Les cellules souches/progénitrices sont douées d'une forte plasticité cellulaire qui leur permet de développer, de maintenir et de régénérer organes ou tissus dans lesquels elles résident. Ces processus requièrent l'intégration de signaux moléculaires et environnementaux qui influencent leur comportement et leur devenir. La perturbation de l'un de ces mécanismes régulateurs aboutit à une perte de contrôle des cellules souches/progénitrices pouvant entraîner le développement de pathologies cancéreuses. De ce fait, la connaissance des éléments cellulaires et moléculaires régulant la biologie des cellules souches/progénitrices est nécessaire pour l'emploi éventuel de ces cellules en médecine régénérative et pour une avancée dans les traitements anti-cancéreux.<br />La protéine IQGAP1, que nous avons étudiée dans le cerveau dans un contexte physiologique et pathologique, s'est révélée être un nouveau marqueur de cellules souches/progénitrices normales et tumorales. A travers une étude comparative de souris sauvages et iqgap1-/-, nous avons analysé les propriétés et le comportement in vivo comme in vitro des cellules souches/progénitrices neurales. Nous avons démontré qu'IQGAP1 joue un rôle dans la neurogenèse adulte en régulant la migration des cellules progénitrices neurales en réponse au VEGF, facteur pléïotropique intervenant notamment dans la neurogenèse et l'angiogenèse tumorale. D'autre part, dans un contexte tumoral de gliomes humains et chimio-induits chez le rat, la caractérisation de cette protéine dans des cellules souches/progénitrices tumorales au sein de tumeurs malignes a permis d'attribuer un rôle putatif à la protéine IQGAP1 dans l'expansion tumorale par la dissémination de ces cellules cancéreuses. L'identification et la caractérisation de tous les mécanismes environnementaux régulant la motilité et la migration des précurseurs neuraux normaux pourraient s'avérer utile pour la compréhension des mécanismes d'invasion tumorale et pour le développement de thérapies anti-cancéreuses plus efficaces.

Les gliomes sont des tumeurs qui seforment par prolifération anormale de cellules dansle tissu cérébral. La dangerosité de ces tumeursréside dans le fait que la plupart des gliomes sontinvasifs : les cellules tumorales migrent dans le tissusain autour de la tumeur. Ces cellules tumoralesisolées provoquent des récidives quasi systématiquesaprès traitement (chirurgie, chimiothérapie,radiothérapie), rendant ces tumeurs incurablesactuellement et conduisant au décès du patient. Il estimportant d'associer des études fondamentales pourmieux comprendre leur évolution dès l'origine et desétudes plus appliquées en développant de nouveauxsubstrats pour reproduire in vitro leur évolution. Lescellules progénitrices des oligodendrocytes (OPC)représentent la plus grande population de cellules enprolifération et la plus largement distribuée dans lecerveau adulte, ce qui en fait un suspect idéal del’origine des gliomes. A partir de donnéesexpérimentales de la littérature sur la dynamique invivo de ces cellules, un modèle mathématiquereproduisant cette dynamique dans un tissu sain a étédéveloppé.Ce modèle montre également que les OPC pourraientêtre à l’origine de toutes les formes de gliomerencontrées aussi bien de bas grade que de hautgrade. Par ailleurs, l’approche expérimentale utiliséevisait à développer un substrat de culture cellulaireadapté à l’étude des gliomes in vitro. Ainsi, unhydrogel biocompatible, minimaliste et contrôlable aété élaboré. Celui-ci mime l’élasticité de la matriceextracellulaire (MEC) cérébrale avec une rigidité del’ordre de 200 Pa et l’effet adhésif des molécules dela MEC impliqué dans l’adhésion et la proliférationdes cellules tumorales. Grâce à ses propriétés,l’hydrogel favorise la survie de près de 90% desmodèles cellulaires de gliome utilisés dans notreétude et supporte la croissance en trois dimensionsd’agrégats multicellulaires semblables à lamorphologie de micro-tumeurs in vivo. Le modèled’hydrogel est donc validé pour favoriser la viabilitéet la prolifération cellulaires. Les perspectives detravail futures porteront sur l'optimisation de sacomposition pour mimer de manière encore plusréaliste la croissance tumorale in vivo. / Gliomas are brain tumors arising fromanomalous cell proliferation into the brain tissue.The hazard of these tumors resides in their invasiveability : tumor cells migrate into the healthy tissuesurrounding the tumor. These isolated cells causequasi systematic recurrences after treatment(surgery, chemotherapy, radiotherapy) making thesetumors currently incurable and leading to patientdeath. Hence, it is important to associatefundamental studies for better understanding of theirevolution from their origin with more appliedstudies developing new substrates for reproducingtheir evolution in vitro. Oligodendrocyte progenitorcells (OPC) are the most widely spread proliferatingpopulation in the adult brain, which makes them themain suspect of causing gliomas origin. Fromexperimental data in the literature about in vivodynamic of OPC, a mathematical model that depictsthis dynamic into a healthy tissue has beendeveloped.This model also shows that OPC could be at theorigin of all glioma forms from low to high grade.Furthermore, the experimental approach used aimedat designing a cell culture substrate adapted toglioma studies in vitro. Thus, a biocompatible,minimalistic and controllable hydrogel has beenperformed. It mimics brain extracellular matrix(ECM) elasticity around 200 Pa and the adhesiveeffect of ECM molecules involved in tumor celladhesion and proliferation. Due to these properties,the hydrogel contributes to around 90% of gliomacell models survival used in our study and promotesmulticellular aggregates growth in three dimensionsthat look like in vivo microtumors morphology. Thishydrogel model is thus validated for cell viabilityand proliferation. Future works will be devoted tothe optimization of its composition for bettermimicking of tumor growth in vivo in a morerealistic manner.

Résumé: Le muscle squelettique possède une excellente capacité à se regénérer notamment grâce à ses cellules progénitrices stromales (mrSC) et myogéniques (CPM). À la suite de certains traumas et pour des raisons encore méconnues, la qualité de sa régénération est compromise ce qui mène à l’apparition de structures aberrantes tel l’os mature, aussi appelée ossification hétérotopique (OH) post-traumatique. Notre laboratoire a montré dans un modèle murin que les mrSC sont pleinement impliquées dans cette pathologie. De plus, un facteur fortement ostéoinducteur, BMP9, ne cause l’OH que si, et seulement si, le muscle est endommagé. Ce modèle d’étude est unique puisqu’il présente les particularités physiopathologiques de l’OH post-traumatique, un dommage du muscle étant essentiel à la formation d’os. De plus, ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle prédominant du microenvironnement des cellules progénitrices dans le développement de cette pathologie. Nous avons donc émis l’HYPOTHÈSE selon laquelle le microenvironnement du muscle endommagé contient des facteurs qui peuvent influencer le phénotype de ses cellules progénitrices stromales et myogéniques favorisant ainsi le développement de l’OH. Nos résultats montrent que l’état hypoxique d’un muscle sévèrement endommagé augmente la prolifération et la différenciation ostéogénique des mrSC. De plus, l’hypoxie induit spécifiquement l’expression de BMP9 par les mrSC. L’impact de BMP9 a également été évalué sur la différenciation des CPM. Les résultats montrent qu’à des concentrations physiologiques, BMP9 inhibe le potentiel myogénique des CPM en faveur d’une différenciation ostéogénique, et cela tant dans la lignée myoblastique murine C2C12 que chez les CPM primaires humaines. En résumé, le muscle endommagé développant l’OH possède un microenvironement spécifique responsable du débalancement de la capacité régénérative de ses progéniteurs. Nos travaux montrent que ce microenvironnement cause un retard de la myogenèse et une ostéogenèse où participeront non seulement les mrSC mais également les CPM. L’identification et la compréhension des mécanismes régulant ces facteurs s’avèrent clé pour offrir aux cliniciens des outils de diagnostic mais également des alternatives ou des approches complémentaires aux traitements prophylaxiques actuels. / Abstract: Skeletal muscle has an extraordinary ability to regenerate due to its resident stromal cells (mrSCs) and myogenic progenitor cells (MPCs). Following certain traumas, the quality of the regeneration of skeletal muscle can be compromised for unknown reasons, leading to the appearance of aberrant structures such as mature bone, a process called posttraumatic heterotopic ossification (HO). Our laboratory developed a mouse model to show that mrSCs are fully involved in this pathology. We also showed that BMP9, a highly osteoinductive factor, causes HO if and only if the muscle is damaged. This model is unique in that it recapitulates the pathophysiological features of post-traumatic HO in which muscle damage is essential for bone formation. The model was also used to show that the progenitor cell microenvironment plays a predominant role in the development of this pathology. Based on these results, we HYPOTHESIZED that the microenvironment of the damaged muscle contains factors that can influence the phenotype of its progenitor cell populations, thus promoting the development of HO. Our results showed that the hypoxic state of a severely damaged muscle increases the proliferation and osteogenic differentiation of mrSCs and also specifically induces the expression of BMP9 by mrSCs. The impact of BMP9 on the differentiation of MPCs was also evaluated. At physiological concentrations, BMP9 inhibited the myogenic differentiation potential of murine myoblast C2C12 cells and primary human MPCs, and triggered their differentiation into an osteogenic lineage. In summary, we showed that damaged muscle that develops HO has a specific microenvironment that is responsible for the loss of the regenerative capacity of progenitor cells, leading to a delay in myogenesis, and that mrSCs and MPCs are both involved in osteogenesis. The identification and understanding of the mechanisms regulating these key factors could provide clinicians with valuable diagnostic tools as well as alternative and/or complementary approaches to current prophylactic treatments.

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques. / When atherosclerotic vascular obstructions are so extensive that direct revascularization techniques cannot be undertaken successfully, the severity of residual tissue ischemia will depend in large part on the ability of the organism to spontaneously develop new blood vessels (neovascularization). The mechanisms involved in neovascularization depend on the oxidative stress balance. Increased oxidative stress is a common feature of all cardiovascular risk factors and particularly aging. In the vascular wall, CuZnSOD is the predominant antioxidant enzyme. Nevertheless, its specific role in vascular aging and new blood vessels formation is currently unknown. Accordingly, we hypotheze that 1) CuZnSOD deficiency reduces neovascularization in response to ischemia 2) this reduction is partly due to vascular aging affecting mature endothelial cells and endothelial progenitor cells. We have demonstrated that CuZnSOD deficiency significantly reduces neovascularization in response to ischemia. This reduction is associated with increased oxidative stress and reduced NO bioavailability. CuZnSOD deficiency significantly decreases EPCs number (bone marrow, spleen). Moreover, these EPCs present significant increased oxidative stress levels, reduced NO production and decreased migration and incorporation into tubular-like structures capacities. Importantly, neovascularization in CuZnSOD deficient-mice can be rescued by an EPCs supplementation from control mice. vii We have also demonstrated that the blood flow recovery following ischemia was significantly reduced with aging. Both in old and young mice, CuZnSOD deficiency led to a further reduction of neovascularization. Interestingly, the resulting neovascularization potential in young CuZnSOD-deficient mouse was similar to that of an older wild type mouse. Oxidative stress levels were also increased to similar levels in these two groups. Both aging and CuZnSOD deficiency were associated with reduced number of bone marrow and peripheral EPCs. The effect of moderate aging alone on specific functional activities of EPCs was modest. However, CuZnSOD deficiency was associated with severe age-dependent defect in EPC fucntional activities. In summary, our resultats suggest that CuZnSOD protection against oxidative stress is essential for EPC functional activities and neovascularization in response to ischemia. The defective neovascularization observed in CuZnSODdeficient mice is associated with accelerated vascular aging. Our results suggest that in aging context, CuZnSOD has a critical role limiting increased oxidative stress and protecting both EPC functional activities and ischemic tissues integrity.

La destruction des cellules ciliées de la cochlée entraine des surdités sensorielles. Chez les mammifères ces cellules ne se régénèrent pas et les déficits auditifs occasionnés sont définitifs. Aucune thérapie visant à remplacer les cellules ciliées détruites n'est actuellement proposée.L'objectif de cette thèse est de contribuer au développement d'une thérapie cellulaire basée sur la greffe de cellules souches / progénitrices cochléaires et destinée à promouvoir la régénération des cellules ciliées.Au cours de nos travaux, nous avons isolé une population de cellules souches cochléaires chez des souris néonatales appartenant à la « side population » (Savary et al. 2007). Nous avons également montré, par des expériences de perte et de gain de fonction in vitro, que la voie de signalisation Notch est nécessaire pour l'auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules (Savary et al., 2008). Des lignées de souris transgéniques exprimant la GFP sous le promoteur de la GFAP et de la Nestine nous ont permis de suivre l'expression de ces marqueurs de cellules souches dans des cochlées de souris P3 et adultes. En étudiant l'expression combinée d'autres marqueurs comme Sox2 et Abcg2, nous avons montré que les cellules progénitrices cochléaires sont réparties différemment chez les souris néonatales et les souris adultes (Smeti, Savary et al 2010).Nos expériences préliminaires de transplantation in vitro dans un modèle murin de surdité génétique humaine de type DFNA15 démontrent que les cellules souches / progénitrices greffées sont capables d'intégrer l'épithélium sensoriel lésé et de se différencier en cellules exprimant un marqueur de cellules ciliées. / The destruction of cochlear hair cells causes sensory deafness. In Mammals these cells do not regenerate and damages are irreversible. Currently, there is no proposed therapy to replace the destroyed hair cells.The focus of this thesis is to develop a novel cell therapy based on transplantation of cochlear progenitor cells in order to promote regeneration of hair cells.We first isolated a population of cochlear stem cells from neonatal mice by using the side population analysis technique (Savary et al. 2007). Then, we showed, by in vitro loss and gain of function experiments, that the Notch signaling pathway is necessary for cellular self-renewal and differentiation (Savary et al., 2008).Transgenic mice strains expressing GFP under the control of GFAP and Nestin promotors allowed us to monitor the expression of these markers of stem cells in the P3 and adult mice cochleae. By studying the combined expression of other stem cells markers such as Sox2 and ABCG2, we showed that the niches of cochlear progenitor cells are differently distributed in neonatal and adult mice (Smati, Savary et al 2010).Our preliminary in vitro transplantation experiments in a mouse model that mimics human genetic deafness DFNA15 show that the transplanted stem / progenitor cells are able to migrate to the lesion site, to integrate the damaged sensory epithelium and to differentiate into cells expressing a marker of hair cells.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Les cellules dérivées de la moelle osseuse, principalement les cellules endothéliales progénitrices, sont réduites chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Leur mobilisation et leur incorporation aux sites de lésion vasculaire sont des évènements prépondérants dans l’accélération des processus de réendothélialisation. Dans un modèle murin, le 17β-estradiol favorise les processus de guérison vasculaire par la mobilisation et le recrutement des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse. Il existe présentement plusieurs stratégies afin d’augmenter la mobilisation des cellules progénitrices ainsi que leur incorporation à la paroi vasculaire. Cependant, peu d’études privilégient la livraison locale d’un nombre élevé de cellules progénitrices fonctionnelles par un véhicule biodégradable et leur maintien au site de lésion afin de favoriser la réendothélialisation ciblée. Un polymère d’intérêt pour cette application s’avère être le chitosan. Ce biopolymère non toxique et biodégradable est couramment utilisé dans l’ingénierie tissulaire et, depuis peu, est utilisé dans la guérison vasculaire. Le chitosan complexé à la phosphorylcholine voit sa solubilité s’accroître dans les solutions aqueuses ainsi que sa biocompatibilité cellulaire en condition physiologique. Le projet de ce mémoire visait donc : 1) à étudier in vitro, la capacité d’un polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine à influencer l’adhésion, la survie, la différenciation et la fonctionnalité cellulaire dans un modèle murin de culture mixte de cellules dérivées de la moelle osseuse et 2) de déterminer l’impact de la présence du 17β-estradiol sur ces mêmes comportements cellulaires. Nos travaux démontrent que la matrice de chitosan-phosphorylcholine s’avère compatible avec notre modèle de culture cellulaire. En effet, ce polymère est capable de promouvoir l’organisation et le développement des cellules dérivées de la moelle osseuse de façon comparable à la matrice normalement utilisée dans la croissance in vitro des cellules endothéliales progénitrices, la fibronectine. De plus, ce polymère n’a nullement compromis l’activité migratoire des cellules, laissant supposer qu’il pourrait éventuellement être un véhicule approprié pour effectuer une livraison cellulaire à un site de lésion. Il s’avère que le 17β-estradiol, lorsqu’ajouté au milieu de culture ou complexé au polymère de chitosan phosphorylcholine, est capable de moduler le comportement cellulaire, et ce, de façon différente. Le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine démontre, par rapport à sa forme soluble, une plus grande aptitude à accroître le nombre de cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. De plus, le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine permet une amplification marquée des cellules endothéliales progénitrices et leur offre un support adéquat afin de favoriser la guérison vasculaire. L’ensemble de nos travaux suggère que le polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine en présence ou non de 17β-estradiol est une matrice compatible avec les cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. Le 17β-estradiol complexé au polymère est toutefois plus efficace que sa forme soluble à promouvoir l’amplification du nombre de cellules progénitrices. Ce polymère représente un outil thérapeutique attrayant et une matrice de livraison d’agent bioactif prometteuse pour le recrutement cellulaire dans l’accélération de la guérison vasculaire. / Bone marrow derived cells, including endothelial progenitor cells, are reduced in numbers in patient with cardiovascular disease or risk factors. Mobilization and incorporation of these cells at the vascular lesion site are important events in the reendothelialization process. 17β-estradiol was shown in a mouse model of injury, to favour this healing process through mechanisms which involve the mobilization and incorporation of endothelial progenitor cells derived from the bone marrow. At the moment, there are many strategies to increase endothelial progenitor cells mobilization as well as recruitment into the vascular wall. However, few studies favour local delivery of a large number of functional progenitor cells on a biodegradable scaffold and to maintain them at the lesion site in order to promote reendothelialization. An interesting biopolymer for this application is chitosan. This non toxic and biodegradable biopolymer is commonly used in tissue engineering and was recently used in vascular healing. Phosphorylcholine modified chitosan can increase the water solubility and cell biocompatibility of the biopolymer in physiological condition. This master project was thus designed to :1) evaluate, in vitro, the capacity of phosphorylcholine modified chitosan to influence cell adhesion, survival, differentiation and functionality in a mouse model of bone marrow mixed culture and 2) determine the impact of 17β-estradiol on these cell behaviours. Our results suggest an adequate biocompatibility of phosphorylcholine modified chitosan with our cell culture system. Indeed, this polymer was able to promote cell organization and development of bone marrow derived cells in the same way that fibronectin, the most commonly matrix used in the progenitor cells in vitro culture. Moreover, cell migratory activity was not compromised by the chitosan polymer. It appears that 17β-estradiol, when added to cell culture media or attached on phosphorylcholine modified chitosan is able to modulate differently cell behaviour. Our data suggest that 17β-estradiol coupled to the chitosan polymer was superior to increase the number of haematopoietic and endothelial progenitor cells derived from bone marrow in vitro compared to the soluble form. 17β-estradiol coupled to the polymer of phosphorylcholine modified chitosan allowed an increased amplification of progenitor cell number and provided adequate scaffold to favour vascular healing. We propose that phosphorylcholine modified chitosan in presence or not of 17β-estradiol is a compatible matrix with bone marrow derived progenitor cells in vitro. 17β-estradiol enhances the amplification of progenitor cell in vitro when associated to the polymer compared to its soluble form. This biopolymer may be an attractive matrix and a promising vehicle in a drug delivery therapeutic system for progenitor cells recruitment and to promote vascular healing.

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

La documentation scientifique fait état de la présence, chez l’adulte, de cellules souches et progénitrices neurales (CSPN) endogènes dans les zones sous-ventriculaire et sous-granulaire du cerveau ainsi que dans le gyrus denté de l’hippocampe. De plus, un postulat selon lequel il serait également possible de retrouver ce type de cellules dans la moelle épinière et le néocortex des mammifères adultes a été énoncé. L’encéphalopathie de Wernicke, un trouble neurologique grave toutefois réversible qui entraîne un dysfonctionnement, voire une défaillance du cerveau, est causée principalement par une carence importante en thiamine (CT). Des observations récentes laissent envisager que les facteurs en cause dans la prolifération et la différenciation des CSPN pourraient également jouer un rôle important lors d’un épisode de CT. L’hypothèse, selon laquelle l’identification de nouveaux métabolites entrant dans le mécanisme ou la séquence de réactions se soldant en une CT pourraient en faciliter la compréhension, a été émise au moyen d'une démarche en cours permettant d’établir le profil des modifications métaboliques qui surviennent en de telles situations. Cette approche a été utilisée pour constater les changements métaboliques survenus au niveau du foyer cérébral dans un modèle de rats déficients en thiamine (rats DT), particulièrement au niveau du thalamus et du colliculus inférieur (CI). La greffe de CSPN a quant à elle été envisagée afin d’apporter de nouvelles informations sur la participation des CSPN lors d’un épisode de CT et de déterminer les bénéfices thérapeutiques potentiels offerts par cette intervention. Les sujets de l’étude étaient répartis en quatre groupes expérimentaux : un premier groupe constitué de rats dont la CT était induite par la pyrithiamine (rats DTiP), un deuxième groupe constitué de rats-contrôles nourris ensemble (« pair-fed control rats » ou rats PFC) ainsi que deux groupes de rats ayant subi une greffe de CSPN, soit un groupe de rats DTiP greffés et un dernier groupe constitué de rats-contrôles (rats PFC) greffés. Les échantillons de foyers cérébraux (thalamus et CI) des quatre groupes de rats ont été prélevés et soumis à des analyses métabolomiques non ciblées ainsi qu’à une analyse visuelle par microscopie à balayage électronique (SEM). Une variété de métabolites-clés a été observée chez les groupes de rats déficients en thiamine (rats DTiP) en plus de plusieurs métabolites dont la documentation ne faisait pas mention. On a notamment constaté la présence d’acides biliaires, d’acide cynurénique et d’acide 1,9— diméthylurique dans le thalamus, alors que la présence de taurine et de carnosine a été observée dans le colliculus inférieur. L’étude a de plus démontré une possible implication des CSPN endogènes dans les foyers cérébraux du thalamus et du colliculus inférieur en identifiant les métabolites-clés ciblant les CSPN. Enfin, les analyses par SEM ont montré une amélioration notable des tissus à la suite de la greffe de CSPN. Ces constatations suggèrent que l’utilisation de CSPN pourrait s’avérer une avenue thérapeutique intéressante pour soulager la dégénérescence symptomatique liée à une grave carence en thiamine chez l’humain. / Endogenous neural-stem progenitor cells (NSPC) have been documented to be found in the subventricular and subgranular zones, the dentate gyrus, and suggestions of the possibility of these cells being found in the spinal cord and neocortex in adult mammalian brain have been postulated. Thiamine deficiency (TD) is the major cause of Wernicke's Encephalopathy, a reversible neurological disorder that results in cerebral dysfunction and impairment. Recent evidence suggests factors involved in neural NSPC proliferation and differentiation are involved during TD. By means of a current approach for profiling metabolic changes occurring in focal areas of the TD rat brain, specifically the thalamus and the inferior colliculus (IC), it was hypothesized that new metabolites that might offer a better understanding into the sequel and/or mechanism of TD could be identified. It was also considered that the use of NSPC transplantation could offer new information into the involvement of NSPC and potential therapeutic benefit in TD. Non-targeted metabolomics analysis, fluorescences microscopy, and scanning election microscopy (SEM) analysis visualization was performed on samples of the focal areas (thalamus and IC) of pyrithiamine induced TD rats (PTD), pair-fed controls (PFC) rats, and NSPC transplanted TD and PFC rats. Various key metabolites were identified in rats with TD, including previous undocumented metabolites such as bile acids, kynurenic acid, and 1,9-dimethyluric acid in the thalamus and taurine and carnosine in the IC. The study also demonstrated a possible involvement of endogenous NSPC in focal areas of the thalamus and IC identifying key metabolites targeting NSPC and showed tissue amelioration (observed through SEM) following NSPC transplantation. The findings suggested that NSPC could offer a therapeutic alternative to alleviate some of symptomatic degeneration of TD.

Le coiffage pulpaire direct, dans des situations pathologiques critiques où la vitalité de la dent est menacée, vise à stimuler le potentiel de cicatrisation de la pulpe et induire une régénération dentinaire. Afin d'optimiser cette thérapeutique, le Laboratoire IMEB-ERT 30 a développé en partenariat avec la société SEPTODONT un nouveau matériau, le Biodentine™. Ce ciment, composé essentiellement de silicate tricalcique, possède des qualités physiques permettant son utilisation comme substitut dentinaire. Le premier objectif de notre travail a été d'évaluer les propriétés biologiques du Biodentine™ et ses interactions avec les cellules cibles en culture. La bioactivité du nouveau ciment a ensuite été étudiée à l'aide du modèle de culture de dents entières humaines ex vivo. Ce modèle expérimental original a été mis au point dans notre laboratoire et permet d'étudier les phases précoces de la régénération dentinaire lors du coiffage direct. Grâce à ce modèle, nous avons démontré l'activation, la prolifération et la migration de cellules progénitrices pulpaires périvasculaires en réponse à une lésion cavitaire profonde. Le coiffage direct avec les ciments de silicates tricalciques a induit la formation de foyers minéralisés à proximité de la lésion. La caractérisation moléculaire de ces foyers a montré qu'il s'agit d'une forme de dentine réparatrice synthétisée par des cellules odontoblast-like. Le deuxième objectif de notre travail a été d'étudier l'effet du nouveau biomatériau sur la sécrétion de certains facteurs de croissances, impliqués dans les phases précoces de la cicatrisation pulpaire, et de le comparer à celui d'autres matériaux de coiffage. / The objective of direct pulp capping is to stimulate the pulp healing potential and to induce dentin regeneration. This is of prime importance in critical pathologic situations compromising the tooth vitality. To improve the outcome of this treatment, the IMEB-ERT30 Laboratory, in collaboration with the SEPTODONT Company, has developed a new restorative material called Biodentine™. This cement, essentially composed of tricalcium silicates, has the required physical properties to be used as a dentin substitute. The first aim of this work was to evaluate the biological properties of Biodentine™ and its interactions with the target cells in cell culture. Then, the bioactivity of the new cement was studied using an entire human tooth culture model ex vivo. This original experimental model, developed in our Laboratory, is suitable in studying the early steps of dentin regeneration after direct pulp capping. With this model, we demonstrated the activation, proliferation, and migration of perivascular pulpal progenitor cells in response to pulp injury. The direct pulp capping with tricalcium silicate cements induced mineral foci formation in the vicinity of the pulp lesion. Molecular characterization of these foci confirmed it was of a reparative dentin type produced by odontoblast-like cells. The second objective of our work was to study the effect of the new cement on the secretion of some growth factors involved in the early steps of pulp wound healing, and compare it to that of other pulp capping materials. The results demonstrated an up-regulation of b-FGF, VEGF and PDGF-AB secretion in response to the target cells injuries, suggesting a stimulation of angiogenesis.