Les membranes nanofibreuses obtenues par électro-filage sont couramment utilisées pour diverses applications biomédicales telles que les pansements ou la régénération tissulaire, en raison de leur grande porosité et de leur morphologie mimant la structure des tissus humains. Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux stratégies différentes, toutes deux basées sur l'utilisation de la cyclodextrine, pour fonctionnaliser ces membranes avec des molécules d'intérêt biologique. Dans un premier temps, des membranes nanofibreuses à base de complexe de polyélectrolyte ont été élaborées à partir de carboxyméthylcellulose et de chitosane pour des applications de type pansements. Du bleu de méthylène, connu pour son activité antibactérienne, a été incorporé dans les fibres, seul ou en tant que complexe d'inclusion avec la cyclodextrine. Les tests préliminaires sont très prometteurs quant à l’efficacité bactéricide de ces matériaux. Une seconde approche visant à élaborer des nanofibres fonctionnelles à base de poly(ε-caprolactone) (PCL) a également été étudiée. Le PCL étant très peu fonctionnalisable, des complexes d’inclusion entre ce polyester et les cyclodextrines, appelés pseudo-polyrotaxanes (pPR), ont été préparés. Des fibres cœur:peau ont ensuite été produites en ajoutant les pPR en surface des fibres. Afin de vérifier la réactivité et l’accessibilité des fonctions hydroxyles des cyclodextrines, un fluorophore a été greffé sur les fibres. Ce type de réaction ouvre de nouvelles voies de fonctionnalisation des fibres de PCL jusqu’alors inexplorées. / Electrospun nanofibrous membranes have proven to be ideal scaffolds for biomedical applications such as wound dressing and tissue engineering, mostly due to their high porosity and their morphology that mimics the structure of human tissues. In this work, we investigated two different strategies based on the use of cyclodextrins to functionalize these scaffolds with molecules of interest. Scaffolds made of polyelectrolyte complexes of carboxymethylcellulose and chitosan were first prepared by blend or coaxial electrospinning for wound dressing applications. Methylene blue, a molecule known to present antibiotic activity, was added, alone or as an inclusion complex with cyclodextrin, in the polymer solution before electrospinning. The preliminary biological assessment suggested that the fibrous membranes exhibited good antibacterial activity. In a second part, electrospun poly(ε-caprolactone) (PCL) scaffolds were prepared for tissue engineering applications. As this polyester can not easily be functionalized, PCL and cyclodextrins were combined to form pseudo-polyrotaxanes (pPRs) with various architectures. Core:shell PCL:pPR fibres were prepared by coaxial electrospinning. Fluorescein isothiocyanate was then grafted onto the fibre surface to prove the presence of available and reactive cyclodextrin hydoxyl groups at the surface of the PCL fibres. This reaction opens the way for innovative and versatile biofunctionalization of PCL.

La présence de sucres complexes constitue une source nutritive importante pour le microbiote qui assure leur dégradation via des CAZymes. Dans le cadre de cette thèse, nous avons construit in silico un modèle de type minimicrobiome contenant 177 génomes représentatifs des communautés bactériennes dans un microbiote intestinal conventionnel. L’analyse du contenu de ce minimicrobiome nous a permis d’estimer leur abondance et leur diversité. De plus, la comparaison du contenu CAZymes par groupe bactérien de type « phylum » a révélé une variabilité inter-phylum, notamment une diversité de familles CAZymes et une abondance en gènes bien plus élevées chez les Bacteroidetes. Dans un deuxième temps, nous avons développé une puce à ADN sur laquelle nous avons greffé des sondes non redondantes ciblant plus de 6500 gènes codant des CAZymes. Nous avons ensuite testé la "puce CAZyme" par hybridation d’ADN bactérien extrait d’échantillons de selles. Nos résultats suggèrent que cette méthode serait plus sensible dans la détection de CAZymes provenant de bactéries rares par rapport à la métagénomique. Ainsi, il est intéressant de noter qu’en utilisant la puce CAZyme, nous avons pu détecter un gène codant pour une famille GH6, alors que les études métagénomiques n’ont jamais réussi à détecter ce gène dans le microbiome intestinal humain et animal. Enfin, l’examen de huit échantillons de selles a permis l’identification d’un noyau CAZome contenant 46 familles de GHs et PLs, ce qui suggérerait que le microbiote intestinal est caractérisé par une stabilité fonctionnelle en dépit de variations taxonomiques importantes entre les individus testés et indépendamment de leur état de santé. / The bacterial communities that inhabit our gut ensure their growth and survival by extracting their carbon source from the food that transits through the intestines. The complex carbohydrates included in the human diet are almost exclusively degraded by the gut microbiota using CAZymes. We built a minimicrobiome model using 177 genomes associated to gut microbiota. The CAZyme content analysis revealed their huge diversity and abundance in our minimicrobiome model. At the phylum level, the Bacteroidetes genomes showed the greatest CAZyme diversity and abundance. Interestingly, as most of CAZymes found in Bacteroidetes genomes contain a signal peptide allowing their secretion in the intestinal lumen and/or in periplasmic space, members of this phylum are suggested to be the primary degraders of complex carbohydrates. Further, we developed a microarray containing probes to target more than 6,500 CAZyme genes. We then validated the CAZyme microarray by the hybridization of bacterial DNA extracted from the stool samples of individuals. Our results suggest that a microarray-based study can detect genes from low-abundance bacteria better than metagenomic-based studies. A striking example was the detection of gene encoding a GH6-family in all subjects examined, whereas metagenomic studies have consistently failed to detect this gene in both human and animal gut microbiomes. In addition, an examination of eight stool samples allowed the identification of a corresponding core CAZome containing 46 CAZymes families that suggests a functional stability of the gut microbiota despite large taxonomical variations between individuals and independently of health state.

La réponse humorale aux antigènes (Ag) thymo-indépendants (TI) tels que les polysaccharides (PS) bactériens ne nécessite pas l’intervention des lymphocytes T mais requiert un dialogue entre lymphocytes B et cellules présentatrices d’Ag (APC). La singularité des Ag TI est qu’ils peuvent générer une réponse anticorps (Ac) in vivo en l’absence de signal danger exogène. Nous avons postulé que les PS bactériens sont capables d’induire un état de compétence des APC leur permettant d’exercer leur fonction auxiliaire vis à vis de la différenciation des lymphocytes B induite par les Ag TI. Notre travail a consisté, d’une part, à identifier la nature de l’APC et à documenter l’état de compétence des APC induit par un PS capsulaire d’une souche de pneumocoque (PS3). Nos résultats montrent que les macrophages et les cellules dendritiques peuvent tous deux exercer une fonction auxiliaire vis-à-vis de la réponse Ac aux Ag TI via la sécrétion de deux cytokines, BAFF et APRIL. Nos données montrent également que ce PS bactérien inhibe différentes réponses impliquant les cellules T (réponse humorale à un Ag thymo-dépendant, hypersensibilité retardée induite par un haptène fort). L’analyse phénotypique et fonctionnelle de cellules dendritiques exposées au PS3 nous conduit à proposer que le PS induit la différenciation des cellules dendritiques en cellules tolérogènes. L’ensemble de nos données suggèrent que l’état de compétence des APCs liée à leur fonction auxiliaire dans la réponse Ac aux Ag TI est équivalent à la fonction tolérogène, déjà documentée dans la littérature. Cette dualité des APCs induite par le PS (stimulatrices vis à vis de la réponse Ac, tolérogènes vis à vis des réponses cellulaires) pourrait jouer un rôle physiologique important au niveau de la muqueuse intestinale. / The humoral immune response against thymus-independent (TI) antigens (Ag) such as bacterial capsular polysaccharides (PS) does not require the help from T lymphocytes but needs a dialog between B cells and antigen presenting cells (APC). The particularity of TI Ag is their ability to generate an antibody response in vivo in the absence of exogenous danger signals. We have postulated that bacterial PS induce a competence status of the APC enabling them to act as auxiliary cells towards the B cells differentiation induced by TI Ag. In the present study, we have indentified the nature of the APC and explored the competence status induced by a capsular PS from S. pneumoniae (PS3). Our results show that both macrophages and dendritic cells (DC) can exert an auxiliary function towards the humoral response to TI Ag by secreting two major cytokines, BAFF and APRIL. We have also shown that bacterial PS suppress different responses involving T cells as humoral response to a thymus-dependent Ag and delayed hyper-sensitivity induced by a potent hapten. The phenotypical and functional analysis of DC exposed to PS3 led us to postulate that PS induces the differentiation of DC into tolerogenic cells. Altogether our findings suggest that the APC’s competence status enabling them to provide help to B cells against TI Ag is their tolerogenic function. This double function of the APC induced by PS (stimulatory towards antibody response and tolerogenic towards cellular responses) could be important in the intestinal mucosal sites.

Coffea arabica var. Laurina (Bourbon pointu, BP) est un mutant naturel de C. arabica ‘Bourbon’ (B). La mutation laurina est récessive, monolocus, Mendélienne et ses effets pléiotropiques. Ces effets ont été étudiés sur le développement des graines et chez les plantules en histologie, morphologie et biochimie. La standardisation de la croissance en taille des graines était primordiale, notamment pour l'étude fine de la composition en polysaccharides pariétaux (PP). Les stades (st) de développement ont été reliés à l'âge des fruits et leur aspect histo-morphologique (st 1-2, 3, 4 : croissance ; st 5 à 7 : maturation). L'étude de la composition en PP a mis en évidence trois phases : φ 1 (st 1-2, 3), φ 2 (st 3, 4, première partie du 5), et φ 3 (deuxième partie du 5, st 6 et 7). La mutation affecte les φ 1 et 2, probablement par le biais du périsperme. Chez la plantule, la mutation affecte la longueur des hypocotyles exposés à la lumière en provoquant le semi-nanisme de BP par rapport à B par un nombre moindre de cellules. Les teneurs en ABA, auxine et cytokinines sont aussi touchées. La composition en PP et en acides chlorogéniques (CQA) n'est affectée ni par la mutation, ni par la lumière pendant la croissance des plantules (sauf pour les CQA ses racines). Un effet-organe est mis en évidence. La mutation réduit la teneur en caféine (CAF) et la différence variétale est présente à la lumière et à l'obscurité. Ces résultats permettent de mieux caractériser les effets pléiotropiques de la mutation laurina. Ils permettent une meilleure 1/ compréhension de l'évolution des PP de la graine au cours de son développement et 2/ connaissance des hormones, CAF, CQA et PP des plantules. / Coffea arabica var Laurina (Bourbon pointu, BP), is a natural mutant of C. arabica ‘Bourbon’ (B). The laurina mutation is recessive, monolocus and Mendelian, with pleiotropic effects. This work highlighted new effects of this mutation, with histological, morphological and biochemical approaches on seeds development and on seedlings. Simultaneous fitting of growth curves of B and BP and their standardization allow comparisons of these varieties and fine study of polysaccharide cell wall (PCW) composition over time. Thus, anatomic specificities, development stages (st) and fruit age were linked (growth: st 1-2 to 4; maturation: st 5 to 7). When taking in account the CWP evolution in time-course, three phases occurred: φ 1 (st 1-2, 3), φ 2 (st 3, 4 and the beginning of 5), and φ 3 (the end of 5, st 6, 7). The two first were affected by the mutation probably through maternal effect (perisperm). In seedlings, the hypocotyls semi-dwarfism in light growth condition is an effect of the mutation and was due to a lower cell number than in B. The phytohormones content was also affected (ABA, auxine, cytokinins). But, neither CWP composition nor chlorogenics acids (CQA) content were affected by the mutation, or growth condition (expected for CQA content in roots). The composition in CWP and CQA was different depending on organs. Finally, caffeine (CAF) content was affected by the mutation in light or darkness conditions. These results represent an important step in 1/ the characterization of the pleiotropic effects of the laurina mutation, 2/ the understanding of the CWP evolution in seed time course, and 3/ new knowledge on seedlings (hormone, CAF, CQA and CWP composition).

En France, 5 % des patients hospitalisés contractent une infection nosocomiale. Pour lutter contre ce problème, nous avons développé un nouveau type de films biocompatibles, pouvant être fonctionnalisés, à base de polysaccharides construit par pulvérisation alternée ou simultanée pour les utiliser comme revêtements d’implants biomédicaux. La pulvérisation, issue du dépôt couche-par-couche de polyanions et de polycations, permettent un gain de temps conséquent.D’abord, la complexation du couple chitosane/acide hyaluronique et le dépôt de multicouches sur ces complexes ont été étudiés. Puis, nous avons étudié la construction de films de 3 couples de polysaccharides par pulvérisation alternée et simultanée. La biocompatibilité de ces films a été étudiée pour valider leur utilisation en tant que revêtements de biomatériaux. Enfin, leur fonctionnalisation a été abordée. L’activité de ces revêtements contre différents pathogènes et leur biocompatibilité ont été testées. Cette étude montre qu’il est possible de construire par pulvérisation des films de polysaccharides et de les rendre actifs grâce au greffage de peptides antimicrobiens. / In France, 5 % of the hospitalized patients develop a hospital-acquired infection. To fight this problem, we developed a new kind of biocompatible films based on polysaccharides , which can be functionalized, built by spraying process. Derived from layer-by-layer dipping of polyanions and polycations, spraying let to spare time. First, we focused on the complexation of Chitosane and hyaluronic acid. We investigated the complexation and multilayers coating on this type of complexes. Next, we studied the buildup of polysaccharide films by alternate and simultaneous spray. Biocompatibility of the polysaccharide films was tested to validate their use as biomaterial coatings. Eventually, we investigated their functionalization. Their activityx against different pathogens and their biocompatibility were tested.This study shows that it is possible to build polysaccharide films by spraying methods and to render these films active against different pathogens by grafting antimicrobial peptides.

Ce travail de thèse a pour but de modéliser la capacité de dégradation des polysaccharides non digestibles par le microbiote intestinal humain. Nous exploitons pour cela des données métagénomiques. Il s'agit de données d'abondances de séquences de nucléotides dans 1408 échantillons dont les fonctions métaboliques sont assignées par annotation contre une base de données. Les séquences sont annotées par des marqueurs fonctionnels. Après une étape de sélection manuelle de 86 marqueurs fonctionnels pertinents à l'activité de métabolisation des polysaccharides, nous étudions leurs variations d'abondances parmi les échantillons métagénomiques.Nous proposons une approche de modélisation écologique du microbiote intestinal humain et considérons principalement la sélection fonctionnelle intense de cet écosystème pour faire l'hypothèse que des regroupements identiques de fonctions métaboliques sont présents en proportions différentes dans tous les microbiotes intestinaux humains. Nous proposons le terme d'assemblage fonctionnel qui rend compte de la co-occurrence spatiale et temporelle d'un groupement de fonctions. Ces assemblages sont en pratiques déterminés par leur composition en marqueurs fonctionnels, et peuvent s'interpréter comme une combinaison de traits fonctionnels agrégés au niveau des microorganismes composant l'assemblage.Les assemblages fonctionnels sont inférés par le biais d'une factorisation en matrice positive aussi nommée NMF de l'anglais Non-Negative Matrix Factorisation. Cette méthode permet de déterminer les assemblages fonctionnels, à la fois concernant leur composition et à la fois concernant leur abondance dans chacun des 1408 échantillons. Nous exploitons par ailleurs une information métabolique provenant de 190 génomes microbiens et de la bibliographie qui permet de préciser la composition de ces assemblages fonctionnels. Cette information se traduit sous forme d'une contrainte.Nous trouvons 4 assemblages en considérant un consensus entre différents critères. L'utilisation de l'information métabolique nous permet d'interpréter biologiquement ces assemblages. Les métadonnées associées aux 1408 échantillons nous permettent d'observer un comportement différent pour les échantillons provenant d'individus atteints de la maladie de Crohn. Nous validons cette observation sur des données extérieures.Nous avons proposé une approche réductionniste permettant de représenter un processus métabolique important à l'échelle du microbiote. Nous trouvons un nombre réduit de 4 assemblages fonctionnels qui sont biologiquement vraisemblables et permettent de bien approcher les 1408 échantillons métagénomiques. / The purpose of this work of thesis is to model the capacity of degradation of non-digestible polysaccharides by the human intestinal microbiote. To this end we exploit metagenomic data. We use abundances of nucleotide sequences in 1408 samples whose metabolic function are assigned by annotation against a database. The sequences are annotated with functional markers. Upon manual selection of 86 functional markers relevant to the activity of metabolisation of polysaccharides, we their abundances variation among the metagenomic samples are studied.We propose an ecological approach in modeling the human intestinal microbiote. We consider the intense functional selection of this ecosystem and assume that identical cluster of metabolic functions can be found in different proportions in every human gut microbiota. We propose the term of functional assembly as to account for spacial and temporal co-occurence of functional cluster. In practice, theses assemblies are determined by their composition and can be interpreted as combinations of functional traits aggregated at the levels of the cluster of microorganisms composing each assembly. Functional assemblies are inferred by the means of Non-Negative Matrix Factorization (NMF). This method allows to determine the composition of functional assemblies and their abundance in each of the 1408 metagenomic sample.Furthermore, we exploit metabolic information from bibliographic resources and 190 microbial genomes in order to specify the composition of these functional assemblies. This information is translated in the form of a constraint.We find 4 assemblies by considering a consensus between various criteria. The use of metabolic information allow to interpret theses assemblies biologically. By exploiting the metadata of the 1408 samples, we observe a different behaviour for the samples coming from individuals suffering from Crohn disease. We validate this observation on external data.We proposed a reductionistic approach allowing to represent an important metabolic process at the level of the microbiota. We find a small number of 4 functional assemblies which are biologically likely and approach well the 1408 metagenomic samples.

Thesis (PhD (Process Engineering))--University of Stellenbosch, 2010. / ENGLISH ABSTRACT: The ongoing trend in papermaking industries is to lower production costs by increasing the low cost filler content in the sheets. However, the disruption of inter-fibre bonding is accompanied by a deterioration of paper stiffness and mechanical properties if filler content exceeds 18 wt%. Polysaccharide solutions, such as starch, are often used as a low cost biodegradable additive to improve internal sheet strength when added to the wet-end of production. The amount of starch that can be added is however limited as only a small percentage will be retained in the paper web. A dual additive multifunctional polysaccharide system was developed to allow higher filler loading levels without detrimental deterioration in paper properties. In order to achieve a larger surface area for fibre/filler interaction and to reduce drainage losses, at least one of these additives was in particulate form. Anionic, cationic, and unsaturated derivatives were prepared using sodium monochloroacetate, 3-chloro-2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride, and allyl bromide, respectively. The degree of substitution was determined by 1H-NMR spectroscopy and back titration methods and the interaction of the ionic modified derivatives with paper components was determined using fluorescence microscopy. Anionic modified polysaccharide particles were prepared using techniques such as macrogel ultrasonification, water-in-water emulsification, and in-situ cross-linking and carboxymethylation of granular starch. A process of adding sequential layers of oppositely charged polyelectrolyte layers onto the filler particles was also investigated. A novel approach of preparing modified particles with tailored size and distribution using microfluidics was studied and modelled using response surface methodology. Hand sheets were prepared using the dual additive system and improvements in stiffness, tear resistance, breaking length, and folding endurance were observed. The modified granular maize starch particles had a pre-eminent effect on improving stiffness at higher filler loadings (14% improvement at 30 wt% filler loading), while bulky particles prepared using microfluidics showed a more consistent improvement (between 6% and 10%) across the loading range. Overall improvements gained by the introduction of multi-layered soluble polymers onto fillers suggest that the introduction of nanotechnology to the papermaking process should be of potential benefit to the industry. Furthermore, the dual additive system developed during the course of this study should also be tested on a continuous pilot plant papermaking process. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die papierindustrie neig voortdurend daarna om produksiekostes te verlaag deur die persentasie lae koste vulstof wat gebruik word te verhoog. Aangesien die vulstof vesel kontak belemmer, gaan hoër vlakke (> 18 wt%) egter gepaard met ’n verlaging in papier styfheid en meganiese eienskappe. Polisakkaried oplossings, soos byvoorbeeld stysel, word dikwels gebruik as lae koste vergaanbare bymiddel om papier intern te versterk wanneer dit voor die vormingsproses bygevoeg word. Slegs ’n beperkte hoeveelheid stysel word egter behou in die papier matriks en oormatige oplossings ontsnap tydens dreinering in die afvalwater. ’n Dubbele multi-funksionele polisakkaried bymiddelsisteem was ontwikkel wat ongewensde verwakking in papiereienskappe verminder tydens vulstof verhogings. Ten minste een van die bymiddels was in partikelvorm om sodoende ’n groter oppervlak te bied vir vesel/vulstof interaksie en om dreineringsverliese te verminder. Anioniese, kationiese, sowel as onversadigde derivate was berei deur onderskeidelik gebruik te maak van natrium monochloroasetaat, 3-chloro-2-hidroksiepropieltrimetielammonium chloried, en alliel bromied. Die graad van substitutiese was bepaal met behulp van 1H-KMR spektroskopie sowel as titrasie tegnieke terwyl die ioniese interaksie van die gemodifiseerde stysels met die papierkomponente ondersoek was met behulp van fluoressensie mikroskopie. Anioniese polisakkaried partikels was berei met tegnieke soos makro-jel ultrasonifikasie, water-in-water emulsifikasie, en in-situ kruisbinding en karboksiemetielasie van stysel granulate. ’n Proses was ook ondersoek waar vulstof partikels omhul was in verskeie lae poliëlektroliet oplossings. ’n Nuwe benadering was toegepas waar gemodifiseerde partikels met voorafbepaalde grootte en verspreiding berei is deur gebruik te maak van mikrofluïdika en gemodelleer met behulp van oppervlakte ontwerp metodeleer. Papier toetse was uitgevoer met die bymiddelsisteem en algehele verbetering in styfheid, skeurweerstand, breeklengte, en voulydsaamheid is waargeneem. Die gemodifiseerde stysel granulate het die grootste verbetering in styfheid by hoë vulstofladings getoon (14% verbetering by 30 wt% vulstoflading) terwyl die groter mikrofluïdika-bereide partikels algehele verbetering (tussen 6% en 10%) getoon het oor die hele vulstoflading reeks. Die verbeteringe in styfheid sowel as meganiese eienskappe van papier voorberei met poliëlektroliet omhulde vulstof toon dat aanwending van nanotegnologie in hierdie bedryf potensieel voordelig kan wees. Opskalering van die polisakkaried bymiddels ontwikkel gedurende hierdie studie behoort uitgevoer te word vir verdere toetse op ’n kontinue papier loodsaanleg.

Thesis (PhD (Chemistry and Polymer Science))--Stellenbosch University, 2008. / Polysaccharides were modified with selected polymers via the grafting technique. Both anionic and cationic polysaccharides were prepared. Random and crosslinked graft copolymers were also prepared. The percentage grafting was determined by gravimetric analysis and results were confirmed by cross-polarization magic angle spinning carbon-13 nuclear magnetic resonance microscopy (CP/MAS 13C NMR). These modified biodegradable polymers were then used to flocculate precipitated calcium carbonate (PCC). The effects of pH, percentage grafting, crosslinker concentration and polysaccharide concentration on PCC flocculation were evaluated. Furthermore, the effects of anionic and cationic starch, either added to PCC sequentially or simultaneously, on PCC flocculation were also investigated. Generally, anionically modified starch showed excellent flocculation properties, which are desirable for the end application of PCC retention. The effect of polyacrylic acid (PAA) and polyacrylamide (PAM) modified cellulose fibers on calcium carbonate crystal nucleation and growth modification was investigated. When the heterogeneous crystallization of CaCO3 was carried out in the presence of modified cellulose fibers the CaCO3 crystals were found to be residing on the surface of the fibers. The morphologies of the crystallized CaCO3, polymorph and fiber surface coverage were different for cellulose materials grafted with polymers of different functionalities, meaning that there is interaction between the crystal growth modifier and the growing nuclei. The effect of the modified starch on the crystallization of calcium carbonate gave useful insight into designing CaCO3 filler morphologies. It was found that the filler size, morphology and surface properties of fillers can be tailor-made by choosing suitable CaCO3 crystallization conditions as well as a suitable crystal growth modifier. The crystallized CaCO3 had a negatively charged surface. Results of fluorescence studies showed that the PAA modified starch (polymeric additive used) resided on the surface of the crystals. Thus the presence of the polysaccharide on the surface of a filler could be advantageous for strengthening fiber–filler bonding in paper applications. Anionic starch materials were also used to prepare anionic-starch-coated starch particles. Both the anionic starch and anionic-starch-coated starch particles were evaluated for PCC retention and other properties of hand sheets. When anionic-starch-coated starch particles were used there was generally an improvement in the PCC retention, while the other paper properties remained desirable. The success achieved with the use of anionic-starch-coated starch particles now opens the way for the further preparation and testing of various modified starch particles, for optimization of filler retention.

Many Gram-positive and Gram-negative bacteria produce an additional thick layer of carbohydrate polymers on the cell wall surface. These capsules (capsular polysaccharides; CPS) play critical roles in interactions between bacteria and their environments (Whitfield, 2006). This is especially important in infection processes since for both Gram-negative and Gram-positive pathogens CPS is the point of first contact with the host immune system (Whitfield, 2006). However, the details of CPS biosynthesis and assembly mechanisms are still unclear. Therefore, we embarked on structural and kinetic studies of the proteins Wzc, Wza and Wzb/ Cps4B from the Wzy-dependent pathway, as well as the protein WbdD from the ATP-binding cassette (ABC) transporter dependent system. Full-length Wzc failed to crystallise due to the presence of large disordered regions and the overall difficulty of membrane protein crystallisation. A truncated version of Wzc (1-480) without the C-terminal tyrosine kinase domain was crystallised and diffracted to 15 Å in house. A previous study suggested Wza and Wzc form a functional complex (Whitfield, 2006), so Wza was also studied. Since the full-length Wza structure is available (C. Dong et al., 2006), Pulsed electron–electron double resonance spectroscopy (PELDOR) was used to study the conformational change. The PELDOR spectroscopy distance fingerprint of Wza was determined. These data also confirmed that PELDOR is a powerful tool to study large, highly symmetrical membrane proteins and can be used to study other complex membrane protein systems, such as ion channels or transporters. The crystal structure of Wzb the cognate phosphatase of Wzc was determined to 2.2 Å. Also Cps4B, which is a functional homologue of Wzb but has a completely unrelated sequence, was crystallised in two crystal forms. Form I and II Cps4B crystals diffracted to 2.8 Å and 1.9 Å resolution in house, respectively. The full-length WbdD failed to crystallise due to the presence of large disordered regions. Therefore, a shorter construct, WbdD₅₅₆ (1-556) was cloned and crystallised. The structure was determined to 2.2 Å. WbdD is a bifunctional enzyme consisting of a methyltransferase (MTase) and a kinase domain. In order to better understand the function of this protein, a variety of techniques were used, such as the ADP-Glo kinase assay, Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, small angle X-ray scattering (SAXS) and X-ray crystallography. The various findings in the current projects provide meaningful insights towards a better understanding of the CPS biosynthesis and assembly mechanisms, which may contribute to a more intensive study identifying inhibitors and beginning to unravel the mechanism of chain length regulation.

published_or_final_version / Biological Sciences / Master / Master of Philosophy