O hipercortisolismo ACTH-dependente (HAD), também chamado de doença de Cushing, é uma das endocrinopatias mais comumente diagnosticadas na espécie canina. A sintomatologia clínica ocorre, secundariamente, aos efeitos gliconeogênicos, catabólicos, antiinflamatórios e imunossupressores dos glicocorticóides sobre vários sistemas orgânicos. Há uma marcante predisposição da doença na raça poodle e casos familiais têm sido diagnosticados sugerindo uma causa genética. As alterações moleculares que levam ao desenvolvimento do HAD em cães permanecem indefinidas. Dentre os genes implicados no desenvolvimento dos corticotrofos e na regulação do eixo corticotrófico, destacam-se o Tbx19 e o Crhr1, respectivamente. O Tbx19 é um fator de transcrição obrigatório para a transcrição do gene da proopiomelanocortina (POMC) e para a diferenciação terminal dos corticotrofos. Como está presente, exclusivamente, em corticotrofos normais e adenomatosos, foi proposto seu envolvimento na secreção excessiva de ACTH na doença de Cushing. A presença de CRHR1 nos corticotrofinomas na espécie humana e canina levantou a hipótese da sua participação na tumorigênese hipofisária, promovendo uma estimulação celular prolongada, mesmo na ausência de hormônios hipotalâmicos. Um aumento da expressão do CRHR1 foi demonstrado nos tumores corticotróficos, apesar da secreção autônoma de ACTH e dos níveis portais suprimidos de CRH em pacientes humanos e caninos com doença de Cushing. Os objetivos do presente trabalho foram pesquisar a presença de mutações germinativas nas regiões codificadoras dos genes Tbx19 e Crhr1 em cães com HAD. Para tanto, estudamos 50 cães da raça poodle com hipercortisolismo ACTH-dependente (33 fêmeas e 17 machos), com idade média de 8,71 anos e 50 cães controle da mesma raça (32 fêmeas e 18 machos) com idade superior a 6 anos (média de 9,38 anos) e sem endocrinopatias. O DNA genômico foi extraído e amplificado através da reação de polimerização em cadeia (PCR), utilizando-se oligonucleotídeos (primers) específicos para os genes Tbx19 e Crhr1. Foi identificada uma nova variante alélica tanto no Tbx19 como no Crhr1, ambas não descritas na literatura. No gene Tbx19, a variante p. S343G foi encontrada em dois cães não aparentados, mas também em dois controles normais, sugerindo tratar-se de um novo polimorfismo. Já a variante p. V97M do Crhr1 foi encontrada, em heterozigose em um animal com HAD, porém não foi observada em cem alelos normais. O códon 97 está localizado no domínio extracelular aminoterminal do gene Crhr1, de extrema importância para a ligação com alta afinidade ao ligante. O estudo molecular da estrutura quartenária da proteína mutada, seguido da avaliação da energia de ligação da superfície de contato entre o hormônio e o receptor revelou um rearranjo estrutural com alteração da superfície de contato entre o CRH e o seu receptor CRHR1, resultando em uma energia de ligação 17% superior à do receptor selvagem. Em conclusão, esse estudo não identificou alterações no gene Tbx19 associadas ao hipercortisolismo ACTH-dependente canino, mas por outro lado, identificou pela primeira vez, uma mutação ativadora no Crhr1, provavelmente responsável pelo hipercortisolismo ACTH-dependente em um cão da raça poodle. / The ACTH-dependent hypercortisolism (ADH), also called Cushing\'s disease, is one of the most commonly diagnosed endocrine diseases in dogs. The symptoms occur due to glucocorticoids excess leading to gluconeogenic, catabolic, anti-inflammatory and immunosuppressive effects in multiple organs and systems. There is a high incidence of Cushing\'s disease in Poodles and familial disease has been identified suggesting a genetic involvement. The molecular changes that lead to the development of ACTH-dependent hypercortisolism in dogs remain undefined. Among genes implicated in corticotroph development and in corticotropic axis regulation, we would like to point out Tbx19 and Crhr1, respectively. Tbx19 gene is a transcription factor required for transcription of the proopiomelanocortin gene and for terminal differentiation of the corticotroph. Inactivating mutations in that gene are associated with human isolated ACTH deficiency. Since Tbx19 is present exclusively in normal and adenomatous corticotroph cells, its involvement in the secretion of ACTH in Cushing\'s disease was proposed. The presence of CRHR1 in corticotrophinomas in humans and dogs raised the possibility of its involvement in pituitary tumorigenesis, promoting prolonged cell stimulation, even in the absence of hypothalamic hormones. An increased expression of the CRHR1 mRNA was demonstrated in human and canine ACTH-secreting pituitary adenomas, despite the autonomous ACTH secretion and the low portal levels of CRH. The aim of this study was to investigate Tbx19 and Crhr1 coding region mutations in Poodle dogs with ACTH-dependent hypercortisolism. We studied 50 Poodle dogs with ADH (33 females and 17 males) with a mean age of 8.71 years and 50 control dogs of the same breed (32 females and 18 males) older than 6 years (mean 9.38 years) and without endocrinopathies. Genomic DNA was extracted from peripheral blood, amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using specific intronic primers and submitted to automatic sequence. We identified a new allelic variant in the Tbx19 and Crhr1 coding regions. The allelic variant p. S343G in the Tbx19 gene was found in two unrelated dogs, but also in two normal controls, suggesting that this is a new polymorphism. The Crhr1 allelic variant p. V97M was found in heterozygosity in one animal with ACTH-dependent hypercortisolism, but was not observed in one hundred normal alleles. The codon 97 is located in the extracellular amino terminal domain of the Crhr1 and is extremely important for high affinity ligand binding. The molecular analysis of the quaternary structure of normal and mutated proteins, followed by evaluation of the binding energy of the contact surface between the hormone and the receptor showed a structural rearrangement of the mutated protein by changing the contact surface between the CRH and its receptor CRHR1, resulting in a binding energy 17% higher than the wild type. In conclusion, this study did not identify Tbx19 mutations associated with canine ACTH-dependent hypercortisolism, but on the other hand, we first identified a Crhr1 gain-of-function mutation probably responsible for ACTH-dependent hypercortisolism in a Poodle dog of our cohort.

O objetivo deste estudo foi determinar se a variação genética no gene do receptor P2X7 está associada com a diminuição da densidade mineral óssea e o risco de osteoporose em pacientes acima de 50 anos de idade com fratura de tornozelo. Foi realizado um estudo diagnóstico Nível I. Os pacientes acima de 50 anos com fratura de tornozelo submetidos ao tratamento cirúrgico foram divididos em dois grupos após o resultado da densitometria óssea: o grupo de estudo com osteopenia (T score entre -1 e -2,5) ou osteoporose (T score <= -2,5) e o grupo controle com valores de normalidade (com T score >= -1). Os critérios de exclusão foram alterações que levam à osteoporose secundária. Os pacientes foram genotipados para 15 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) não sinônimos dentro do receptor P2X7 (numerados de 1 à 15) obtidos a partir da saliva. Avaliamos 121 pacientes com fratura de tornozelo, sendo 56 do grupo controle e 65 do grupo de estudo. Todos os pacientes eram sedentários, não utilizavam nenhum medicamento para tratamento de osteoporose, não eram tabagistas e sofreram trauma de baixa energia. A análise agrupada das alterações dos SNPs demonstrou que se o gene tem 3 ou mais variantes de SNPs (36,4% dos 121 pacientes), dos 15 possíveis, ele está alterado com repercussão clínica relacionada à perda ou ganho de função do gene. E ao analisar as alterações dos SNPs, individualmente, os resultados sugerem que: os SNPs 1,4,14 e 15 são variantes de perda de função; SNPs 5 e 10 são descritos como variantes de perda de função; entretanto, não têm influência na nossa população; SNPs 11 e 13 são variantes de perda de função e não ganho de função, como descrito na literatura; e SNP 12 foi associado à perda de função em nossa população. Podemos ressaltar como limitações do nosso estudo o fato de nos concentramos principalmente em polimorfismos não sinônimos que não cobrem toda a variação genética em P2X7 e no número pequeno de participantes quando comparados com a literatura mundial. Em contrapartida, um dos pontos fortes do nosso estudo é ser o primeiro a avaliar o P2X7 na população brasileira, que é bastante heterogênea do ponto de vista genético devido à nossa miscigenação, quando comparado com os outros estudos que avaliaram a população do norte da Europa, que é mais homogênea geneticamente. Em conclusão, o polimorfismo do SNP 12 em P2X7 está associado à densidade mineral óssea e risco de fraturas de tornozelo / The purpose of this study was to determine whether a genetic variation in the P2X7 receptor gene is associated with reduced bone mineral density and the risk of osteoporosis in patients over 50 years of age with ankle fractures. A Level-1 diagnostic study was conducted. Patients over 50 years of age with ankle fractures who had undergone surgical treatment were divided into two groups following the result of a bone densitometry: a study group with osteopenia (bone mineral density T score between -1 and -2.5) or osteoporosis (bone mineral density T score <= -2.5) and the control group with normal values (bone mineral density T score >= -1). Exclusion criteria were alterations that led to secondary osteoporosis. Patients were genotyped for 15 nonsynonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the P2X7 receptor (numbered from 1 to 15) obtained from saliva. We evaluated 121 patients with ankle fractures, 56 being from the control group, and 65 from the study group. All patients were sedentary, did not take any medication for the treatment of osteoporosis, did not smoke, and had suffered a low-impact trauma. The grouped assessment of the SNP alterations showed that if a gene has three or more SNP variants (36.4% of the 121 patients), out of the 15 possibilities, it is altered with clinical repercussions related to the loss or gain of the function of the gene. In evaluating the SNP alterations individually, the results suggest that: SNPs 1,4,14, and 15 are loss of function variants; SNPs 5 and 10 are described as loss of function variants; however, they have no influence on our study population; SNPs 11 and 13 are loss of function variants and not gain of function function as is described in the literature; and SNP 12 was associated with a loss of function in our population. In conclusion, we showed that the functional polymorphisms in P2X7 are associated with Bone Mineral Density and the risk of ankle fractures. As limitations to our study, we can point out the fact that we focused mainly on nonsynonymous polymorphisms, which do not cover all the genetic variations in P2X7, and the small number of participants when compared to the world literature. On the other hand, a strength of our study is that it was the first to assess P2X7 in the Brazilian population, which is quite heterogeneous from the genetic point of view due to our miscegenation, as compared to other studies that evaluated the population of northern Europe, which is genetically more homogeneous. In conclusion, the SNP12 polymorphism in P2X7 is associated with Bone Mineral Density and the risk of ankle fractures

Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulina-símile 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. Na vida pós-natal o GH, principal hormônio promotor de crescimento, exerce a maior parte de seus efeitos por meio do IGF-1. A grande maioria das ações conhecidas do IGF-1 e IGF-2 são mediadas via receptor tirosina quinase conhecido como receptor tipo 1 de IGFs (IGF-1R). Os objetivos deste trabalho foram estudar os genes IGF1 e IGF1R em crianças nascidas pequenas para a idade gestacional que não recuperaram o crescimento na vida pós-natal. Foram selecionados 145 pacientes nascidos PIG, 72 sem catch up e 73 com catch up. Em 54 PIG sem catch up foi estudado toda a seqüência codificadora do gene IGF1 por meio de PCR e seqüenciamento direto, nos demais PIG sem catch up e nos 73 PIG com catch up foi estudado apenas o exon 6 do IGF-1 por PCR e seqüenciamento direto para avaliação de um polimorfismo encontrado nesta região. Nos pacientes que apresentavam concentração sérica de IGF-1 e IGFBP-3 acima da média para idade e sexo e seqüência do IGF1 normal (n=23) foi realizada coleta de sangue periférico com posterior separação de leucócitos mononucleares pelo gradiente de ficoll seguido por extração de RNA pelo método de Trizol® Posteriormente, a partir do RNA, sintetizamos o cDNA (DNA complementar) utilizando primers randômicos. Foi realizado PCR e seqüenciamento direto do cDNA, além de análise da expressão do IGF1R por PCR em tempo real. Nenhuma mutação foi encontrada no gene IGF1. Entretanto um locus altamente polimórfico foi encontrada na região 3\' não traduzida do exon 6 deste gene, região esta envolvida no processo de poliadenilação. A freqüência das variantes alélicas foi semelhante em PIG com e sem catch-up e em controles nascidos AIG. Analisando o fenótipo de pacientes PIG que apresentavam a variante alélica wild type ou uma das três variantes alélicas mais freqüentemente encontradas, não observamos diferenças significativas entre peso e comprimento ao nascimento, níveis de IGF-1 e crescimento na vida pós-natal. No gene IGF1R encontramos duas variantes alélicas nunca descritas previamente. A primeira variante encontrada está localizada no exon 1, em uma região de peptídeo sinal do pro IGF-1R e consiste na troca do nucleotídeo guanina pelo nucleotídeo adenina na posição 16 da região codificadora (c.16G>A), levando a troca do aminoácido glicina por arginina na posição 6 da proteína (p.G6R). A outra mutação encontrada está localizada no exon 7 onde observamos uma troca do nucleotídeo citosina por timina na posição 1531 do cDNA (c.1531 C>T), levando a uma troca de arginina por triptofano na posição 511 do IGF1R (p.R511W). Adicionalmente, foi observada uma expressão do IGF1R diminuída em 5 pacientes estudados.Concluímos que as variantes alélicas encontradas na região de poliadenilação do IGF1 não influenciam significativamente as características ao nascimento e pós-natais de crianças nascidas PIG ou a altura adulta de indivíduos normais nascidos AIG. O estudo do IGF1R identificou duas novas variantes alélicas em heterozigose no gene IGF1R e, em cinco pacientes, observamos uma expressão reduzida deste gene. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares. / Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of remaining short in adulthood. The insulin-like growth factors 1 and 2 (IGF-1 and IGF-2) are the main factors determining endocrine fetal growth. GH is the main promoter of linear growth in the postnatal life, exerting its effects mostly through the IGF-1. The vast majority of known actions of IGF-1 and IGF-2 are mediated by the insulin-like growth factor type 1 receptor (IGF-1R), a member of the tyrosine kinase receptors family. The aim of this study was to investigate IGF1 and IGF1R genes mutations in children born small for gestational age without catch up growth in postnatal life. We selected 145 patients born SGA, 72 without catch-up and 73 with catch up. The whole coding region of the IGF1 gene was sequenced in 54 patients without catchup. In the other SGA children without catch-up and in 73 SGA with catch-up, only the exon 6 of IGF1 was sequenced to assess the influence of allelic variants present in this region. In patients with normal IGF1 sequence and IGF-1 and IGFBP-3 serum levels above the mean for age and sex (n = 23) total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes followed by cDNA synthesis with random primers. The IGF1R cDNA was amplified using specific primers followed by direct sequencing. IGF1R expression was analyzed by real-time PCR. No mutations were found in the IGF1 gene. However a highly polymorphic sequence was identified in the upstream core polyadenylation signal (UCPAS) located in IGF1 3\' UTR at exon 6. The frequency of the identified allelic variants was similar in SGA children with and without catch-up and in controls. Furthermore, children homozygous for the wild-type allele and those carrying the allelic variants in homozygous or heterozygous state presented similar weight and length at birth, as well as serum IGF-1 levels and postnatal growth features. Two novel nonconservative allelic variants were identified in IGF1R in 23 SGA children (8.7%) in the heterozygous state. The first variant (c.16G>A) was located in the exon one, leading to a substitution of glicine by arginine in the pro-IGF-1R signaling peptide (p.G6R). The second variant was located in exon 7 (c.1531 C>T), leading to a substitution of arginine by tryptophan in the amino acid 511 of the IGF1-R (p.R511W). Moreover, a decreased IGF1R expression was observed in 5 of the 23 patients with elevated serum IGF-1 concentrations. We conclude that the UCPAS allelic variants did not significantly influence the birth and postnatal characteristics of children born SGA, neither the adult height of normal individuals born adequate for gestational age. The IGF1R study identified two novel allelic variants in two patients and a reduced expression of the IGF1R was observed in five patients. Patients with alterations in IGF1R did not have a distinctive phenotype when compared with other children born SGA without changes in this gene, indicating the importance of molecular studies.

A osteonecrose dos maxilares associada aos bisfosfonatos (OMAB) é reconhecidamente uma complicação tardia dos bisfosfonatos, que são empregados para tratar desordens esqueléticas marcadas pela perda de massa óssea. Hoje, o reconhecimento da variante clínica sem exposição óssea e de outras classes de drogas associadas à osteonecrose dos maxilares (inibidores de RANK-L, VEGF, m- TOR e TNF-a) integram um novo aspecto do conceito dessa entidade patológica. Vários fatores de risco para o desenvolvimento de OMAB foram identificados, incluindo procedimentos odontológicos invasivos, má higiene oral, o uso de bisfosfonatos (particularmente, os bisfosfonatos nitrogenados como o pamidronato e o zoledronato), infusões frequentes e tempo prolongado de exposição aos bisfosfonatos. A saúde bucal é um fator significativo que afeta o risco de OMAB e, juntamente com a predisposição genética, pode explicar algumas das diferenças de incidência encontrada na literatura. Fatores genéticos parecem influenciar o risco de desenvolvimento da OMAB. Os polimorfismos de nucleotídeo único dos genes CYP2C8 e RBMS3 foram significativamente associados com um risco mais elevado. Enquanto o gene CYP2C8 está envolvido na inibição dos osteoclastos, diferenciação dos osteoblastos e regulação do tônus vascular, RBMS3 é um gene envolvido no metabolismo ósseo e foi associado à massa óssea reduzida e a fraturas osteoporóticas. Contudo, houve limitações metodológicas nesses estudos, dos quais apenas um abordou a diferença da frequência de polimorfismos associados à OMAB em grupos étnicos distintos. Até o momento faltam estudos genéticos sobre polimorfismos associados com OMAB que tenham sido replicados e validados com evidências convincentes, particularmente, envolvendo populações não caucasianas. Ainda hoje permanece um grande desafio: estratificar o risco para desenvolvimento da OMAB no contexto clínico. Assim, o objetivo do presente estudo é investigar a associação de fatores clínicos (saúde bucal) e genéticos com a ocorrência da OMAB. Realizou-se um estudo transversal com pacientes oncológicos expostos ao zoledronato e/ou pamidronato por pelo menos 7 meses, com ou sem OMAB. Submeteram-se os participantes à avaliação odontológica. Avaliou-se a condição de cárie dentária e doença periodontal através do índice de dentes cariados perdidos e obturados (CPOD) e índice periodontal comunitário. O índice gengival e o índice de higiene oral simplificado (IHOS) também constaram nessa avaliação. Para a discriminação dos genótipos dos genes CYP2C8 e RBMS3, 2 ml de saliva foram coletados e processados para a técnica de PCR quantitativa. A amostra consistiu de 80 pacientes (69 mulheres e 11 homens). O índice geral de OMAB foi 11,2% (câncer de mama: 11,3%; câncer de próstata: 22,2%). Houve forte correlação positiva entre o estadiamento clínico da OMAB e CPOD (rho=0.9189, p=0.001). Inflamação gengival moderada e cálculo dentário alcançaram, respectivamente, 72% e 50% dos indivíduos com OMAB. Bolsa periodontal de 4 mm ou mais envolveu 37,5% desse grupo. IHOS revelou aproximadamente 25% dos indivíduos desse grupo com higiene oral regular. O polimorfismo do gene CYP2C8 estava presente em 50% dos pacientes com OMAB, enquanto 12% apresentou mutação para o gene RBMS3. Em conclusão, a saúde bucal da população oncológica foi bastante precária e o polimorfismo do gene CYP2C8 pareceu se associar à OMAB em população oncológica. / Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) is recognized as a late complication of bisphosphonates, which are used to treat skeletal disorders characterized by loss of bone mass. The recognition of clinical variation without bone exposure and other classes of drugs associated with osteonecrosis of the jaws (RANK-L, VEGF, m-TOR and TNF-inhibitors) are part of a new aspect of the pathological concept. Several risk factors for the development of BRONJ have been identified, including invasive dental procedures, poor oral hygiene, use of bisphosphonate (particularly, nitrogen-containing bisphosphonate such as pamidronate and zoledronate), frequent infusions and prolonged exposure to bisphosphonate. Oral health is a significant factor that affects the risk of BRONJ and, along with a genetic predisposition, it might explain epidemiological differences found in literature. Genetic factors seem to impact the risk of developing BRONJ. Single nucleotide polymorphisms of the CYP2C8 and RBMS3 genes were significantly associated with a higher risk. While the CYP2C8 gene is involved in osteoclast inhibition, osteoblast differentiation and regulation of vascular tone, RBMS3 is a gene involved in bone metabolism and has been associated with reduced bone mass and osteoporotic fractures. However, methodological limitations are present in these studies, of which only one addressed the difference in the frequency of polymorphisms associated with BRONJ in different ethnic groups. So far genetic studies have been lacking on polymorphisms associated with BRONJ that have been replicated and validated with convincing evidence, particularly involving non- Caucasian populations. In clinical context, a great challenge remains: classify patients in high risk for the development of BRONJ. Thus, the present study aims to investigate an association of clinical (oral health) and genetic factors with the occurrence of BRONJ. A cross-sectional study was performed with oncologic patients exposed to zoledronate and/or pamidronate for at least 7 months, with or without BRONJ. Participants were submitted to dental evaluation. Dental caries and periodontal disease were evaluated through the index of missing and filled teeth (DMFT) and community periodontal index. The gingival index and the simplified oral hygiene index (SOHI) were also included in this evaluation. For the discrimination of genotypes of the CYP2C8 and RBMS3 genes, 2 ml of saliva were collected and processed for the quantitative PCR technique. The sample consisted of 80 patients (69 women and 11 men). The overall BRONJ index was 11.2% (breast cancer: 11.3%, prostate cancer 22.2%). There was a strong positive correlation between the clinical staging of BRONJ and DMFT (rho=0.9189, p=0.001). Moderate gingival inflammation and dental calculus comprised, respectively, 72% and 50% of individuals with OMAB. Periodontal pocket of 4 mm or more involved 37.5% of this group. SOHI revealed approximately 25% of individuals in this group with regular oral hygiene. The polymorphism of the CYP2C8 gene was present in 50% of patients with BRONJ, while 12% had a mutation for the RBMS3 gene. In conclusion, the oral health of the cancer population was very precarious and CYP2C8 gene polymorphism is apparently associated with BRONJ in cancer population.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:34Z : No. of bitstreams: 1 Publico-018.pdf: 1910669 bytes, checksum: a40b61267560276f1db47642341c6e56 (MD5) / Introdução: Polimorfismos genéticos estão associados com um aumento do risco de tromboembolismo venoso (TEV) e outras doenças cardiovasculares. Estudos prévios sugerem que a doença venooclusiva hepática (DVOH), que se desenvolve intra transplante de medula óssea pode ser atribuída à polimorfismos gênicos. Objetivos: Avaliar a correlação entre polimorfismos genéticos e o risco de doença venooclusiva hepática no transplante de medula óssea e a associação com a presença de variáveis como o uso de vancomicina, drogas citotóxicas usadas no regime de condicionamento, presença de disfução hepática anterior ao transplante, presença de infecção por citomegalovírus, e grupos de doenças avaliáveis. Pacientes e métodos: Este estudo caracteriza-se por um estudo clinico observacional multicêntrico. Foram avaliados 120 pacientes, submetidos a transplante alogênico de medula óssea. Cada paciente foi avaliado propectivamente para DVOH, confirmado pelo critério de Seattle modificado, idade variando de 2 a 65 anos. Fatores de risco para DVOH severo foram analisados usando modelos estatisticos de avaliação. Detectamos simultaneamente através de PCR seguido de digestão e detecção através de eletroforese em gel de agarose, mutação do HFE C282Y, H63D, S65C; MTHFR C677T; Fator V de Leiden, Protrombina 20210A e glutationa S-tranferase. Resultados: Neste estudo observacional de pessoas, submetidas a transplante de medula óssea alogênico, a presença de disfução hepática pré transplante foi um fator de risco significante para DVOH. Nós tambem observamos uma associação entre a presença de mutação HFE S65C e disfunção hepática. Conclusões: Em resumo, nossos dados sugerem que disfunção hepatica observada pré transplante de medula óssea é um fator de risco estatisticamente significante para DVOH e que a presença da mutação do HFE S65C apresenta uma tendência ao desenvolvimento de dano hepático. Contudo, não evidenciamos associação dos polimorfismos estudados com DVOH. / TEDE

Made available in DSpace on 2016-05-19T12:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) 2016barbosa-junior-wl.pdf: 2215174 bytes, checksum: ec8edd1a6fc480050cdd6db05c9631f6 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Introdução: Considerando a prevalência, a importância social dos tratamentos de alta complexidade de mulheres inférteis e o contexto atual da literatura que atribui relevância aos polimorfismos dos genes reguladores do desenvolvimento inicial e crescimento folicular, entre eles o FSHR, LH, LHR, AMH, AMHR, BMP15 e GDF9; torna-se imprescindível o melhor conhecimento e a quantificação desses fatores. Com isso poderemos individualizar e abordar de forma mais racional a investigação e o tratamento destas mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Objetivos: Avaliar se os polimorfismos dos genes do LH (Trp8Arg e Ile15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 (673C/T, 9C/G, IVSI+905A/G), GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>T e 646G>A), e dos receptores do FSH (Ser680Asn), do LH (18isnILQ) e do AMH (Ile49Ser), estão relacionados a diferentes desfechos reprodutivos em pacientes submetidas à fertilização in vitro. Métodos: Realizamos dois estudos em mulheres submetidas à indução ovulatória para FIV: (1) um estudo caso-controle entre pacientes normo respondedoras e má respondedoras, (2) um estudo transversal em pacientes jovens submetidas à indução ovulatória para fertilização in vitro (FIV). Foi extraído DNA das pacientes submetidas à indução ovulatória para FIV a partir do sangue periférico para realização de polymerase chain reaction, com o objetivo de detectar os polimorfismos dos referidos genes e as respectivas relações com os resultados obtidos na estimulação ovariana, no Laboratório de Terapia Gênica do HCPA/UFRGS. Resultados: Foi evidenciado que a presença do polimorfismo 398C>G no gene GDF9 está associada à má resposta em pacientes inférteis submetidas à estimulação ovariana para fertilização in vitro (68% em má respondedoras versus 23% normo respondedoras, OR: 4.01, 95% IC:1.52-10.60). Além disso, o genótipo mutante para o polimorfismo G447C>T no gene do GDF9 foi encontrado em 50% nas pacientes má respondedoras versus 19% nas pacientes normo respondedoras (OR: 2.88, 95% IC:1.19-6.04), evidenciando uma forte associação destes polimorfismos com a má resposta ovariana à estimulação. Encontramos, também, que as mulheres portadoras do alelo mutante do gene 447C>T do GDF9 tiveram um número menor de folículos entre 12-14 mm no dia do hCG (1,62 versus 2,46, P = 0,007). As mulheres com o alelo mutante do gene do GDF9 398C>G tiveram um menor número de folículos maiores que 17 mm no dia do hCG (4,33 versus 6,49, P = 0,001), menor número de folículos entre 12 e 14 milímetros no dia do hCG (1,42 versus 2,25, P= 0,017), um menor número de folículos no dia do hCG (7,33 versus 10,11 versus, P = 0,007), e redução total de oócitos MII coletados (5,38 versus 8,84 P = 0,017). Conclusão: Concluímos que polimorfismos no gene do GDF9 têm uma influência significativa no desenvolvimento do oócito, uma vez que a presença dos alelos mutantes 447C>T e 398C>G diminui o número total de folículos maduros e o número total de oócitos coletados de tais pacientes, além deste último estar associado à má resposta ovariana em pacientes submetidas à indução da ovulação para fertilização in vitro. Isso mostra que este membro da família TGFβ além de atuar nas fases iniciais da foliculogênese também tem influência importante sobre a fase final do desenvolvimento do oócito. / Introduction: Given the prevalence, the social importance of high complexity treatments of infertile women and the current context of the literature assigns relevance to polymorphisms of genes regulating early follicle growth and development, including LH, AMH, BMP15, GDF9, FSHR, LHR and AMHR; become essential to better understanding and quantification of these factors. With this we can individualize and address more rationally research and treatment of these women undergoing IVF. Objectives: Evaluate the relationship of polymorphisms of LH (Trp8Arg andIle15Thr), AMH (Ile49Ser), BMP15 ( 673C/T, 9C/ G, IVSI+905A/ G) and GDF9 (546G>A, 398C>G, 447C>Tand646G>A) genes, and FSH (Ser680Asn), LH (18isnILQ) and AMH (Ile49Ser) receptors genes, related to different reproductive outcomes in patients undergoing IVF. Methods: Our study consisted of two phases: the first conducted a case-control study among patients with normal responders and poor responders, and the second a cross-sectional study in young patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. DNA was extracted from peripheral blood for performing polymerase chain reaction (PCR) and analyzed at the Laboratory of Gene Therapy HCPA/UFRGS, with the objective of detecting polymorphisms of these genes and their relationships to the results obtained in ovarian stimulation. Results: It was shown that the presence of polymorphism 398C>G in GDF9 gene is associated with poor response in infertile patients undergoing controlled ovarian stimulation for in vitro fertilization (68% in poor responders versus 23% in normal responders). Furthermore, the genotype GDF9 447C>T mutant polymorphism was found in 50% and 19%, respectively, in poor and normal responders patients, showing a strong association with this polymorphism and a poor response in ovarian stimulation. Women carrying the GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles between 12-14 mm on the day of r-hCG (1.62 vs. 2.46, respectively P=0.007). Women with GDF9 398C>G mutant allele had a smaller number of follicles larger than 17 mm on the r-hCG day (4.33 vs. 6.49, P=0.001), a smaller number of follicles between 12 and 14mm on the r-hCG day (1.42 vs. 2.25, P=0.017), a smaller number of follicles on the r-hCG day (7.33 vs. 10.11, P=0,007), and a reduced overall number of MII oocytes collected (5.38 vs. 8.84 ,P=0.017). Conclusion: We conclude that GDF9 polymorphisms in the gene have a significant influence on the development of the oocytes, since the presence of the mutant alleles 447C>T and 398C>G decreases the total number of mature follicles, total number of oocytes collected, and are associated a poor ovarian response in patients undergoing ovulation induction for in vitro fertilization. This shows that this member of the TGFβ family besides acting in the early stages of folliculogenesis also has important influence on the final stage of oocytes development.

O sistema renina-angiotensina e o estresse oxidativo têm participação importante na fisiopatologia das complicações crônicas do diabetes. No presente estudo, foram avaliados 103 pacientes com diabetes tipo 1 (DM1) com idade de 28,810,6 anos e duração de doença de 13,18,5 anos e 158 controles não diabéticos quanto à presença dos polimorfismos I/D da ECA e C242T do p22phox, componente essencial para a ativação da NADPH oxidase. Esta análise foi realizada por reação de polimerase em cadeia para ambos os polimorfismos, seguida de restrição enzimática para avaliação do polimorfismo C242T p22phox. Ambas as distribuições genotípicas obedeciam ao princípio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os pacientes diabéticos foram submetidos a avaliação clínica e laboratorial quanto à presença de fatores associados ao risco de complicações (história de tabagismo e antecedentes familiares de diabetes tipo 2, dose diária de insulina, níveis pressóricos, índice de massa corporal, relação cintura-quadril, excreção urinária de albumina, taxa de filtração glomerular, perfil lipídico, controle glicêmico, níveis de proteína C-reativa) e rastreados quanto à presença de nefropatia diabética, considerada presença de micro ou macroalbuminúria; retinopatia diabética não proliferativa ou proliferativa e hipertensão arterial. Não houve diferença significativa entre a presença dos alelos D e I da ECA ou C e T do p22phox entre diabéticos e controles. Os polimorfismos avaliados não apresentaram associação com a presença de nefropatia, retinopatia ou hipertensão arterial. Pacientes portadores do alelo D apresentaram maiores níveis de pressão arterial diastólica (72,2 12,3 vs 65,4 11,6 mmHg , p=0,047) e proteína C-reativa comparados aos portadores do genótipo II [0,18 (0,04-0,38) vs 0,09 (0,04-0,16) mg/dl, p=0,05] , porém ambas as análises perderam significância estatística após correção para duração do diabetes. A combinação dos polimorfismos não esteve associada à presença de complicações microvasculares ou hipertensão arterial. Concluímos que, na população de diabéticos tipo 1 estudada, a frequência dos polimorfismos I/D da ECA e C242T do p22phox , isoladamente ou em combinação, não apresentou diferença em pacientes com ou sem complicações microvasculares precoces ou hipertensão arterial. Os níveis dos diferentes marcadores de risco cardiovascular também não apresentaram diferença nos pacientes com os polimorfismos acima descritos. Entretanto, estudos prospectivos poderão determinar a possível interação entre estes polimorfismos e a duração do diabetes na expressão clínica das complicações crônicas da doença. / The renin-angiotensin system and the oxidative stress play an important role in the pathogenesis of the diabetic complications.In the present study 103 patients with type 1 diabetes (T1DM) aged 28.8 10.6 years and with a disease duration of 13.1 8.5 years and 158 non-diabetic controls were evaluated for the presence of the I / D polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) and the C242T polymorphism of the p22phox, an essential component for NADPH oxidase activation. The analysis was performed using polymerase chain reaction for both polymorphisms, followed by enzymatic restriction for C242T p22phox polymorphism. Genotypic distributions of both polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium. Diabetic patients underwent clinical and laboratory evaluation for the presence of risk factors associated with complications of diabetes (smoking and family history of type 2 diabetes, daily insulin dose, blood pressure, body mass index, waist hip ratio, urinary albumin excretion, glomerular filtration rate, lipid profile, glycemic control, C-reactive protein levels) and screened for the presence of diabetic nephropathy, considered as the presence of micro or macroalbuminuria, diabetic retinopathy and hypertension. There was no significant difference between the presence of ACE D or I allele and p22phox C or T allele between diabetic patients and controls. The evaluated polymorphisms were not associated with the presence of nephropathy, retinopathy or hypertension. Patients with the D allele showed higher levels of diastolic blood pressure (72.2 12.3 vs 65.4 11.6 mmHg, p = 0.047) and C-reactive protein compared with those carrying the II genotype [0.18 (0.04-0.38) vs 0.09 (0.04-0.16) mg/dl, p = 0.05], but both analysis lost statistical significance after correction for duration of diabetes. The combination of both polymorphisms was not associated with microvascular complications or hypertension. We conclude that in the studied population of type 1 diabetic patients, the frequency of ACE I / D and C242T of p22phox polymorphisms, alone or in combination, was not different in patients with or without early microvascular complications or hypertension. Also, the levels of different markers of cardiovascular risk did not differ for patients with the polymorphisms described above. However, prospective studies may determine the possible interaction between these polymorphisms and duration of diabetes in the clinical expression of chronic complications of diabetes.

A incidência do câncer de cabeça e pescoço (CCP) vem crescendo substancialmente nos últimos anos, inclusive no Brasil. Esse aumento está em parte relacionado com o consumo de álcool e tabaco, mas a susceptibilidade genética individual também deve ser considerada. O objetivo desse trabalho foi avaliar a freqüência de polimorfismos em genes que codificam as enzimas de metabolização do álcool em pacientes com câncer de cabeça e pescoço do Hospital Heliópolis da cidade de São Paulo, comparados com um grupo de pacientes do mesmo hospital, sem diagnóstico de câncer. Foram investigados polimorfismos genéticos das enzimas álcool desidrogenase (ADH1B Arg48His, ADH1B Arg370Cys, ADH1C Ile350Val) e do citocromo P450 (CYP2E1 PstI), pela técnica PCR-RFLP, em 451 indivíduos, sendo 207 pacientes com CCP (confirmados histopatologicamente, 184 homens e 23 mulheres, idade média 54,3 ± 7,8 anos) e 244 controles (225 homens e 19 mulheres, idade média 53,6 ± 9,3 anos). O hábito de fumar foi relatado por 80% dos pacientes com CCP e 50% dos controles o que aumentou mais de dez vezes o risco de câncer (OR=11,1; 95% IC; 4,89-25,19). Apenas 7% dos pacientes com CCP relataram nunca haver consumido álcool em comparação com 22,5% dos controles hábito que aumentou mais de quatro vezes o risco de CCP (OR=4,39 95% IC; 2,35-8,22). Verificou-se que o consumo diário acima de 30,655g/L/dia de álcool (72,5% dos pacientes com CCP e 35,2% dos controles) estava associado ao maior risco de CCP (Curva de ROC). A análise dos polimorfismos genéticos revelou que o genótipo mutado ADH1B Arg48His em homozigose ou heterozigose foi mais freqüente nos controles (12,7%) do que nos pacientes com CCP (5,8%) conferindo proteção à doença (OR=0,42; 95% IC; 0,21-0,85). Resultados similares foram observados para os indivíduos com os haplótipos ADH1B*2 (OR=0,41; 95% IC; 0,20-0,82) ou ADH1B*2/ADH1C*1 (OR=0,32; 95% IC; 0,13-0,79). Análise de regressão múltipla escalonada revelou que os indivíduos com o genótipo mutante ADH1B Arg48His que consomem quantidades de álcool inferiores a 30g/L/dia mantém o risco diminuído de CCP (OR=0,12; 95% IC; 0,03-0,52). Entretanto, quando o consumo diário de bebidas alcoólicas supera 30,655g/L/dia o risco de CCP é aumentado independente da presença (OR=4,42; 95% IC; 1,21-16,11).ou não do genótipo ADH1B Arg48His com o alelo mutado (OR= 3,01; 95% CI, 1,90-4,78). Conclusão: Os genótipos de metabolização rápida do álcool podem proteger contra o CCP quando a quantidade de álcool ingerida for menor que 30,655 g/l/dia. / Garcia, S.M.N. Alcohol metabolizing genes and the risk of head and neck cancer. 2009. Dissertação (Mestrado)- Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo. The incidence of head and neck cancer (HNC) has increased substantially in the last years, including in Brazil. This increase is associated to alcohol and tobacco consumption, but genetic susceptibility also should be considered. The aim of this study was to evaluate the frequency of the polymorphism in genes of alcohol metabolizing enzymes in patients with head and neck cancer (HNC) of the Heliópolis Hospital in São Paulo, compared with a group from the same hospital, without the diagnosis of cancer. The genetic polymorphisms of the alcohol desydrogenase enzyme (ADH1C Ile350Val, ADH1B Arg48His, ADH1B Arg370Cys) and of the P450 citochrome enzyme (CYP2E1 PstI) was investigated by PCR-RFLP, in 451 individuals, being 207 histopathologically confirmed HNC patients (184 male and 23 female, mean age 54,3 ± 7,8 years) and 244 controls (225 male and 19 female, mean age 53,6 ± 9,3 years) selected in the same hospital. The smoking habit was revealed by 80% of the patients with HNC and 50% of the controls, the difference between the groups increased the HNC risk more than ten times (OR=11.1; 95% IC; 4.89-25.19). Just 7% of the patients reported never alcohol use against 22.5% of the controls, increasing more than four times the risk of HNC (OR=4.39 95% IC; 2.35-8.22). The daily consumption of alcohol above 30.655g/L/day (72.5% of the patients with HNC and 35.2% of the controls) was associated with increased risk of the HNC. The analysis of the genetic polymorphisms revealed that the mutate genotype ADH1B Arg48His was more frequent in the controls (12.7%) than in the patients with HNC (5.8%) conferring protection to the disease (OR=0.42; 95% IC; 0.21-0.85). Similar results were observed for individuals with ADH1B*2 (OR=0.41; 95% CI; 0.20-0.82) or ADH1B*2/ADH1C*1 (OR=0.32; 95% CI; 0.13-0.79) haplotypes. Multiple regression analyses showed that the mutant genotype ADH1B Arg48His was associated to HNC protection for those that consumed alcohol lower than 30 g/l/day (OR=0.12; 95% IC; 0.03- 0.52).However, when the daily alcohol consumption exceeded 30.655g/L/day the HNC risk was higher in the presence (OR=4.42; 95% IC; 1.21-16.11) or not of the genotype ADH1B Arg48His with the mutate allele (OR= 3.01; 95% CI, 1.90-4.78).The fast alcohol metabolizing genotypes seams to prevent HNC when the amount of alcohol intake is lower than 30.655 g/L/day.

O sistema renina-angiotensina e o estresse oxidativo têm participação importante na fisiopatologia das complicações crônicas do diabetes. No presente estudo, foram avaliados 103 pacientes com diabetes tipo 1 (DM1) com idade de 28,810,6 anos e duração de doença de 13,18,5 anos e 158 controles não diabéticos quanto à presença dos polimorfismos I/D da ECA e C242T do p22phox, componente essencial para a ativação da NADPH oxidase. Esta análise foi realizada por reação de polimerase em cadeia para ambos os polimorfismos, seguida de restrição enzimática para avaliação do polimorfismo C242T p22phox. Ambas as distribuições genotípicas obedeciam ao princípio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os pacientes diabéticos foram submetidos a avaliação clínica e laboratorial quanto à presença de fatores associados ao risco de complicações (história de tabagismo e antecedentes familiares de diabetes tipo 2, dose diária de insulina, níveis pressóricos, índice de massa corporal, relação cintura-quadril, excreção urinária de albumina, taxa de filtração glomerular, perfil lipídico, controle glicêmico, níveis de proteína C-reativa) e rastreados quanto à presença de nefropatia diabética, considerada presença de micro ou macroalbuminúria; retinopatia diabética não proliferativa ou proliferativa e hipertensão arterial. Não houve diferença significativa entre a presença dos alelos D e I da ECA ou C e T do p22phox entre diabéticos e controles. Os polimorfismos avaliados não apresentaram associação com a presença de nefropatia, retinopatia ou hipertensão arterial. Pacientes portadores do alelo D apresentaram maiores níveis de pressão arterial diastólica (72,2 12,3 vs 65,4 11,6 mmHg , p=0,047) e proteína C-reativa comparados aos portadores do genótipo II [0,18 (0,04-0,38) vs 0,09 (0,04-0,16) mg/dl, p=0,05] , porém ambas as análises perderam significância estatística após correção para duração do diabetes. A combinação dos polimorfismos não esteve associada à presença de complicações microvasculares ou hipertensão arterial. Concluímos que, na população de diabéticos tipo 1 estudada, a frequência dos polimorfismos I/D da ECA e C242T do p22phox , isoladamente ou em combinação, não apresentou diferença em pacientes com ou sem complicações microvasculares precoces ou hipertensão arterial. Os níveis dos diferentes marcadores de risco cardiovascular também não apresentaram diferença nos pacientes com os polimorfismos acima descritos. Entretanto, estudos prospectivos poderão determinar a possível interação entre estes polimorfismos e a duração do diabetes na expressão clínica das complicações crônicas da doença. / The renin-angiotensin system and the oxidative stress play an important role in the pathogenesis of the diabetic complications.In the present study 103 patients with type 1 diabetes (T1DM) aged 28.8 10.6 years and with a disease duration of 13.1 8.5 years and 158 non-diabetic controls were evaluated for the presence of the I / D polymorphism of the angiotensin converting enzyme (ACE) and the C242T polymorphism of the p22phox, an essential component for NADPH oxidase activation. The analysis was performed using polymerase chain reaction for both polymorphisms, followed by enzymatic restriction for C242T p22phox polymorphism. Genotypic distributions of both polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium. Diabetic patients underwent clinical and laboratory evaluation for the presence of risk factors associated with complications of diabetes (smoking and family history of type 2 diabetes, daily insulin dose, blood pressure, body mass index, waist hip ratio, urinary albumin excretion, glomerular filtration rate, lipid profile, glycemic control, C-reactive protein levels) and screened for the presence of diabetic nephropathy, considered as the presence of micro or macroalbuminuria, diabetic retinopathy and hypertension. There was no significant difference between the presence of ACE D or I allele and p22phox C or T allele between diabetic patients and controls. The evaluated polymorphisms were not associated with the presence of nephropathy, retinopathy or hypertension. Patients with the D allele showed higher levels of diastolic blood pressure (72.2 12.3 vs 65.4 11.6 mmHg, p = 0.047) and C-reactive protein compared with those carrying the II genotype [0.18 (0.04-0.38) vs 0.09 (0.04-0.16) mg/dl, p = 0.05], but both analysis lost statistical significance after correction for duration of diabetes. The combination of both polymorphisms was not associated with microvascular complications or hypertension. We conclude that in the studied population of type 1 diabetic patients, the frequency of ACE I / D and C242T of p22phox polymorphisms, alone or in combination, was not different in patients with or without early microvascular complications or hypertension. Also, the levels of different markers of cardiovascular risk did not differ for patients with the polymorphisms described above. However, prospective studies may determine the possible interaction between these polymorphisms and duration of diabetes in the clinical expression of chronic complications of diabetes.