Les proprotéines convertases (PCs) sont des enzymes impliquées de nombreux processus pathologiques. Nous avons étudié deux substrats des PCs: l'apeline et la glycoprotéine B (gB) du virus d'Epstein Barr (EBV), et le rôle de cette maturation protéolytique dans la médiation de leurs fonctions. L'apeline est surexprimée dans plusieurs cancers dont le cancer colorectal (CCR), et nous avons montré que la furine, un membre des PCs, clive l’apeline. Pour déterminer le rôle de ce clivage dans le CCR métastatique, nous avons généré un mutant non clivable (apeline-DM). In vitro, ce mutant inhibe la croissance de cellules cancéreuses du côlonet ne les protège pas de l'apoptose, contrairement à l'apeline sauvage. In vivo, l'apeline-DM diminue drastiquement la croissance tumorale et la formation de métastases hépatiques chez la souris. Les mêmes résultats sont obtenus dans des modèles de souris déficientes pour l’apeline, démontrant l'intérêt d'utiliser l'apeline-DM ou des dérivés comme potentiels agents anticancéreux dans le traitement des CCR métastatiques. La gB du virus EBV, virus impliqué dans certains cancers lymphoïdes et épithéliaux chez l'homme, permet l'entrée du virus dans la cellule lors de l'infection. Nous avons montré que les PCs, et notamment la furine, clivent la gB. In vitro, l'induction de la protéine virale LMP1 augmente l'expression de la furine, qui se traduit par une augmentation de l'infection par EBV. Ces résultats suggèrent l'existence d'une boucle de régulation entre la furine et LMP1 permettant d'améliorer la propagation cellulaire du virus. L'utilisation d'inhibiteurs de l'activité des PCs permettrait donc de bloquer l'infection par EBV. / Proprotein convertases (PCs) are enzymes involved in many pathological processes. We have identified two novel substrates of the PCs: apelin and glycoprotein B (gB) of Epstein Barr Virus (EBV), and studied the role of PC-mediated proteolytic maturation in their functions. Apelin is overexpressed in some cancers including colorectal cancer (CRC), and we demonstrated that furin, one of the PCs member, cleaves apelin in two peptides. To determine the role of apelin cleavage by furin in the metastatic CRC, we generated a non-cleavable mutant (apelin-DM). This mutant inhibited the growth of colon cancer cells in vitro and could not protect against apoptosis, unlike the wild-type apelin. In vivo, apelin-DM drastically reduces tumor growth and the formation of hepatic metastases in mice. These results were confirmed in apelin deficient mouse models thus demonstrating the potential interest of using apelin-DM, or its derivatives, as anticancer agents in the treatment of metastatic CRC. The gB of EBV, a virus involved in some lymphoid and epithelial cancers in humans, is involved in the entry of the virus into the cell during infection. We have shown that PCs, especially furin, cleave gB. In vitro,induction of the LMP1 viral protein increases furin expression, which results in an increase in EBV infection. These results suggest the existence of a regulatory loop between furin and LMP1 to improve the cellular propagation of the virus. The use of inhibitors of PCs activity would thus block EBV infection, a virus against which there is no treatment nowadays.

Un obstacle important dans l’éradication du virus de l’immunodéfience humaine (VIH-1) est l’établissement de réservoirs viraux où le virus reste à l’état latent ainsi que l’absence de vaccin efficace. Bien que les molécules antivirales actuelles permettent d’augmenter l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH-1 (PLWH) ainsi que de diminuer la réplication virale chez cellesci, elles ne contribuent pas à l’élimination de ces réservoirs. La hausse de résistance envers ces molécules inhibitrices nécessite le développement constant de nouvelles molécules. L’une d’entre elles, temsavir (BMS-626529), est un nouvel inhibiteur d’attachement approuvé par la FDA depuis 2020. Sa cible, la glycoprotéine d’enveloppe (Env), est le seul antigène viral présent à la surface des cellules infectées et des virions, représentant donc la cible idéale des anticorps. L’Env mature se trouve sous forme d’hétérodimère (gp120 et gp41) suite au clivage de son précurseur gp160. Temsavir lie sous la boucle β20-β21 de la gp120 et prévient donc, par compétition, l’interaction entre l’Env et le récepteur CD4 de l’hôte. En plus de son rôle en tant qu’inhibiteur d’attachement, temsavir permet de stabiliser le trimère dans sa conformation dite «fermée». Un ancien analogue de temsavir, BMS-806, a montré réduire l’addition de glycans ainsi que de diminuer le clivage du précurseur gp160. Nos études démontrent que temsavir possède également un impact sur ces mécanismes impliqués dans la maturation et la flexibilité de l’Env de plusieurs souches du VIH-1. De ce fait, nous avons investigué l’effet de cette altération sur la conformation des différentes Env. Nos observations montrent que l’effet de temsavir sur le clivage protéolytique est associé à une diminution de la reconnaissance de l’Env par des anticorps ciblant différentes régions de celle-ci. Cette modification de la reconnaissance de l’Env est également associée à l’efficacité de la réponse cytotoxique cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) à éliminer les cellules infectées. Les résultats présentés dans ce mémoire, notamment l’effet de temsavir sur la conformation de l’Env, devrait être considéré lors du développement d’immunothérapies ciblant le réservoir viral. / An important obstacle in the eradication of the human immunodeficiency virus (HIV-1) is the establishment of viral reservoirs where the virus remains in a latent state and the absence of a potent vaccine. Although current antiretroviral molecules increase the life expectancy of people living with HIV-1 (PLWH) as well as reduce viral replication, they do not contribute to the elimination of these reservoirs. Also, the increase in drugs resistances towards these inhibitory molecules requires the constant development of new molecules. One of them, temsavir (BMS-626529), is a new attachment inhibitor approved by the FDA since 2020. Its target, the envelope glycoprotein (Env), is the only viral antigen present at the surface of infected cells and virions and thus, is also the main target of antibodies. This mature Env consists of three gp120-gp41 heterodimers after the proteolytic cleavage of its gp160 precursor. Temsavir binds under the β20-β21 loop of gp120 and prevents the interaction between Env and the host CD4 receptor. In addition to its role as an attachment inhibitor, temsavir stabilizes the trimer in its "closed" conformation. A previous analog of temsavir, BMS-806, has been shown to affect the addition of glycans as well as the cleavage of the gp160 precursor. Our studies demonstrate that temsavir also has an impact on these mechanisms involved in the maturation and flexibility of Env of several strains of HIV-1. Therefore, we investigated the effect of this alteration on the conformation of different Env. Our observations showed that the effect of temsavir on proteolytic cleavage is associated with a decrease in Env recognition by antibodies targeting different regions of Env. This modification in Env recognition also appears to be associated with the efficacy of antibody to mediate potent antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) against infected-cells. The results presented in this master thesis, should be considered when developing immunotherapies aimed at targeting the viral reservoir in Fostemsavir-treated individuals.

Les colicines sont des toxines antibactériennes d’Escherichia coli qui sont relâchées par les cellules productrices (colicinogènes) dans le milieu extracellulaire en réponse à des conditions de stress environnementaux. Les colicines D et E3 sont des RNases qui clivent respectivement les tRNAArg et le 16S RNA ribosomique. Les deux colicines parvenues au cytoplasme de la cellule cible provoquent ainsi la mort par inactivation de la machinerie de biosynthèse des protéines. L’import de ces deux colicines nécessite d’abord le détournement de deux systèmes cellulaires différents (FepA/TonB ou BtuB/Tol) de leur fonction physiologique, permettant leur translocation à travers la membrane externe. L’idée que par la suite la translocation à travers la membrane interne nécessite au préalable une étape de processing des colicines nucléases est ancienne, mais elle n’a jamais été démontrée formellement. Nos travaux ont permis de montrer qu’une coupure endoprotéolytique des deux colicines constitue une étape de « processing » essentielle de leur action toxique. Nous avons détecté la présence du domaine C-terminal catalytique des deux colicines dans le cytoplasme des cellules cibles préalablement exposées à la toxine. Les mêmes fragments processés (PF) ont été identifiés dans les cellules sensibles et dans les cellules immunes contre ces colicines, qui sont protégées par une protéine d’immunité spécifique, formant un complexe neutre avec le domaine catalytique. Nous avons démontré que la protéase essentielle de la membrane interne, FtsH, est nécessaire au processing des deux colicines pendant leur import. Nous avons montré aussi que la signal-peptidase LepB, une autre enzyme essentielle de la membrane interne, interagit directement avec le domaine central de la colicine D in vitro et ainsi elle est un facteur protéique spécifiquement nécessaire au processing de la colicine D. Cependant ce n’est pas l’activité catalytique de LepB qui est impliquée dans la toxicité de la colicine D, mais elle jouerait un rôle structural. LepB ainsi faciliterait probablement l’association de la colicine D avec la membrane interne en vue de la reconnaissance de la toxine par FtsH. Nous avons aussi montré que la protéase OmpT de la membrane externe est responsable d’une coupure endoprotéolytique alternative, qui refléte probablement son rôle bien connu dans le système de défense des bactéries contre les peptides anti-microbiens. Même si cette coupure in vitro permet de libérer le domaine catalytique des colicines D et E3, il est établit maintenant que la protéase OmpT n’est pas impliquée dans le processing des colicines durant leur import dans le cytoplasme. / Colicins are antibacterial toxins of Escherichia coli that are released into the extracellular medium in response to environmental stress conditions. Colicin D is an RNase that cleaves the anticodon loop of all four isoaccepting tRNAArg. Colicin E3 cleaves 16 S ribosomal RNA. Both colicins provoke cell death by inactivating the protein biosynthetic machinery. Colicin producer cells are protected against both endogenous and exogenous toxin molecules by the constitutive expression of a cognate immunity protein, which forms a tight heterodimer complex with the nuclease domain of the colicin. The import of both colicins first requires the “hijack” of some distinct functions of the target cell (namely the BtuB/Tol and FepA/TonB systems, respectively), this allowing their translocation across the outer membrane. It has long been suggested that the import of nuclease colicins requires protein processing during the translocation across the inner membrane; however it had never been formally demonstrated. Our work shows that the two different RNase colicins E3 and D undergo a processing step inside the cell that is essential to their killing action. We have detected the presence of the C-terminal catalytic domains of these colicins in the cytoplasm of target bacteria. The same processed forms (PF) were identified in both colicin-sensitive cells and in cells immune to colicins, because of the expression of the cognate immunity protein. We demonstrate that the inner membrane protease FtsH is necessary for the processing of colicins D and E3 during their import. We also show that the signal peptidase LepB interacts directly with the central domain of colicin D in vitro and that it is a specific but not a catalytic requirement for in vivo processing of colicin D. The interaction of colicin D with LepB may ensure a stable association with the inner membrane that in turn allows the colicin recognition by FtsH. We have also shown that the outer membrane protease OmpT is responsible for alternative and distinct endoproteolytic cleavages of colicins D and E3 in vitro, presumably reflecting its known role in the bacterial defense against antimicrobial peptides. Even though the OmpT-catalyzed in vitro cleavage also liberates the catalytic domain from colicins D and E3, it is not involved in the processing of nuclease colicins during their import into the cytoplasm

Le régulateur transcriptionnel BAP1 est une déubiquitinase nucléaire (DUB) dont le substrat est l’histone H2A modifiée par monoubiquitination au niveau des residus lysines 118 et 119 (K118/K119). Depuis les dernières années, BAP1 emerge comme un gene suppresseur de tumeur majeur. En effet, BAP1 est inactivé dans un plethore de maladies humaines héréditaires et sporadiques. Cependant, malgré l’accumulation significative des connaissances concernant l’occurrence, la pénétrance et l’impact des défauts de BAP1 sur le développement de cancers, ses mécanismes d’action et de régulation restent très peu compris. Cette étude est dédiée à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du complexe multi-protéique de BAP1 et se présente parmi les premiers travaux décrivant sa régulation par des modifications post-traductionnelles. D’abord, nous avons défini la composition du corps du complexe BAP1 ainsi que ses principaux partenaires d’interaction. Ensuite, nous nous sommes spécifiquement intéressés a investiguer d’avantage deux principaux aspects de la régulation de BAP1. Nous avons d’abord décrit l’inter-régulation entre deux composantes majeures du complexe BAP1, soit HCF-1 et OGT. D’une manière très intéressante, nous avons trouvé que le cofacteur HCF-1 est un important régulateur des niveaux protéiques d’OGT. En retour, OGT est requise pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant sa protéolyse par O-GlcNAcylation, un processus de régulation très important pour le bon fonctionnement de HCF-1. D’autre part, nous avons découvert un mécanisme unique de régulation de BAP1 médiée par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. en effet, UBE2O se caractérise par le fait qu’il s’agit aussi bien d’une ubiquitine conjuratrice et d’une ubiquitine ligase. UBE2O, multi-monoubiquitine BAP1 au niveau de son domaine NLS et promeut son exclusion du noyau, le séquestrant ainsi dans le cytoplasme. De façon importante, nos travaux ont permis de mettre de l’emphase sur le rôle de l’activité auto-catalytique de chacune de ces enzymes, soit l’activité d’auto-déubiquitination de BAP1 qui est requise pour la maintenance de sa localisation nucléaire ainsi que l’activité d’auto-ubiquitination d’UBE2O impliquée dans son transport nucléo-cytoplasmique. De manière significative, nous avons trouvé que des défauts au niveau de l’auto-déubiquitination de BAP1 due à des mutations associées à certains cancers indiquent l’importance d’une propre regulation de cette déubiquitinase pour les processus associés à la suppression de tumeurs. / BAP1 is a nuclear deubiquitinating enzyme (DUB) that acts as a transcription regulator and a DUB of nucleosomal histone H2AK119. In the recent years, it has become clear that BAP1 is a major tumor suppressor, inactivated in a plethora of hereditary and sporadic human malignancies. Although, we now accumulated a significant body of knowledge in respect to the occurrence, penetrance and impact of BAP1 disruption in cancer, its mechanism of action and regulation remained poorly defined. This work is dedicated to the biochemical and functional characterization of the BAP1 multiprotein complex and presents one of the first cases regarding its regulation by post-translational modifications. First, we defined the initial composition of the BAP1 complex and its main interacting components. Second, we specifically focused on two aspects of BAP1 regulation. We described the cross regulation between the two major components of the complex namely HCF-1 and OGT. We found that HCF-1 is important for the maintenance of the cellular levels of OGT. OGT, in turn, is required for the proper maturation of HCF-1 by promoting O-GlcNAcylation-mediated limited proteolysis of its precursor. Third, we discovered an intricate regulatory mechanism of BAP1 mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. UBE2O multi-monoubiquitinates BAP1 on its NLS and promotes its exclusion from the nucleus. Importantly, our work emphasises the role of the autocatalytic activity of both enzymes namely the auto-deubiquitination activity of BAP1, required for the maintenance of nuclear BAP1 and the auto-ubiquitination of UBE2O implicated in its nucleocytoplasmic transport. Significantly, we found that auto-deubiquitination of BAP1 is disrupted by cancer-associated mutations, indicating the involvement of this process in tumor suppression.

L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle importante pour le contrôle de nombreux processus cellulaires, est une réaction réversible. La réaction inverse, nommée déubiquitination est catalysée par les déubiquitinases (DUB). Nous nous sommes intéressés dans nos travaux à étudier l’ubiquitination de l’histone H2A (H2Aub), au niveau des résidus lysines 118 et 119 (K118/K119), une marque épigénétique impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Le régulateur transcriptionnel BAP1, une déubiquitinase nucléaire, a été initialement identifié pour sa capacité à promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 forme un complexe multi-protéique avec plusieurs facteurs transcriptionnels et sa fonction principale est la déubiquitination de H2Aub. Plusieurs études ont démontré que BAP1 est un gène suppresseur de tumeurs majeur et qu’il est largement muté et inactivé dans une multitude de cancers. En effet, BAP1 émerge comme étant la DUB la plus mutée au niveau des cancers. Cependant, le ou les mécanismes d’action et de régulation du complexe BAP1 restent très peu connus. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des partenaires protéiques de BAP1. De manière significative nous avons caractérisé un mécanisme unique de régulation entre deux composants majeurs du complexe BAP1 à savoir, HCF-1 et OGT. En effet, nous avons démontré que HCF-1 est requis pour maintenir le niveau protéique de OGT et que cette dernière est indispensable pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant son clivage par O-GlcNAcylation, une signalisation cellulaire nécessaire au bon fonctionnement de HCF-1. Également, nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation de BAP1 par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. En effet, UBE2O agit comme un régulateur négatif de BAP1 puisque l’ubiquitination de ce dernier induit sa séquestration dans le cytoplasme et l’inhibition de sa fonction suppressive de tumeurs. D’autre part nous nous sommes penchés sur la caractérisation de l’association de BAP1 avec deux facteurs de la famille des protéines Polycombes nommés ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2). Nous avons investigué le rôle de BAP1/ASXL1/2, particulièrement dans les mécanismes de déubiquitination et suppression de tumeurs. Nous avons démontré que BAP1 interagit directement iii via son domaine C-terminale avec le même domaine ASXM de ASXL1/2 formant ainsi deux complexes mutuellement exclusifs indispensables pour induire l’activité déubiquitinase de BAP1. De manière significative, ASXM s’associe avec BAP1 pour créer un nouveau domaine composite de liaison à l’ubiquitine. Ces interactions BAP1/ASXL1/2 régulent la progression harmonieuse du cycle cellulaire. De plus, la surexpression de BAP1 et de ASXL2 au niveau des fibroblastes induit la sénescence de manière dépendante de leurs interactions. D’autre part, nous avons identifié des mutations de cancers au niveau de BAP1 le rendant incapable de lier ASXL1/2, d’exercer sa fonction d’autodéubiquitination et de ce fait d’agir comme suppresseur de tumeurs. Ainsi nous avons révélé un lien étroit entre le gène suppresseur de tumeurs BAP1, son activité déubiquitinase et le contrôle de la prolifération cellulaire. / The reverse reaction of ubiquitination, a crucial post-translational modification, is catalyzed by deubiquitinases (DUBs). BAP1 is an ubiquitously expressed nuclear DUB that recently emerged as an important tumor suppressor highly mutated and inactivated in an increasing number of cancers of diverse origins. Both somatic and germline mutations with loss of heterozygosity were observed in tumors, making BAP1 the most mutated DUB in human malignancies. We previously reported that BAP1 is a component of a large multi-protein complex that includes several transcription regulators. The Drosophila homologue of BAP1, Calypso, forms the Polycomb-repressive DUB (PR-DUB) complex with Additional Sex Comb, ASX. This complex catalyzes the deubiquitination of histone H2A, an essential chromatin modification that regulates gene expression. Despite the ever increasing number of findings describing the occurrence of BAP1 mutations in cancers, few studies investigated the mechanisms of action of this DUB as a tumor suppressor. Therefore, the biological function and the mechanism of action and regulation of BAP1 remains largely uncharacterized. In the work described in this thesis, we investigated the roles of BAP1 partners in modulating its catalytic activity and tumor suppressor function. More specifically we discovered a unique mechanism of regulation between two major components of BAP1 complexes, namely HCF-1 and OGT. Indeed, HCF-1 is important for the maintenance of the cellular levels of OGT. OGT, in turn, is required for the proper proteolytic maturation of HCF-1 by promoting its O-GlcNAcylation. This signaling event is required for HCF-1 function as a cell cycle regulator. On the other hand, we deciphered an intricate mechanism of regulation of BAP1 by the atypical E2/E3 ligase, UBE2O. UBE2O, promote the multi-monoubiquitination of BAP1 on its NLS mediating its cytoplasmic sequestration and thus inhibition of its tumor suppressor function. Another aspect of modulation of BAP1 H2Aub catalysis is provided by the association of BAP1 with ASXL1 and ASXL2 (ASXL1/ASXL2), two orthologs of ASX. We investigated the role of BAP1/ASXL1/2, particularly in the mechanisms of deubiquitination and tumor suppression. We have demonstrated that BAP1 interacts directly via its C-terminal domain with the ASXM domain of ASXL1/2, thus forming two mutually exclusive complexes. Significantly, ASXM promote, through assembly with BAP1, the generation of a composite ubiquitin binding domain (CUBI), indispensable for inducing the deubiquitinase activity of BAP1 towards H2Aub. The interactions between BAP1 and ASXL1/2 regulate cell cycle progression. In addition, overexpression of BAP1 or ASXL2 in fibroblasts induces senescence in CTD- and ASXM-dependent manner. We also identified cancer-derived mutation of BAP1 that selectively abolish its interaction with ASXL1 and ASXL2 as well as its H2A deubiquitinase activity. Significantly, this mutant suppressed senescence induced by BAP1 overexpression. Thus we provided a link between the tumor suppressor BAP1, its deubiquitinase activity and the control of cell proliferation.