O recente desenvolvimento de técnicas proteômicas tem permitido a análise do perfil proteico completo dos sistemas biológicos, permitindo um melhor entendimento da fisiologia normal do organismo, bem como dos mecanismos de doenças, descoberta de biomarcadores para detecção precoce de doenças, identificação de novas terapias e descobertas de fármacos. No presente trabalho, a análise proteômica foi usada para auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na intoxicação induzida pelo fluoretono fígado de ratos e definir biomarcadores potenciais de toxicidade. Três grupos de ratos Wistar machos recém-desmamados (21 dias de vida) foram tratados ad libitum com água de beber contendo 0 (controle), 5 ou 50 mg/L de fluoreto, por 60 dias (n=6/grupo). Os animais foram eutanasiados e o fígado e o soro foram coletados. O fígado foi dividido em lobos, sendo que o esquerdo foi destinado à dosagem de fluoreto (eletrodo íon-sensível, após difusão facilitada por hexametildisiloxano), o direito à análise histológica (hematoxilina e eosina) e o mediano, à análise proteômica (eletroforese bidimensional associada a LC-MS/MS). Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (p<0,05). Foi possível detectar uma dose-resposta em relação à ingestão para os níveis de fluoreto presentes no soro e no fígado houve diferença significativa entre os grupos que receberam 5 e 50 mg/L de fluoreto. A análise morfométrica histológica não revelou alterações nas estruturas celulares e exame o morfológico indicou inclusões lipídicas nos grupos 5 mg/L e 50 mg/L de fluoreto, mais intensas no último. A análise quantitativa de intensidade (software ImageMaster 2D-Platinum v 7.0), comparando a porcentagem de alteração de volume do spot protéico, revelou que 33, 44 e 29 spots aumentaram ou diminuíram sua expressão nos grupos controle X 5 mg/L, controle X 50 mg/L e 5 mg/L X 50 mg/L de fluoreto, respectivamente. Além disto, foram encontradas 18, 1 e 5 spots exclusivos nos grupos controle, 5 mg/L e 50 mg/L de fluoreto, respectivamente. Dentre os spots proteínas com expressão diferencial, foram identificadas 94 proteínas (72,3%). Em síntese, a exposição ao fluoreto alterou a expressão a nível hepático de proteínas pertencentes a todas as categorias funcionais, com predominância daquelas relacionadas ao metabolismo, sendo que as alterações mais pronunciadas foram observadas no grupo de 50 mg/L de fluoreto. Proteínas que tiveram sua expressão ausente mediante exposição ao fluoreto ou que tiveram sua expressão induzida por este elemento são potenciais biomarcadores para este tipo de exposição e devem ser melhor investigadas. Uma vez que se trata do primeiro trabalho envolvendo análise proteômica de fígado de animais expostos a diferentes doses de fluoreto, estes achados apontam importantes vias e processos celulares afetados no fígado pela exposição ao fluoreto, os quais devem ser melhor analisados em estudos futuros. / The recent development of proteomic techniques allowed the analysis of the whole proteomic profile of the biological systems, allowing the comprehension of the normal physiology, as well as of the mechanisms underlying diseases. It has also made easier the discovery of biomarkers of diseases, as well as the identification of new therapies and drugs. In the present study, proteomic analysis was used as a tool to help understanding the molecular mechanisms underlying chronic fluoride toxicity in rat liver and also to define potential biomarkers of toxicity. Three groups of weanling male Wistarrats (21 days) were treated ad libitum with drinking water containing 0 (control), 5 or 50 mg/L fluoride for 60 days (n=6/group). After euthanasia, liver and serum were collected. The liver was divided into lobes. The left lobe was used for fluoride analysis (ion-sensitive electrode, after hexamethyldisiloxane-facilitated diffusion). The right lobe was used for histological analysis (hematoxylin and eosine) while the median was used for proteomic analysis (2D-PAGE associated with LC-MS/MS). Data were analysed by ANOVA and Tukeys test, (p<0.05). A dose-response relationship was observed for serum fluoride levels. In liver, a significant increase in fluoride levels was observed in the 50 mg/L group when compared with the 5 mg/L group. Morphometric analysis did not reveal alterations in the cellular structures. The morphological exam revealed macrovesicular lipid droplets in the 5 and 50 mg/L groups which were more intense in the later. Quantitative intensity analysis (software ImageMaster 2D-Platinum v 7.0) comparing the percentage of alteration of volume of protein spots revealed 33, 44 and 29 protein spots that had increase or decrease in expression in the groups control X 5 mg/L, control X 50 mg/L and 5 mg/L X 50 mg/L, respectively. In addition, 18, 1 and 5 protein spots were detected exclusively in groups control, 5 mg/L and 50 mg/L, respectively. From the differentially expressed spots, 94 proteins were satisfactorily identified (72.3%). Briefly, exposure to fluoride altered the expression of liver proteins belonging to all the functional categories, especially those related to metabolism. More pronounced alterations were seen for the 50 mg/L group. Proteins that were not detected upon exposure to fluoride or that had their expression induced in the presence of fluoride are potential biomarkers of toxicity and should be better investigated. Since this is the first study involving proteomic analysis of liver in rats exposed to different doses of fluoride, these findings indicate important pathways and cellular processes affected by exposure to this element that should be addressed in details in future studies.

O flúor é comprovadamente um agente terapêutico contra a cárie dentária, porém, quando consumido de maneira inadequada pode causar reações indesejáveis, tanto crônicas como agudas. A proteômica é uma ferramenta que permite analisar o perfil proteico completo dos sistemas biológicos, permitindo um melhor entendimento da fisiologia normal do organismo, bem como dos mecanismos de doenças, descoberta de biomarcadores para detecção precoce de doenças, identificação de novas terapias e descobertas de fármacos. Assim, o presente estudo teve como trabalho realizar um estudo proteômico diferencial em amostras de tecido renal de ratos submetidos à intoxicação aguda por fluoreto. Para isso, 27 animais, receberam desde o desmame água deionizada e ração AIN-93 por 50 dias. Ao completarem 75 dias de vida, e, após jejum por 12 horas, os animais receberam via gástrica as seguintes doses agudas de F: 0 (controle), 50 e 100 mgF/Kg peso corporal. Após 2 horas foram, os animais foram anestesiados e tiveram o sangue e os rins coletados. Inicialmente foi realizada a dosagem de flúor no plasma e tecidos renais, após difusão facilitada por hexamethyldisiloxano. Em um segundo momento, as proteínas do tecido renal foram extraídas e submetidas à eletroforese bidimensional. Os géis obtidos foram analisados através do software ImageMaster 2D-platinum v. 7.0. Os spots que se apresentaram diferencialmente expressos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas. As proteínas identificadas foram classificadas em 5 categorias funcionais. A categoria metabolismo e energia reuniu a maior parte das proteínas (40%), seguida pelas categorias de transporte e processos celulares com 20% e 13% respectivamente. Na categoria estrutura e organização estrutural, que reúne proteínas com funções relacionadas ao citoesqueleto e membrana celular, foram identificadas 17% das proteínas. Por fim, os 10% restantes das proteínas pertenciam à categoria vias de informação, que abriga proteínas envolvidas nos processos de síntese/degradação de DNA e RNA. Com base nos resultados obtidos pode se concluir que doses agudas de fluoreto alteram a expressão a nível renal de diversas proteínas relacionadas a distintos processos celulares. / Fluoride has been widely used in dentistry as a caries prophylactic agent. However, if consumed in high concentrations, it can cause side effects as dental fluorosis, skeletal fluorosis and, in extreme situations, death. The recent development of proteomic techniques has allowed the analysis of the entire protein profile of biological systems, contributing to the understanding of the normal physiology of the organism, as well as the mechanisms of diseases and the investigation of biomarkers for their early detection, identification of new therapies and drugs. This study used proteomic techniques to analyze the differential protein expression in kidney of rats submitted to acute fluoride treatments. Three groups of five 75-day-old Wistar rats received, by gastric gavage, the following single doses of fluoride: 0 (control), 50 and 100 mgF/Kg body weight. After the treatments, the animals were killed and the left kidney and plasma were collected for fluoride analysis. For proteomic analysis, the right kidney was collected. Fluoride in plasma and renal tissues was analyzed with the electrode, after hexamethyldisiloxanefacilitated diffusion. Proteins from kidney were profiled by two-dimensional gel electrophoresis. Gels from control and treated groups were digitalized using the ImageScanner III and analyzed with ImageMaster 2D Platinum version 7.0 for statistical differences (ANOVA, p <0.05). The proteins identified were classified into five functional categories. The category of metabolism and energy had the majority of the proteins (40%), followed by the categories of \"transport\" and cell processes, with 20% and 13% of the proteins, respectively. In the category \"structure and cell organization, which brings together proteins with functions related to the cytoskeleton and plasma membrane were identified 17% of the protein. Finally, 10% of the proteins belonged to the category \"information pathways\", which comprises the proteins involved in the processes of synthesis and degradation of DNA and RNA. Based on the results obtained, it can be concluded that acute doses of fluoride alters the expression of several proteins related to different cellular processes in the kidneys.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T12:42:14Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Karollina Lopes.pdf: 3113025 bytes, checksum: 4beb50fc12c91663e6d2118f10865bf1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T12:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Karollina Lopes.pdf: 3113025 bytes, checksum: 4beb50fc12c91663e6d2118f10865bf1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq; FACEPE; CAPES / Atualmente a espécie Oreochromis niloticus é uma das principais espécies cultivadas no país tanto por suas características biológicas, que permitem um fácil manejo e quanto por sua carne ser de grande aceite comercial. O cultivo desses animais pode ser de dois tipos: semi-intensivo – onde há a utilização de adubos para aumentar a produção, a alimentação se dá pela inserção de ração comercial e o alimento natural pode suprir uma possível falta de proteína; intensivo – caracteriza-se pela alta produção e a alimentação é completamente comercial. Sabendo da grande influência que a forma de cultivo exerce sobre os animais, o presente estudo objetivou analisar o crescimento zootécnico dos animais submetidos aos dois tipos de cultivo, analisar as atividades enzimáticas de proteases presentes no intestino desses animais e obter e comparar os perfis proteômicos do estômago e intestino desses peixes, para tentar elucidar algumas formas de adaptação desses animais aos sistemas semi-intensivo e intensivo de cultivos. Os cultivos foram realizados, durante 120 dias, com dois tipos de planos nutricionais. Foram realizadas biometrias durante todo o período dos cultivos, a partir das quais os parâmetros zootécnicos foram calculados. Após os cultivos houve a coleta dos animais, os quais tiveram seus intestinos e estômagos retirados. Um extrato bruto foi preparado para o ensaio das atividades enzimáticas: protease total com azocaseína como substrato e tripsina utilizando BApNA como substrato. Para os perfis proteômicos foram feitos géis 2D-PAGE utilizando fitas de 13 cm e pH na faixa de 3-10. Pela análise do crescimento zootécnico, apenas os parâmetros de peso médio final, conversão alimentar e sobrevivência foram estatisticamente diferentes. Quanto às atividades enzimáticas, essas não se mostraram estatisticamente diferentes e mostraram um mesmo padrão ao longo do tempo. Nos perfis proteômicos dos intestinos pode-se detectar 731 spots diferentes, na análise do estômago foi observada a presença de 543 spots diferenciais. Com isso, o presente trabalho conclui que os sistemas de cultivo influenciaram diretamente os animais. Os presentes resultados contribuem na elucidação da influência dos fatores dos sistemas sobre o crescimento e a fisiologia digestivas da tilápia do Nilo.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-25T11:19:27Z No. of bitstreams: 1 Lorena Tavares de Brito Nery.pdf: 670015 bytes, checksum: e0b8afb3dbe46a644d2947148f87433c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-25T11:19:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena Tavares de Brito Nery.pdf: 670015 bytes, checksum: e0b8afb3dbe46a644d2947148f87433c (MD5) Previous issue date: 2013-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study objective to investigate the profile protein of the seminal plasma in dogs chemically sterilized. Three dogs, pubescent mongrel, were submitted for two semen collections before (D0) and 60 days after chemical castration (D60). Semen samples were analyzed (concentration spermatic, motile, vigor and volume) and centrifuged to obtain seminal plasma. An aliquot containing 400 mg total protein were subjected to 2-D electrophoresis (18% SDS-PAGE, pH 4.7) gels and analyzed by the PD Quest software. The concentration spermatic, motile, viability and ejaculate volume were within normal physiological standards for dogs. Was (220.6 ± 10.97 X 106 sperm / mL, 80%, 3.3 ± 1.53 and 5 mL, respectively). Sixty days after chemical castration all animals were azoospermic but continued to ejaculate the seminal plasma whose volume was 3.67 ± 2.68 mL. The most abundant proteins in the seminal plasma dog are around 12 kDa and pH range from 4.2 to 6.6. These proteins corresponded to 61.68% of total seminal plasma-protein dog, being found 167.3 ± 23.6 spots protein did not differ between D0 and D60. Since the prostate is an androgen-dependent organ responsible for most of the secretion of seminal plasma canine. Oliveira et al (2012) demonstrated that chemical castration has no effect on serum testosterone levels in dogs. However, Wang (2002) reported that after 24 months of intratesticular injection of zinc prostate showed a reduction of 52% of its original size. We conclude that 60 days is not enough to promote changes in the protein electrophoretic pattern in seminal plasma of dogs subjected to chemical castration. / Esse estudo, objetivou verificar o perfil proteíco do plasma seminal de cães esterilizados quimicamente. Três cães, púberes, sem raça definida, foram submetidos há duas coletas de sêmen antes (D0) e 60 dias após a castração química (D60). As amostras de sêmen foram analisadas (concentração, motilidade, vigor e volume) e centrifugadas para obtenção do plasma seminal. Em seguida, alíquotas contendo 400 μg de proteína total foram submetidas a eletroforese 2-D (18% SDS-PAGE, pH 4-7) e os géis analisados pelo Software PD Quest. A concentração, motilidade, vigor e volume do ejaculado encontravam-se dentro dos padrões fisiológicos de normalidade para a espécie canina. Foram (220,6 x 106 ± 10,97 sptz/mL, 80%, 3,3 e 5 ± 1,53 mL, respectivamente). Sessenta dias após a castração química todos os animais encontravam-se azoospérmicos mas continuaram a ejacular o plasma seminal cujo volume foi de 3,67 ± 2,68 mL. As proteínas mais abundantes do plasma seminal de cão encontram-se em torno de 12 kDa e na faixa de pH de 4.2 a 6.6. Estas proteínas correspondem a 61,68% do total proteíco do plasma seminal do cão, sendo encontrados 167,3 ± 23,6 spots proteícos que não diferiram entre D0 e D60. A próstata é um órgão andrógeno-dependente e responsável pela maior parte da secreção do plasma seminal canino, sua função mateve-se inalterada no presente estudo. Oliveira et al (2012) demonstraram que a castração química não exerce influência sobre os níveis séricos de testosterona em cães. No entanto, Wang (2002) relatou que após 24 meses da injeção intratesticular de zinco a próstata apresentou uma redução de 52% do seu tamanho original. Conclui-se que 60 dias não é suficiente para promover alterações do perfil eletroforético proteico no plasma seminal de cães submetidos a castração química.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-03-08T16:58:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Juliana Gusmão de Araujo.pdf: 5234646 bytes, checksum: 87f79f1087a57c64407eda5226cb557f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T16:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Juliana Gusmão de Araujo.pdf: 5234646 bytes, checksum: 87f79f1087a57c64407eda5226cb557f (MD5) Previous issue date: 2012-12-26 / O colesteatoma adquirido, mesmo com os conhecimentos acumulados desde sua primeira descrição, ainda se mantém como um problema de saúde pública distante de ser solucionado. O entendimento mais profundo da patogênese do colesteatoma é de extrema importância visto que a natureza desta lesão é destrutiva e causadora de complicações potencialmente graves. Apesar das teorias propostas e das várias proteínas terem sido identificados no colesteatoma, a verdadeira etiopatogenia da doença ainda carece de investigações. Objetivo: Identificar biomarcadores do colesteatoma adquirido utilizando a plataforma proteômica. Casuística e Métodos: Foram coletadas amostras de colesteatoma e também fragmento de pele da região retroauricular de 12 indivíduos submetidos a cirurgia para remoção do colesteatoma. As amostras foram armazenadas em solução salina e mantidas a -20ºC até pesagem tecidual e extração das proteínas. Eletroforese bidimensional foi realizada, os géis foram corados com nitrato de prata e suas imagens digitalizadas. Todas as análises foram realizadas em triplicatas. Os peptídeos extraídos após a digestão do spots foram levados à espectrometria de massa e os espectros obtidos foram analisados usando o algoritmo Mascot utilizando os bancos de dados de proteína do NCBI e SwissProt. Resultados: Dos 393 spots identificados na análise do extrato proteico de colesteatoma adquirido, apenas 10 estavam dentro dos parâmetros estatísticos aceitáveis pelo algoritmo Mascot. As principais proteínas detectadas no colesteatoma adquirido foram a cadeia beta do fibrinogênio, proteína da matriz extracelular 2, actina citoplasmática 1, heparan sulfato glucosamina 3-O-sulfotransferase 3A1, fator de necrose tumoral alfa induzido proteína 8-like 1, Stanniocalcina-2, lisofosfolipase eosinofílica e OFUT1.Conclusão: Foram identificadas proteínas envolvidas com a migração celular, regulação da apoptose, vias de sinalização, hiperproliferação celular, cicatrização e processos inflamatórios. Pudemos, desta maneira, traçar um perfil proteômico do colesteatoma adquirido. / The acquired cholesteatoma, even with all the knowledge accumulated since its first description, still remains a public health problem, far from being solved. A deeper understanding of its pathogenesis is extremely important since it is a destructive lesion that might cause potentially serious complications. Several proteins have been identified in cholesteatoma and a few theories were described, however the true etiology of the disease still needs investigation. Objective: Identify acquired cholesteatoma biomarkers using proteomics platform. Patients and methods: Cholesteatoma samples were collected and also a skin fragment of the surgical incision of twelve patients undergoing surgery for cholesteatoma removal. The samples were stored in saline solution and kept at -20 ° C until weighing tissue and proteins extraction. Two-dimensional electrophoresis was conducted, the gels were stained with silver nitrate and their images were digitized. All analyzes were performed in triplicate. The peptides extracted after spots digestion were taken to mass spectrometry and the spectra obtained were analyzed using the Mascot algorithm comparing databases of the NCBI and SwissProt protein. Results: Of the 393 spots identified in the analysis of protein extracts of acquired cholesteatoma, only 10 were within acceptable statistical parameters by Mascot algorithm. The proteins detected in acquired cholesteatoma were fibrinogen beta chain, extracellular matrix protein 2, actin cytoplasmic 1, heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 3A1, tumor necrosis factor alpha 8 induced proteinlike 1, stanniocalcin-2, eosinophil lysophospholipase and OFUT1. Conclusion: Proteins involved in cell migration, regulation of apoptosis, signaling pathways, cellular proliferation, wound healing and inflammatory processes were identified. We were able to draw a proteomic profile of acquired cholesteatoma.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-09-06T11:45:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1440010 bytes, checksum: cb2d4ec526e6d344066f457ac1dcb840 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-06T11:45:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1440010 bytes, checksum: cb2d4ec526e6d344066f457ac1dcb840 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A cigarrinha-das-pastagens, Mahanarva spectabilis (Distant,1909) é a principal praga em forrageiras na América Tropical. Este inseto entra em diapausa na fase de ovo durante as estações desfavoráveis do ano. Informações sobre os processos de desenvolvimento da diapausa das cigarrinhas das pastagens e a reprogramação de defesas das plantas durante a colonização do inseto são necessárias para auxiliar no desenvolvimento de táticas de seu controle. Por meio de análises proteômicas nós identificamos e caracterizamos proteínas envolvidas em ovo de M. spectabilis durante a diapausa, não-diapausa e pós-diapausa. Essas estão envolvidas no processamento de informações, sinalização celular e metabolismo dos ovos deste inseto. Na segunda etapa deste trabalho foi detectado a presença de efetores nas glândulas salivares de Mahanarva spectabilis, tais como ácidos graxos de cadeia longa e ácido salicílico que podem estar envolvidos no processo de infestação de plantas de capim- elefante. Também foi confirmado e caracterizado a presença de apirases nas glândulas salivares das M. spectabilis, evidenciando que esta enzima interfere na modulação de resistência da planta. As análises fitohormonais das folhas de capim elefante indicam uma flutuação nos níveis de hormônios em função do tempo de infestação. Estes resultados nos permitem propor que efetores presentes nas glândulas salivares de cigarrinha das pastagens são responsáveis por suprimir a resposta de defesa da planta, tornando-se uma estratégia bem sucedida do inseto na colonização do hospedeiro. / The spittlebugs, Mahanarva spectabilis (Distant, 1909) is a major pest in forages in tropical America. This insect enters diapausa in the egg phase during the unfavorable seasons of the year. Information on the processes of development of spittlebugs tasks and reprogramming of plants during livestock colonization are necessary to assist in the development of their control tactics. By means of proteotic proteins we identified and characterized the egg proteins of M. spectabilis during a diapause, non-diapause and post-diapause. Cells are involved in information processing, cell signaling and egg metabolism of this insect. On Monday of this year the presence of effectors in the salivary glands of M. spectabilis, such as long-lasting fatty acids and salicylic acid, that are involved in the infestation process of elephantgrass plants were detected. It was also confirmed and marked an apirinal presence in the salivary glands of M. spectabilis, evidencing that this enzyme interferes in the modulation of resistance of the plant. Phytohormonal analyzes of elephantgrass leaves are indicated for fluctuation in hormone levels as a function of time of infestation. The results in relation to the proportion that the indicators present in the spittlebugs salivary gland glands are responsible for suppressing a defense response of the plant, becoming a successful strategy in the fight against host colonization.

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pilau_EduardoJorge_D.pdf: 5051807 bytes, checksum: 376ee3a4968e0ab254d7cda0cccd2819 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) consiste no estudo dos íons em fase gasosa, tendo como uma das suas principais aplicações a caracterização estrutural de moléculas. Desde o início da técnica, ela vem sendo empregada na elucidação estrutural de um grande número de moléculas orgânicas e é hoje uma das principais ferramentas de caracterização estrutural. Dentro os métodos baseado em MS para o estudo de estruturas superiores de proteínas desenvolvidos recentemente estão aqueles conhecidos como footprinting e ligação cruzada (cross-linking). Nesta tese, estudos foram realizados para o desenvolvimento, melhorias e otimização de técnicas de footprinting e ligação cruzada acopladas à espectrometria de massas para o estudo estrutural de proteínas. Em footprinting, foram desenvolvidas fontes alternativas de radiação UV para geração de radicais ¿OH a partir da fotólise do H2O2 para mapeamento da superfície exposta ao solvente de proteínas, bem como o desenvolvimento de uma técnica mais apropriada de quantificação de peptídeos oxidados. Os resultados obtidos demonstraram que as fontes propostas apresentaram boa eficiência no processo de fotólise do H2O2 Na técnica de ligação cruzada, foram realizados estudos fundamentais a respeito da reatividade dos Agentes de Ligação Cruzadas (ALC¿s) tanto com relação à especificidade dos ALC¿s frente às cadeias laterais dos aminoácidos quanto à cinética da reação com proteínas e reação competitiva de hidrólise. Nos experimentos realizados foi possível verificar a reatividade do ALC frente a diferentes grupos nucleofilicos presentes nas cadeias laterais dos resíduois de aminoacido bem como ser suscetivel a mudança de reatividade em virtude do pH utilizado. / Abstract: Mass spectrometry (MS) study ions in the gas phase, and one of its main applications is the structural characterization of molecules. Since the beginning of the technique, it has been used in structural study of a large number of organic molecules and is now a major tool for structural characterization. Among the MSbased methods for the study of higher structures of proteins are the newly developed methods of footprinting and cross-linking. In this thesis, studies were undertaken for the development, improvement and optimization of, footprinting and cross-linking coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins. In footprinting, we developed alternative sources of UV radiation to generate ¿OH radicals from the photolysis of H2O2 to map the solvent exposed surface of proteins as well as the development of a more appropriated technique for quantification of oxidized peptides. The results showed that the proposed sources showed good efficiency in the process of photolysis of H2O2. For cross-linking, fundamental studies were carried out concerning the reactivity of the cross-linkers regarding both the specificity of ALC in respect to amino acid side chains and the kinetics of reaction with proteins as well as hydrolysis reaction. In the experiments it was possible to verify the reactivity of ALC against different nucleophilic groups present in side chains of amino acid residues as well as being susceptible to change in reactivity due to the pH used. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T16:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_AlexandreFerreira_M.pdf: 4503232 bytes, checksum: 318fe49b4915757d84f962093d8e4a25 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A aplicação da espectrometria de massas (MS) em análises proteômicas tem evoluído extensivamente, a ponto de se tornar rotineira no seqüenciamento e identificação de proteínas e determinação de modificações pós-traducionais. Entretanto, o uso de MS na análise de estruturas tridimensionais de proteínas é restrito, apesar das inúmeras vantagens potenciais que poderia apresentar nessa área. Nesse âmbito, a metodologia de ligação cruzada acoplada a MS visa obter informações estruturais de proteínas e complexos protéicos pela determinação de restrições espaciais de distância entre resíduos de aminoácidos, mediante reação com compostos bifuncionais, proteólise enzimática e análise dos peptídeos resultantes por MS. A primeira parte deste trabalho descreve a aplicação de um novo agente de ligação cruzada (ALC) heterobifuncional e clivável, contendo um grupo fotoativável do tipo diazirina, para formar ligações cruzadas em peptídeos e proteínas. O emprego desse ALC permitiu obter ligações cruzadas únicas nos alvos estudados, e os peptídeos modificados assim formados foram caracterizados por MS/MS, possibilitando a descoberta de um íon marcador característico para peptídeos ligados por esse ALC. A segunda parte do trabalho envolveu a aplicação da técnica de mobilidade iônica TWIM acoplada a MS na análise de íons de proteínas antes e após modificação por ALC, visando avaliar o efeito dessas modificações em termos de variações de seção de choque de colisão (CCS). Análises assim feitas demonstraram a presença de estruturas mais rigidas e com menor CCS após a adição de moléculas de ALC, evidenciando a existência de conformações mais compactas em fase gasosa após a reação de ligação cruzada para proteínas. Para validar a metodologia, os valores de CCS experimentais foram comparados com valores teóricos calculados computacionalmente para estruturas disponíveis. / Abstract: The use of mass spectrometry (MS) in proteomics has evolved extensively, up to the point where it became routinely employed in protein sequencing and determination of post-translational modifications. However, the use of MS in structural studies of proteins is limited, despite the many advantages it could bring to the area. In this sense, chemical cross-linking coupled to mass spectrometry for structural studies of proteins aims to obtain structural information in terms of spatial distance restrictions, determined by intra- and intermolecular cross-links between side chains of amino acid residues. This is achieved by reaction of the target protein system with bifunctional compounds, followed by proteolysis and analysis of the modified peptides by MS. The first part of this work describes the application of a novel, heterobifunctional and cleavable cross-linker, containing a diazirine photoactivatable group, for cross-linking of peptides and proteins. Reaction with this cross-linker yielded unique cross-links for peptides and proteins, and such modified peptides where characterized by MS/MS, allowing the discovery of a marker ion, that may be used to identify cross-linked peptides. The second part of the work focused on the application of traveling-wave ion mobility (TWIM) coupled to MS for a comparative analysis of protein ions both before and after cross-linking reactions, aiming to evaluate the effect of these modifications on protein structures in terms of variation of collision cross sections (CCS) of their ions. TWIM-MS analysis of these systems demonstrated the presence of compact gas phase conformations of lower CCS after the cross-linking reaction and formation of intramolecular cross-links, indicating that chemical cross-linking restricts the structural dynamics of gas phase protein ions. To validate this method, experimental CCS values were then compared with theoretical values obtained computationally for available crystallographic or NMR structures. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Eduardo Galembeck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brum_ItarajuJuniorBaracuhy_M.pdf: 1893501 bytes, checksum: 59afb345a47fb8e963452a41b2327f1c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A área de proteômica visa estudar um conjunto completo de proteínas expressas por um organismo ou tecido numa dada situação, através da identificação e quantificação. Apesar de limitações nas técnicas disponíveis, vem se aumentando o volume de informações oriundos desta área, situação que exige o emprego de ferramentas computacionais para permitir o uso eficiente de dados disponíveis, além de buscar-se novas formas de análise destes. Este projeto visa o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática para aplicação em proteômica. Estas ferramentas abrangem as seguintes aplicações: Cálculo Teórico de Ponto Isoelétrico e Peso Molecular de seqüências de aminoácidos, eletroforese-bidimensional teórica, digestão teórica e simulação de eletroforese e identificação de peptídeos, ferramenta para análise de Vias Metabólicas a partir de dados de proteômica / Abstract: The proteomics field aims to study sets of proteins expressed in a cell or tissue, according to a specific situation, through protein identification and quantification. Though technical limitations do exist, the amount of information derived from this field increases each day. And so, there is a need for employing computational tools that enable efficient analysis of data. This project aims developing bioinformatics tools for application in proteomics. The tools here presented comprehend the following tasks: theoretical computation of isoeletric point and molecular weight of aminoacid sequences, theoretical two-dimensional electrophoresis, theoretical triptic digestion and electrophoresis simulation for peptide identification, and analysis of metabolic pathways with proteomics data / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marco Aurélio Zezzi Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T09:34:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_HerbertdeSousa_D.pdf: 1927584 bytes, checksum: 9e2393e5f41dc205496fac407f5f93ea (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Este trabalho de pesquisa consiste na comparação entre dois tipos de sementes de soja [Glycine max (L.) Merrill], transgênica e não-transgênica, em termos proteômicos e metaloproteômicos, de modo a avaliar possíveis diferenças existentes entre as amostras (Ex. diferença de expressão protéica, concentração das espécies metálicas e não-metálicas ligadas às biomoléculas). Para isso, inicialmente, as biomoléculas foram extraídas usando um tampão extrator específico e, após o tratamento adequado da amostra, separadas por meio da técnica de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) e caracterizadas por meio de técnicas de espectrometria de massas (MALDI-QTOF e ESI-QTOF) e identificadas por meio de buscas em banco de dados relacionados utilizando o programa Mascot, a partir dos dados gerados pelo espectrômetro de massas. Sendo assim, foram identificadas um total de 192 proteínas, sendo 13 proteínas na faixa de pH de 3 a 10 e 179 na faixa de pH de 4 a 7, sendo que esta última faixa de pH mostrou melhor resolução dinâmica na separação das proteínas. A distribuição funcional das proteínas identificadas mostrou que a maior parte (49%) destas estão envolvidas em armazenamento de nutrientes e atividade proteolítica, citando como exemplo deste grupo as proteínas glicina e b-conglicinina e suas subunidades. Para uma avaliação proteômica comparativa, com o intuito de se avaliar possíveis diferenças quanto à expressão das proteínas separadas entre as amostras avaliadas, foi utilizada a técnica de eletroforese em gel diferencial bidimensional (2D-DIGE), a partir de dados como intensidade e volume dos spots protéicos. Sendo assim, foram selecionadas um total de 04 proteínas diferenciais entre as amostras, sendo que todas foram identificadas via espectrometria de massas. Para uma avaliação metaloproteômica comparativa, um estudo para identificação de íons metálicos e semimetálicos livres ou ligados a proteínas foi realizado. Para isso, foi feita uma varredura semi-quantitativa de espécies metálicas e semimetálicas presentes nos extratos protéicos das sementes de soja transgênica e não-transgênica usando a técnica de ICP-MS, sendo que os íons Na, Mg, Si, K, Ti, Mn, Zn e Rb foram mais detectados na soja não-transgênica. Já o íon Cu foi mais detectado nas sementes de soja transgênica. Estes elementos diferenciais entre as amostras foram quantificados via ICP-MS. Além disso, os spots diferenciais obtidos com a técnica de 2D-DIGE foram avaliados quanto a presença de cobre, já que este elemento mostrou diferenças em concentrações em proteínas de soja, conforme trabalhos recentemente publicados na literatura pelo nosso grupo de pesquisa / Abstract: The research compairs two types of soybean [Glycine max (L.) Merrill], transgenic and non-transgenic, in terms of proteomics and metalloproteomics in order to evaluate possible differences among the samples (E.g. difference in protein expression, concentration of metal species and non-metal bounded to biomolecules). Therefore, initially, the biomolecules were extracted using a specific extration buffer and, after proper treatment of the sample, separated by the technique of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and characterized by mass spectrometry techniques (MALDI-QTOF and ESI-QTOF) and identified through searches related database using the Mascot program, from the data generated by mass spectrometer. Thus, we identified a total of 192 proteins, 13 proteins in the pH range 3 to 10 and 179 at pH 4-7, and this latest range of pH showed a better dynamic resolution in the separation of proteins. The functional distribution of identified proteins showed that most (49%) of these are involved in nutrient storage and proteolytic activity, citing as an example of this group glycinin and b-conglycinin and their subunits. For an evaluation of proteomics in order to evaluate possible differences in protein expression between the samples, the differential gel electrophoresis (2D-DIGE) technique was used based on data such as intensity and volume of proteins. Therefore, we selected a total of 04 differential proteins between samples, all of them were identified by mass spectrometry. For a comparative assessment metalloproteomics, a study for identification of metal ions and semimetal free or bound to proteins was performed. In this way, a semi-quantitative sweeping of semi-metal and metal species present in protein extracts of transgenic and non-transgenic soybean seeds was carried out using ICP-MS, and the ions Na, Mg, Si, K, Ti, Mn, Zn and Rb were detected in seeds of non-transgenic soybean. The ion Cu was detected in transgenic soybeans seeds. These differentials elements between the samples were quantified via ICP-MS. Moreover, the differential spots obtained with the 2D-DIGE technique were evaluated according to the presence of copper, since this element showed differences in concentrations in soybean proteins, as recently published in the literature by our research group / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências