultaron positivas con la PCR convencional, lo que fue confirmado mediante la secuenciación de los fragmentos obtenidos y contrastados con las secuencias de las distintas variantes de CPV-2 descritas en la base de datos GenBank. Las mismas muestras fueron analizadas con una prueba rápida, que corresponde a una técnica de inmunocromatografía (IC) de uso rutinario en la consulta veterinaria. En este caso de las 12 muestras analizadas, sólo un 41,7% resultaron positivas, evidenciando una menor sensibilidad que la técnica molecular para el diagnóstico de parvovirus canino. Adicionalmente, se hizo un análisis de las secuencias nucleotídicas obtenidas arrojando una variabilidad promedio de 0,7%. Los resultados de este trabajo permiten establecer que la PCR convencional es una técnica de diagnóstico recomendable para la detección de parvovirus canino, no así las pruebas rápidas utilizadas en la consulta veterinaria que en este y otros estudios han mostrado constantemente su baja sensibilidad. Es importante destacar que el presente trabajo es la primera aproximación molecular al parvovirus canino tipo 2 en Chile / Infection with canine parvovirus type 2 (CPV-2) is one of the main causes of hemorrhagic enteritis in dogs worldwide and having a diagnostic technique that is highly sensitive is essential for veterinarians, dog owners and breeders. In this work, a protocol was implemented that uses the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) to detect a CPV-2 DNA fragment from feces of dogs with clinical signology corresponding to canine parvovirus. In total, 12 stool samples that were positive with conventional PCR were collected and analyzed, which was confirmed by sequencing the fragments obtained and contrasted with the sequences of the different variants of CPV-2 described in the GenBank database. The same samples were analyzed with a rapid test, which corresponds to a routine immunochromatography (IC) technique in the veterinary practice. In this case of the 12 samples analyzed, only 41.7% were positive, showing a lower sensitivity than the molecular technique for the diagnosis of canine parvovirus. Additionally, an analysis of the nucleotide sequences obtained was made, yielding an average variability of 0.7%. The results of this work allow to establish that conventional PCR is a recommended diagnostic technique for the detection of canine parvovirus, but not the rapid tests used in the veterinary practice that in this and other studies have consistently shown low sensitivity. It is important to note that the present work is the first molecular approach to canine parvovirus type 2 in Chile

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa la utilidad de la reacción en cadena de polimerasa para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en comparación con las pruebas de baciloscopía y el cultivo Bk. El estudio es observacional, descriptivo, retrospectivo transversal. Se realizó el estudio a 143 pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar de los años 2011 al 2013. Para el análisis de las variables cuantitativas se utilizó el promedio y la desviación estándar, y para el análisis de las variables cualitativas se utilizó los porcentajes, frecuencias absolutas y relativas. Los resultados obtenidos son datos de pacientes entre los 18 a 62 años de edad, donde el 64% son de sexo masculino, se ha encontrado una sensibilidad para micobacterium tuberculosis de 87,71%. Existe un 12.3% que a pesar de ser positivos, la baciloscopía no los identifica como tales, de los pacientes con diagnostico negativo de PCR, solo el 79.3% fueron confirmados como negativos mediante cultivo. La fiabilidad fue valorada a partir de la tabla ANOVA correspondiente, calculando el coeficiente de concordancia kappla Intraclase de Cohen, el resultado encontrado es de 0.608, el mismo que fue comparado con los márgenes propuestos por Landis, La frecuencia de infección por M. Tuberculosis en lavado bronquial con BK negativo es de 37.83% (14), El 70,75% es la cantidad de pacientes positivos a M. Tuberculosis según PCR confirmado con cultivo que presentan síntomas, La tos es el síntoma que se presenta con mayor frecuencia, encontrándose en el 61.84% de los pacientes, seguida del 36.84% de hemoptisis. Se concluye que al análisis inferencial de la prueba de hipótesis no paramétrica, de comparaciones proporcionales, entre los resultados de ambos medios de diagnóstico, se obtuvo una diferencia estadística altamente significativa, con lo que se prueba que el pcr es más eficaz que el cultivo. / Trabajo académico

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo de este estudio fue implementar una protocolo de diagnóstico para Bordetella spp a través de la detección del gen flaA, que codifica la proteína estructural flagelina, mediante la reacción en cadena de la polimerasa semianidada. Para esto se diseñaron 3 partidores in silico mediante el uso del programa OligoPerfect™, los cuales fueron posteriormente sintetizados por la empresa BIOSCAN. Utilizando como muestras tres cepas de Bordetella bronchiseptica, se obtuvieron los fragmentos de los tamaños esperados (362 pb y 170 pb) y, tras la secuenciación del fragmento de 362 pb, se determinó un porcentaje de identidad nucleotídica del 95% respecto al dato oficial registrado en GenBank, a través del programa Clustal Ω . Este valor fue corroborado al ingresar la misma secuencia al programa online BLAST, el cual también entregó un porcentaje de identidad nucleotídica del 95% respecto al gen de la proteína flagelina de Bordetella spp / The objective of this study was to implement a diagnostic protocol for Bordetella spp, by the chain reaction of the semi-nested polymerase, through the detection of the flaA gene, which encodes the structural protein flagellin. For this, 3 in silico primers were designed through the use of the OligoPerfect ™ program, which were later synthesized by the BIOSCAN company. Using three strains of Bordetella bronchiseptica as samples, fragments of the expected sizes were obtained (362 bp and 170 bp) and, after the sequencing of the larger amplicon, a percentage of 95% nucleotide identity was determined with respect to the official data registered in GenBank, through the Clustal Ω program. This value was corroborated when entering the same sequence to the BLAST online program, which also delivered a 95% nucleotide identity percentage with respect to the flagellin protein gene of Bordetella spp

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / Bergallia valdiviana Berg 188, perteneciente a la familia Cicadellidae, es uno de los insectos más comunes en los viñedos chilenos. En algunos individuos de B. valdiviana se ha detectado la presencia de un fitoplasma perteneciente al subgrupo ribosomal 16SrIII-J. Sin embargo, no hay informaciones acerca de su capacidad de trasmitir fitoplasmas. Durante octubre de 2012 a Junio de 2013, en un viñedo infectado con fitoplasmas ubicado en la localidad de Casablanca, Región de Valparaíso, se capturaron individuos adultos de B. valdiviana para realizar pruebas de transmisión en jaulas entomológicas utilizando plantas de vinca (Cantharanthus roseus L.) obtenidas desde semillas. Las capturas se realizaron utilizando una red entomológica. Dos de catorce pruebas resultaron exitosas en la transmisión del fitoplasma 16SrIII-J (relacionado con „Candidatus Phytoplasma pruni‟; X-disease group) a las plantas de vinca, las cuales presentaron fuertes amarilleces en hojas y desordenes en las flores. La detección e identificación del fitoplasma se realizó a través de PCR anidado, secuenciación y RFLP in silico. Los resultados del presente trabajo indican, por primera vez, que B. valdiviana es vector del fitoplasma 16SrIII-J. / Bergallia valdiviana Berg 1881, belonging to the family Cicadellidae, is one of the most common insects in Chilean vineyards. Several individuals of B. valdiviana have been previously reported to be carriers of a phytoplasma belonging to ribosomal subgroup 16SrIII-J. However, there is no information about its capacity to transmit this phytoplasma to plant hosts. From October 2012 to June 2013, a wide number of B. valdiviana adults were captured in phytoplasma infected vineyards located in the locality of Casablanca, in Valparaiso region, in order to perform transmission trials in entomological cages. Non infected periwinkles (Cantharanthus roseus L.) obtained from seeds were used as indicator plants. Catches were made using an entomological net. In 2 out of 14 trials was observed transmission of 16SrIII-J phytoplasma (related to 'Candidatus Phytoplasma pruni'; X-disease group) to periwinkle plants, which showed strong yellowing, disorders in leaves and flowers. Detection and identification of the phytoplasma was carried out by nested PCR, sequencing and in silico RFLP. The results of this study indicate for the first time, that B. valdiviana is vector of the phytoplasma 16SrIII-J.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / La enfermedad de Chagas (ECh), causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, representa un importante problema de salud pública en Latinoamérica y, debido a la globalización, en países donde no existe el vector biológico. Los criterios de curación para evaluar la eficacia terapéutica durante la etapa crónica, no han sido hasta ahora, establecidos. La PCR en Tiempo Real o PCR cuantitativa (qPCR) constituye una promisoria herramienta para monitorear la carga parasitaria en pacientes con ECh crónica, dado que éstos presentan parasitemias bajas y fluctuantes. En esta tesis, se estandarizó la reacción de qPCR mediante el sistema de detección TaqMan® para la cuantificación de T. cruzi, junto con el desarrollo de un sistema de control interno endógeno (CIE) basado en la detección del cromosoma 12 humano (X12), que permite descartar resultados falsos negativos relacionados con ausencia de ADN en las muestras evaluadas mediante qPCR debido a pérdidas durante el proceso de extracción o problemas con la reacción interna de qPCR. Se evaluó además, la condición parasitológica mediante qPCR en 44 pacientes con ECh crónica en condiciones pre y post-terapia con Nifurtimox (NFX) y se comparó con las técnicas de xenodiagnóstico (XD), PCR convencional de muestras de deyecciones de triatominos de XD (PCR-XD) y sangre venosa (PCR-S). La estandarización de la reacción de qPCR dirigida a la detección de T. cruzi tuvo como resultado una sensibilidad y especificidad del 92% y 100 %, respectivamente. Mientras que el sistema CIE basado en X12 permitió descartar resultados falsos negativos. En cuanto a la evaluación de eficacia quimioterapéutica de NFX mediante qPCR, fue posible determinar que el 86,36% del universo de individuos evaluados eliminó T. cruzi o persiste con parasitemias detectables de muy bajo nivel que no son cuantificables en el rango dinámico establecido (<1 parásito/mL). Estos resultados representan un hallazgo positivo, pues si bien la mayoría de las metodologías convencionales dan cuenta de la persistencia de T. cruzi, qPCR evidencia el real y actual nivel de parasitemia circulante, por lo que debería ser considerado el principal indicador de evaluación de eficacia quimioterapéutica en el tratamiento de la ECh crónica / Chagas disease (ChD), caused by the hemoflagellate protozoon Trypanosoma cruzi, is an important public health problem in Latin America, and due to globalization, also in countries where the biological vector does not exist. Cure criteria, to be able to evaluate the efficacy of therapy during the chronic stage, so far have not been established. Real time PCR or quantitative PCR (qPCR) is a promising tool to monitor the parasite load in patients with chronic ChD, given that these patients have low and fluctuating parasitemia. In this thesis it was standardized the qPCR reaction using the TaqMan® detection system for the quantification of T. cruzi, along with the development of an endogenous internal control (EIC) system based on the detection of human chromosome 12 (X12), which eliminates false negative results related to the absence of DNA in samples evaluated with qPCR due to losses during the extraction process or problems with the internal reaction of qPCR. Furthermore, the parasitological condition of 44 patients with chronic ChD was evaluated using this method in pre and post-therapy conditions with Nifurtimox (NFX), and compared to the techniques of xenodiagnosis (XD), conventional PCR of dejection samples of XD triatomines (PCR-XD) and venous blood (PCR-B). The standardization of the qPCR reaction directed to the detection of T. cruzi showed a sensitivity and specificity of 92% and 100%, respectively, while the EIC system based on X12 allowed discounting false negatives. In terms of the evaluation of the chemo-therapeutic efficacy of NFX, qPCR showed that 86.36% of the individuals evaluated eliminated T. cruzi or had detectable parasitemia of levels too low to be quantified in the dynamic range established (<1 parasite/mL). These results represent a positive finding, since although the majority of the conventional methods detect the persistence of T. cruzi, qPCR detects the real current level of circulating parasitemia; thus this method should be considered the principal indicator of the evaluation of the chemo-therapeutic efficacy in the treatment of chronic ChD / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1100768.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La contaminación de los cultivos celulares por Mycoplasma spp. dificulta tanto la investigación básica como el desarrollo y producción de productos biológicos. Los efectos de esta bacteria en las células cultivadas son cambios en el metabolismo, propiedades inmunológicas y bioquímicas, crecimiento, viabilidad, etc. La infección de cultivos celulares con Mycoplasma spp. puede no ser detectada por inspección visual o microscopía común, por lo tanto, es importante realizar evaluaciones periódicas de rutina con un método rápido, altamente sensible y específico. En consideración a lo anterior, esta memoria de título se basó en el diagnóstico molecular de Mycoplasma spp., mediante la detección del gen 16S rRNA utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional, en muestras procedentes de cultivos celulares de distintos laboratorios de la Universidad de Chile y del Instituto de Salud Pública de Chile. Los resultados obtenidos tanto en los controles positivos como en los controles negativos, permitieron validar este método en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias y al aplicarlo en muestras sospechosas, se logró la detección positiva en una muestra procedente del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile. Este hallazgo, fue confirmado por alineamiento de secuencias nucleotídicas respecto de datos oficiales del GenBank®, utilizando los programas Clustal W y BLAST, ambos de acceso gratuito on line que entregaron un 97% de porcentaje de identidad nucleotídica respecto de Mycoplasma spp

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad altamente prevalente, de distribución mundial y que presenta una variada pero alta morbilidad y mortalidad. El agente causal es el Virus Distemper Canino (VDC), el cual posee un amplio rango de hospederos donde es patogénico, entre ellos algunos primates, cetáceos y numerosas familias del orden de los carnívoros. Presenta un alto tropismo por tejido linfoide, neurológico y epitelial, conduciendo a una infección de casi todos los sistemas orgánicos, por lo que los signos clínicos observados son muy variados. El diagnóstico se realiza en base a la sospecha clínica, la que debe ser confirmada por un método diagnóstico de laboratorio, como la técnica molecular denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa previa Transcripción Reversa (RT-PCR), la cual ha sido utilizada además para caracterizar las cepas virales en base al análisis del gen H. Este análisis ha determinado la presencia de 14 linajes circulantes en el mundo, dos de los cuales se han descrito en Chile, correspondientes a los linajes América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. El objetivo de este trabajo fue implementar un protocolo de RT-PCR múltiple, diseñando partidores in silico en base a las secuencias nucleotídicas almacenadas en la base de datos Genbank®, el cual fuera capaz de detectar los dos linajes descritos en Chile de manera diferencial, con el fin de aportar una herramienta diagnóstica de apoyo para estudios epidemiológicos y en un futuro cercano conocer la prevalencia de estos linajes en el país. Los resultados obtenidos sugieren que los partidores diseñados para cada linaje son específicos. Además de indicar que el protocolo establecido fue exitoso, las muestras analizadas corresponderían en su totalidad al linaje América-1, permitiendo en un futuro, seguir analizando muestras positivas al VDC, para conocer la prevalencia real de ambos linajes en el país. / The Canine Distemper is a highly prevalent disease, of worldwide distribution and has a variable but high morbidity and mortality. The causative agent is the Canine Distemper Virus (CDV), which has a wide host range where it is pathogenic, among them some primates, cetaceans and numerous families of the order of carnivores. It presents a high tropism for lymphoid, neurological and epithelial tissue, leading to an infection of almost all organic systems, so the clinical signs observed are very varied. The diagnosis is made based on clinical suspicion, which must be confirmed by a laboratory diagnostic method, where the molecular technique called Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), which has also been used to characterize viral strains based on the analysis of the H gene, which has determined the presence of 14 circulating lineages in the world, two of them have been described in Chile, corresponding to the America-1 and Europe-1/South America-1 lineages. The objective of this work was to implement a multiple RT-PCR protocol, designing in silico primers based on the nucleotide sequences stored in the Genbank® database, which was capable of detecting the two lineages described in Chile in a differential way, to provide a support diagnostic tool for epidemiological studies and in near future to know the prevalence of these lineages in the country. The results obtained suggest that the primers designed for each lineage are selective against these. In addition to indicating that the established protocol was successful, observing that all the samples analyzed corresponded to the America-1 lineage, allowing in the future to keep analyzing positive samples to CDV, in order to know the prevalence of both lineages in Chile.

Publicación texto completo no autorizada por el autor / El documento digital no refiere asesor / Determina la utilidad del PCR en tiempo real en líquido pleural parael diagnóstico de tuberculosis pleural (TB Pl) se seleccionaron 404 casos de pacientes que presentaron efusión pleural en el servicio de Neumología del Hospital Arzobispo Loayza entre los años 2012 y 2013. Se elaboraron tablas de contingencia y se hallaron los valores de Sensibilidad (S), Especificidad (E), Valor predictivo Positivo (VPP) y Valor Predictivo Negativo (VPN). Para el estudio de significancia estadística se empleó Chi Cuadrado. De los 404 casos incluidos en el estudio 176 tuvieron diagnostico de TB Pl. Solo 66 casos tuvieron PCR positivo. Los hallazgos fueron S: 34.8%, E: 98.2%, VPP: 90.9% y VPN: 65.7%. El PCR en tiempo real es una prueba que debe ser tomada como parte de una batería de exámenes que aportan en su conjunto al diagnóstico de TB Pl pero no muestra ser útil como prueba rápida de tamizaje ni debe ser utilizada como prueba de rutina en nuestro hospital. / Trabajo de investigación

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La resistencia antimicrobiana es actualmente una problemática de salud pública, debido a que compromete la efectividad de los tratamientos realizados tanto en medicina humana como veterinaria. Este fenómeno tuvo un rápido surgimiento, casi tan pronto como la aparición de los primeros antimicrobianos y se ha diseminado globalmente debido a los mecanismos de transmisión de los determinantes genéticos de resistencia, que facilitan su propagación entre bacterias pertenecientes incluso a distintos géneros. En las últimas décadas, una de las mayores preocupaciones al respecto ha sido la utilización masiva de antimicrobianos en animales productores de alimentos para consumo humano, debido a que esta situación ejerce una presión de selección de microorganismos resistentes y acelera los procesos de mutación genética, así como la transmisión de genes de resistencia hacia la población humana. Este último proceso está favorecido en gran parte por elementos genéticos móviles, entre los que destacan los integrones, estructuras capaces de adquirir casetes génicos y transferirlos en bloque de una bacteria a otra. Dentro de ellos, las clases 1 y 2 son las que se han encontrado con mayor frecuencia en investigaciones realizadas en el ámbito de la producción animal. En este estudio se detectó la presencia de integrones clase 1 y clase 2 en cepas de Escherichia coli aisladas desde la microbiota intestinal de gallinas de postura tratadas previamente con antimicrobianos. La identificación de los integrones se hizo mediante la técnica de PCR convencional y dio como resultado la presencia de tres integrones, los que a su vez no presentaron asociación con la multi-resistencia de las cepas analizadas. Los resultados indican por tanto, que los integrones no se encuentran implicados en la transmisión de resistencia antimicrobiana en las bacterias estudiadas. Esta información difiere de la presentada en estudios similares, donde si bien la prevalencia de integrones clase 2 es variable, la clase 1 tiende a estar presente con prevalencias superiores al 40% y asociados a la transmisión de multi-resistencia, en ambos casos.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Entre los numerosos agentes causantes de enfermedad que los animales pueden transmitir al ser humano, está el Streptobacillus moniliformis, patógeno poco común que parece estar emergiendo en el último tiempo. Esta bacteria, que habita naturalmente en el tracto respiratorio anterior de las ratas, produce en el ser humano dos cuadros de signos y síntomas muy similares, conocidos como fiebre por mordedura de rata y fiebre de Haverhill según el modo de contagio. Además, este microorganismo puede infectar también a otros animales que viven o tienen contacto con ratas. El objetivo de este estudio es determinar la presencia o ausencia de Streptobacillus moniliformis en el tracto nasofaríngeo de ratas provenientes de un bioterio convencional. Para esto se seleccionaron 20 ejemplares adultos de la cepa Sprague- Dawley, sin distinción de sexo y clínicamente sanos. Para la extracción de la muestra clínica los animales fueron previamente sedados y se obtuvo secreción nasofaringea con una tórula fina de pequeño tamaño (torulín). Las muestras fueron sembradas en agar sangre anaerobio durante 72 hrs e incubadas a 36°C con 3% de CO2. Posterior a la siembra el contenido de la tórula se suspendió en tampón sacarosa fosfato que se almacenó a -20°C para utilizarse en el diagnóstico molecular mediante PCR. Para éste último se amplificaron 296 pb del gen 16S rRNA, empleando los partidores descritos por Boot et al., 2002. De las 20 muestras estudiadas, se detectaron 8 muestras positivas a la técnica de PCR y ninguna muestra fue positiva al cultivo microbiológico. Por análisis estadístico se obtuvo que la prevalencia de S. moniliformis en las ratas en estudio se encuentra entre 21.9% a 61.4%. Los resultados de este estudio, permiten concluir que las ratas utilizadas son portadoras de este microorganismo en porcentajes similares a los que se describen en la literatura. La técnica de PCR resultó ser más sensible en el hallazgo del patógeno en comparación con la baja sensibilidad que posee el aislamiento en cultivo para el diagnóstico de S. moniliformis a partir de muestras nasofaríngeas. Se discute la importancia de este primer diagnóstico positivo nacional de S. moniliformis en ratas de bioterio convencional y su relación con la salud humana