Proteinúria é a principal manifestação da nefrite lúpica (NL) e reflete lesão no podócito. Análise dos biomarcadores do podócito foi realizada com o objetivo de identificar se o fenótipo podocitário é distinto na NL membranosa pura e proliferativa. Expressão de sinaptopodina, proteína 1 do tumor de Wilms (Wilms tumor protein 1 - WT1), proteína epitelial glomerular 1 (glomerular epitelial protein 1 - GLEPP1) e nefrina foi avaliada em 52 biópsias de NL por imunohistoquímica. Expressão preservada de sinaptopodina foi observada em apenas 10 (19,2%) de todas as biópsias enquanto que 42 (80,8%) apresentavam expressão reduzida. Ambos os grupos tinham proteinúria semelhante no momento da biópsia (p = 0,22), porém, no seguimento médio de quatro anos houve uma tendência para menores níveis médios de proteinúria nos pacientes com marcação preservada de sinaptopodina (0,26 ± 0,23 vs 0,84 ± 0,90 g/24 h, p = 0,05) do que naqueles com expressão reduzida. Trinta e nove (75%) biópsias foram classificadas como proliferativa e treze (25%) como membranosa pura. Comparação dos biomarcadores do podócito demonstrou predomíno de marcação preservada de sinaptopodina (69,2%), WT1 (69,2%), GLEPP1 (53,9%) e nefrina (60%) no grupo membranosa pura enquanto apenas < 10% das proliferativas apresentaram expressão preservada. Nossos dados sugerem que nas classes proliferativas parece haver lesão estrutural do podócito, enquanto que na membranosa pura o padrão predominantemente preservado sugere uma lesão funcional do podócito que pode ser responsável pelo melhor prognóstico a longo prazo do desfecho da proteinúria / Proteinuria is a major feature of lupus nephritis (LN) and reflects podocyte injury. Analysis of podocyte biomarkers was performed attempting to identify if podocyte phenotype is distinct in pure membranous and proliferative LN. Expression of synaptopodin, Wilms tumor protein 1 (WT1), glomerular epithelial protein 1 (GLEPP1) and nephrin was evaluated in 52 LN biopsies by immunohistochemistry. Preserved synaptopodin expression was observed in only 10 (19,2%) of all biopsies while 42 (80,8%) had a reduced expression. Both groups had comparable proteinuria at the time of biopsy (p=0,22), however, in the mean follow-up of four years there was a tendency to lower mean levels of proteinuria in patients with preserved synaptopodin staining (0,26 ± 0,23 vs. 0,84 ± 0,90 g/24 h, p=0,05) than those with diminished expression. Thirty-nine (75%) biopsies were classified as proliferative and thirteen (25%) as pure membranous. Comparison of podocyte biomarkers demonstrated a predominance of preserved staining of synaptopodin (69,2%), WT1 (69,2%), GLEPP1 (53,9%) and nephrin (60%) in the pure membranous group whereas only < 10% of the proliferative showed preserved expression. Our data suggest that in proliferative forms there seems to occur structural podocyte damage, whereas in the pure membranous the predominant preserved pattern suggests a dysfunctional podocyte lesion that may account for the better long-term prognosis of proteinuria outcome

Proteinúria (micro- e macroalbuminúria) identifica pacientes diabéticos com nefropatia diabética e/ou risco de doença cardiovascular e morte. Os três estudos que compõem este trabalho exploram aspectos de curso evolutivo, possibilidades de intervenção precoce e marcadores de predisposição para estas complicações. / Proteinuria (micro- and macroalbuminuria) identifies diabetic patients with nephropathy and/or those at risk of cardiovascular disease and death. The three studies that are part of this work explore aspects o f the evolution of kidney function, possibilities of early intervention, and markers of predisposition for these complications.

Durante a evolução da doença renal crônica (DRC) em cães, um dos mecanismos importantes envolvidos na autoperpetuação e progressão da lesão renal envolvem, teoricamente, o comprometimento inicial do glomérulo pelo mecanismo de hiperfiltração glomerular, e este processo pode acarretar no desenvolvimento de microalbuminúria ou de proteinúria pela presença de proteínas de alto peso molecular (albumina). Com o progredir da doença, as altas concentrações de proteína no filtrado glomerular pode também desencadear lesões tubulares e intersticiais, ocasionando a perda urinária também de proteínas de baixo peso molecular (PM) pelo comprometimento da reabsorção dessas proteínas pelos túbulos renais. Outras teorias de progressão da lesão renal também são suscitadas tais como o comprometimento inicial da porção túbulo-intersticial. Assim, espera- -se que durante a evolução da DRC, a avaliação das proteínas urinárias quanto à qualidade (determinação de albumina e os pesos moleculares) e a quantidade possam trazer informações relevantes sobre a velocidade de progressão e o local da lesão renal. O objetivo deste estudo foi de avaliar, sequencialmente, a albuminúria e a proteinúria (pelos métodos quantitativos e qualitativos - eletroforese de proteínas) dos cães com DRC nos estágios 1, 2 ou 3 ao longo do período de pelo menos 5 meses, e verificar a existência de alterações na intensidade ou no aparecimento de proteinúria e/ou albuminuria. Dezesseis cães (Grupo 1= 5 cães do estágio 1; Grupo 2= 5 cães do estágio 2 e Grupo 3= 6 cães do estágio 3), 9 fêmeas e 7 machos de raças variadas e idades entre 24 a 168 meses, foram acompanhados por 5 a 18 meses e os exames clínico e laboratorial realizados a cada 30 dias. Os cães dos Grupos 1 e 2 apresentaram bom controle clínico, entretanto o Grupo 3 apresentou evolução mais rápida da doença (3 cães vieram a óbito). No Grupo 1, o aumento da razão proteína:creatinina urinária (RPC; variação de 0,154 a 1,14) foi observada somente em um dos cães (no 1) e esta não era decorrente de albuminúria, mas sim da presença de proteínas de baixo peso molecular (lesão tubular) e também foi constatada diminuição progressiva da taxa de filtração glomerular pelo o aumento das concentrações de cistatina C sérica; os demais cães deste grupo apresentaram RPC e razão albumina:creatinina urinária (RAC) normais, entretanto com predomínio de proteínas de baixo peso molecular em 2 cães. No Grupo 2 fato semelhante também foi constatado, nos cães no 6 (inicialmente hipertenso) e 8 em que a RPC variou de 4,89 a 12,77 e 0,5 a 1,0, respectivamente; no cão no6 foi não foi detectada macroalbuminuria, mas somente microalbuminúria e com o predomínio de proteínas de baixo PM (lesão tubular), como também no cão no 8 (ausência de micro ou macroalbuminuria) em que houve o predomínio de 78 a 100% de proteínas de baixo PM e com 3 a 6 bandas. No Grupo 3, proteinúria foi constatada nos cães de no 11, 13 e 15 e a microalbuminúria somente no cão no11; o predomínio de proteínas de baixo PM foi observada nos cães no 11 e 13 e proteinúria mista no cão no 15. Assim, a avaliação sequencial ou seriada da proteinúria, pelo conjunto de informações obtido pela RPC, RAC e eletroforese de proteínas urinárias nos com cães com doença renal crônica, ao longo de um período, trouxe informações mais precisas acerca da qualidade das proteínas, identificando os segmentos do néfron que provavelmente foram comprometidos ao longo da evolução da doença. / During the course of chronic kidney disease (CKD) in dogs, one of the mechanisms involved in the autoperpetuation and progression of renal disease, in theory, is glomerular hyperfiltration, and this process may result in the development of microalbuminuria or proteinuria due to the presence of high molecular weight proteins (albumin). As the disease progresses, the presence of high concentrations of proteins in the glomerular filtrate may also cause the development of interstitial and tubular injuries, and in consequence the presence of low molecular weight proteins in urine as the impairment of tubular reabsorption mechanism of proteins is affected. Other theories of progression of renal injury are also raised such as the initial involvement of the tubulointerstitial segment. Thus, it is expected that during the course of CKD, the evaluation of the quality (determination of albumin and molecular weights) and quantity of urinary proteins may indicate relevant information about the location and rate of progression of renal injury. The objective of this study was to evaluate, longitudinally, albuminuria and proteinuria (by quantitative and qualitative methods - protein electrophoresis) of dogs with CKD in stages 1, 2 and 3 over the period of at least 5 months, and observe the changes in intensity or the appearance of proteinuria and / or albuminuria. Sixteen dogs (Group 1 = 5 dogs in stage 1, Group 2 = 5 dogs in stage 2 and Group 3 = 6 dogs in stage 3), 9 females and 7 males of various breeds and ages ranging from 24 to 168 months, were followed-up for 5-18 months and medical and laboratory monitoring data were recorded every 30 days. Dogs of Groups 1 and 2 showed good clinical control, however the Group 3 had a progressive deterioration of the disease (3 dogs died). In Group 1, the increase in urinary protein-to-creatinine ratio (UPC; ranging from 0.154 to 1.14) was observed in only one dog (no. 1) and albuminuria was not involved, however low molecular weights proteins (LMWP) were detected (tubular injury) and also the progressive decrease in glomerular filtration rate was noticed by the increase of serum concentrations of cystatin C; the remaining dogs in this group demonstrated normal UPC and UAC (urinary albumin-to-creatinine ratio), however the predominance of LMWP in 2 dogs was observed. In Group 2, similar findings were also noticed in CKD dogs no. 6 (initially hypertensive) and 8 , UPC ranged from 4.89 to 12.77 and 0.5 to 1.0, respectively; dog no. 6 demonstrated no macroalbuminuria but only microalbuminuria, and the predominance of LMWP (tubular injury) was observed as well as the dog no. 8 that had 78 to 100% of LMWP with 3 to 6 bands and no micro or macroalbuminuria was detected. Group 3 presented proteinuria in dogs no. 11, 13 and 15 and microalbuminuria was only observed in dog no. 11; the predominance of LMWP was noticed in dogs no.11 and 13, and mixed proteinuria in dog no. 15. Thus, the sequential or longitudinal study of proteinuria by means of several information obtained of UPC, UAC and urine protein electrophoresis in dogs with chronic kidney disease, followed-up over a period, could give more accurate information about the quality of proteins, allowing the possible identification of the segments of the nephron involved that could probably be affected throughout the course of the disease.

Proteinúria (micro- e macroalbuminúria) identifica pacientes diabéticos com nefropatia diabética e/ou risco de doença cardiovascular e morte. Os três estudos que compõem este trabalho exploram aspectos de curso evolutivo, possibilidades de intervenção precoce e marcadores de predisposição para estas complicações. / Proteinuria (micro- and macroalbuminuria) identifies diabetic patients with nephropathy and/or those at risk of cardiovascular disease and death. The three studies that are part of this work explore aspects o f the evolution of kidney function, possibilities of early intervention, and markers of predisposition for these complications.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:36:02Z : No. of bitstreams: 1 000747190.pdf: 1418817 bytes, checksum: b247c3f9bf3c90821dabe9c5f9e0cf21 (MD5) / Há discordância na literatura quanto à necessidade da realização da microscopia de fase para avaliação da origem da hematúria (glomerular ou não glomerular), isso mostra a necessidade de mais estudos para validar as modalidades de avaliação morfológica da hematúria. Os objetivos deste trabalho foram determinar o melhor ponto de corte da porcentagem dos diferentes padrões de células dismórficas na detecção da hematúria glomerular pelo microscópio óptico convencional e contraste de fase, verificar se a presença de proteinúria ou albuminúria pode auxiliar no diagnóstico da origem da hematúria e determinar o melhor ponto de corte para este parâmetro. Foram avaliadas de maneira cega 131 amostras de urina sendo 66 amostras de portadores de glomerulopatias e 65 amostras dos portadores de litíase renal da Faculdade de Medicina de Botucatu. Utilizaram-se amostras isoladas com densidade >1007 e com mais de 5 hemácias por campo de grande aumento. Verificou-se a presença e a porcentagem de codócitos e acantócitos tanto em microscópio óptico convencional com sedimento fresco e fixado submetidos à coloração de Papanicolaou e Panótico rápido LB e sedimento urinário fresco avaliado em microscópio de contraste de fase, além de determinar o índice de proteinúria e o índice de albuminúria. Os resultados desses métodos foram comparados entre si. Realizou-se regressão linear e diagrama de Bland-Altman das hemácias dismórficas para comparar os diferentes métodos. Curvas ROC foram traçadas para determinar a área sob a curva (ASC) e o melhor ponto de corte (PC) foi determinado pela maior soma de sensibilidade e especificidade. Nesse ponto foram calculadas a sensibilidade (S) e especificidade (Es), Valor Preditivo Positivo (VPP) e Valor Preditivo Negativo (VPN). No microscópio óptico convencional com sedimento urinário fresco, a ASC do dismorfismo eritrocitário total foi a que apresentou... / There is disagreement over the literature regarding the performance of phase microscopy to assess the origin f hematuria (glomerular or nonglomerular). This shows the need for further investigation in order to validate the best form of morphological evaluation of hematuria. The aims of this study were to determine the optimal cutoff point percentage for different patterns of dysmorphic cells in the detection of glomerular hematuria by conventional optical microscopy and phase contrast microscopy, to verify whether the presence of proteinuria or albuminuria may assist in the diagnosis of hematuria and also to establish an optimal cutoff point for this parameter. One hundred thirty-one urine samples were blinded evaluated at the Faculdade de Medicina de Botucatu, 66 samples of patients with glomerulopathies and 65 samples of patients with nephrolithiasis. Isolated samples with density greater than 1007 and with more than 5 erythrocytes per high-power field were used. The presence and percentage of codocytes and acanthocytes were verified by conventional optical microscopy using fresh and fixed urinary sediment subjected to Papanicolaou and Panótico Rápido LB staining and fresh urinary sediment was evaluated by phase contrast microscopy. Proteinuria and albuminuria rates were determined. The results of these methods were compared using linear regression analysis and Bland-Altman diagram of dysmorphic red blood cells. ROC curve plots were generated to determine the area under the ROC curve (AUC) and also an optimal cutoff point with the highest sum of sensitivity and specificity. At this point, it was possible to calculate sensitivity (TPR) and specificity (ES), positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV). In conventional optical microscope with fresh urinary sediment, the AUC of total dysmorphic erythrocytes showed the best result for the diagnosis of hematuria with AUC (IC 95%) ...

Orientador: Marileda Bonafim Carvalho / Coorientador: Luciane Helena Gargaglioni Batalhão / Banca: Paola Castro Moraes / Banca: Márcia Ferreira da Rosa Sobreira / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Banca: Evelin Capellari Cárnio / Resumo: A instalação do estresse oxidativo decorre da existência de um desequilíbrio entre compostos oxidantes e antioxidantes, ocasionando a geração e acúmulo de espécies reativas do oxigênio (ERO). Estudos realizados nos estágios terminais da doença renal crônica (DRC) no homem e em ratos demonstraram que ocorre aumento na produção de ERO. O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se o mesmo ocorre em cães clinicamente estáveis nos diferentes estágios da DRC naturalmente adquirida. O protocolo experimental do presente trabalho foi previamente aprovado, pela Comissão de Ética no uso de Animais conforme processo n.° 013690/11. Foram estudados cinco grupos de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os cães com DRC estavam com o quadro clínico estável e sem receber qualquer tipo de tratamento. Os animais sadios ou com DRC foram submetidos a duas coletas de sangue, com intervalo de 24 horas (amostras repetidas), para obtenção de soro e plasma. O estresse oxidativo foi avaliado pelo poder antioxidante, estimado pelo delta, e pela determinação plasmática indireta de óxido nítrico (NO) por meio da dosagem de nitrato/nitrito. O ensaio foi realizado em duplicatas das amostras de cada avaliação. Os dados obtidos (médias das duplicatas) foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA) não paramétrica (Kruskal-Wallis) (α=0,05). Os resultados estão expressos como média±erro padrão da média. Os valores de creatinina sérica, que definiram a classificação dos pacientes do grupo controle, DRC-1, DRC-2, DRC-3 e DRC-4 foram 1,02±0,02mg/dL; 1,06±0,05mg/dL; 1,80±0,03mg/dL; 3,39±0,21mg/dL e 6,00±0,28mg/dL, respectivamente. Os resultados relativos ... / Abstract: The establishment of oxidative stress results from an imbalance between oxidants and antioxidants compounds, which generates accumulation of reactive oxygen species (ROS). Studies conducted in terminal stages of chronic kidney disease (CKD) in humans and mice demonstrated an increase in ROS generation. The aim of this study was to determine if the same pattern of response occurs in dogs clinically stable at different stages of naturally occurring CKD. The experimental protocol of this study was previously approved by the Ethics Committee on the use of Animals n.° 013690/11. Five groups of dogs, all aged between four to 18 years old. Were studied the control group was composed of healthy animals (CG, n = 17), CKD stage 1 group (CKD-1, n = 12), CKD stage 2 group (CKD-2, n = 10), CKD stage 3 group (CKD-3, n = 13) and CKD stage 4 group (CKD-4, n = 10). CKD dogs were clinically stable with no treatment. Two blood samples were collected at intervals of 24 hours (repeated measures) to obtain serum and plasma. Oxidative stress was measured by antioxidant power and indirectly by determination of nitric oxide (NO) by nitrate/nitrite. Data (means of duplicates) were submitted to analysis of variance (One-way ANOVA) nonparametric (Kruskal-Wallis) (α = .05). The results were expressed as mean±standard error of the mean. The serum creatinine values guided the classification of patients as CG, CKD-1, CKD-2, CKD-3 and CKD-4 and were 1.02±0.02mg/dL, 1.06±0.05 mg/dL, 1.80±0.03 mg/dL, 3.39±0.21 mg/dL and 6.00±0.28 mg/dL, respectively. The results related to antioxidant power (GC) 0.032 ± 0.002 mmol/μL, (CKD-1) 0.030±0.002nmol/μL, (CKD-2) 0.028±0.003nmol/μL, (CKD- 3) 0.027±0.003 nmol/μL and (CKD-4) 0.025 ± 0.002 nmol/μL were different between the healthy dogs and dogs with CKD, but not differ significantly among groups. The results of the NO plasma concentrations did not differ significantly when comparing the GC data (10.81±0.51μM) ... / Doutor

Proteinúria (micro- e macroalbuminúria) identifica pacientes diabéticos com nefropatia diabética e/ou risco de doença cardiovascular e morte. Os três estudos que compõem este trabalho exploram aspectos de curso evolutivo, possibilidades de intervenção precoce e marcadores de predisposição para estas complicações. / Proteinuria (micro- and macroalbuminuria) identifies diabetic patients with nephropathy and/or those at risk of cardiovascular disease and death. The three studies that are part of this work explore aspects o f the evolution of kidney function, possibilities of early intervention, and markers of predisposition for these complications.

A proteína ligada à vitamina D (VDBP) é a principal responsável pelo transporte dos metabólitos da vitamina D e a sua presença na urina pode indicar lesão tubulointersticial, conforme observado em ratos e humanos. A determinação urinária da proteína ligada ao retinol (RBP), responsável por carrear o retinol do fígado para os tecidos periféricos, por sua vez, está associada à fibrose intersticial dos rins. A albuminúria pode estar relacionada a lesões glomerulares e/ou tubulares (não reabsorção). A proteína de Tamm-Horsfall (THP) normalmente é observada na urina, sendo sintetizada exclusivamente pelas células epiteliais da alça de Henle e do túbulo contornado distal, entretanto quando não detectada, pode indicar lesão nestes segmentos do néfron e/ou diminuição do número de néfrons. Em cães, há poucos estudos sobre as referidas proteínas na urina, especialmente nos casos de doença renal crônica (DRC). A hipótese deste estudo seria de que a avaliação da razão proteína:creatinina urinária (RPC) em cães com DRC per si não forneceria informações suficientes, pois não identificaria os segmentos dos néfrons comprometidos, mas que a determinação de proteínas específicas, pela análise conjunta da eletroforese e do Western blotting, sinalizariam a presença de lesões glomerulares e/ou tubulares, e que a THP poderia estar ausente ou presente em menor intensidade nos estágios avançados da DRC, indicando lesão tubular distal e/ou perda importante do número de néfrons. O presente estudo objetivou avaliar a presença de albumina, VDBP, RBP e THP na urina de cães com DRC, nos estágios 1 ao 4 (IRIS), pela análise conjunta da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blotting. O total de 49 cães compuseram os grupos: grupo C clinicamente normal (n&#61; 9), grupo E1 (estágio 1; n&#61;10), grupo E2 (estágio 2; n&#61;10), grupo E3 (estágio 3; n&#61;10) e grupo E4 (estágio 4; n&#61;10). Houve o predomínio de bandas de proteínas de baixo peso molecular (PM &lt;60kDa) em todos os grupos de cães com DRC (E1, E2, E3 e E4), e especificamente para o grupo E4 que apresentava média da RPC de 4,37 e, portanto, esperar-se-ia o predomínio de proteínas de alto PM (PM&gt; 60kDa). Neste grupo, além da imunodetecção da albumina, também foi identificada, em grande intensidade, proteínas de baixo PM (VDBP e RBP). No grupo E3 também foram imunodetectadas a VDBP e RBP, com média da RPC de 1,51 e de 3 a 7 bandas de proteínas de baixo PM. Ainda, a imunodetecção da VDBP e RBP foi constatada nos estágios inicias (E1 e E2) da DRC frente a valores da RPC normais (não proteinúricos), sendo este achado considerado como marcador precoce de lesão renal. A VDBP e RBP não foram identificadas em cães clinicamente normais. A menor intensidade de imunodetecção da THP nos estágios mais avançados pode sugerir mau prognóstico. Conclui-se que o valor da RPC per si não foi capaz de indicar a origem da proteinúria, se glomerular e/ou tubular, sendo necessário, portanto, a análise conjunta da eletroforese (PM) e do Western blotting (albumina, VDBP, RBP e THP) e que, assim, permitiu identificar o segmento do néfron comprometido que acarretou na perda ou na diminuição urinária de proteínas. / Vitamin D-binding protein (VDBP) is the main carrier of the Vitamin D metabolites and its presence in urine is associated with the development of tubulointersticial injury, according to previous studies in rats and humans. Retinol-binding protein (RBP) carries retinol from liver to peripheral tissues, and its urinary detection is also associated with tubulointersticial injury. Albuminuria suggests glomerular lesion, but also may indicate tubular dysfunction (impairment of reabsorption). The presence of Tamm-Horsfall protein (THP) is expected in the urine of clinically normal people and animals, because it is synthesized exclusively by the epithelial cells of the distal segment of nephron, and when it is not detected it may indicate distal tubular injury and/or massive nephrons loss. However in dogs, there are few studies about these urinary proteins especially in cases of chronic kidney disease (CKD). The hypothesis of the present study was to investigate that not only urinary protein-to-creatinine ratio (UPC) measurements would be enough to localize properly the injury to a specific nephron site, but also the evaluation of specifics urinary proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting could provide information regarding to the presence of glomerular and/or tubular injury; in addition, less excretion of THP, or its absence in urine, could be associated with advanced stages of CKD. The aim of the present study was to evaluate albumin, VDBP, RBP e THP in the urine of 40 CKD dogs, on stages 1 to 4 (IRIS), by using of electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. Forty-nine dogs were subdivided into: C group healthy dogs (n&#61; 9), E1 group (stage 1; n&#61;10), E2 group (stage 2; n&#61;10), E3 group (stage 3; n&#61;10) e E4 group (stage 4; n&#61;10). The predominance of low molecular weight proteins (MW &lt;60kDa) was detected in all CKD groups, mainly in E4 group that the mean of UPC was 4.37, and then it would be expected high MW proteins findings (MW &gt;60 kDa). In fact, in E4 group, albumin was immunodetected, however low molecular weight proteins (VDBP and RBP) were also detected and in high intensity. VDBP and RBP were also observed in E3 group (mean UPC &#61; 1.51) and 3 to 7 bands of low molecular weight were detected. In the early stages of CKD (E1 and E2 groups), VDBP and RBP were also identified but UPC values were normal (non-proteinuric), which may suggest the role of these proteins as an early marker of renal injury. VDBP and RBP were not detected in healthy dogs. THP was observed in less intensity in the advanced stages of CDK that may suggest bad prognosis. In conclusion, UPC measurement per se was not able to indicate adequately the injury to a specific nephron site (e.g. glomerular and/or tubular), and therefore the additional information of electrophoresis (MW) and Western blotting (VDBP, RBP and THP) testing could allow the identification of the nephron site injured that caused loss (proteinuria) or decrease in urinary proteins.

Orientadores: Fernanda Klein Marcondes, Maria Claudia Irigoyen / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-09T07:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_TatianadeSousada_D.pdf: 1433112 bytes, checksum: f66d3335e2627dff926880dbb9ae9b16 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O diabetes mellitus, bem como suas complicações, tem se tornado um dos maiores problemas de saúde pública dos países Ocidentais. Estima-se que existam aproximadamente 200 milhões de pacientes diabéticos no mundo, e que a incidência da doença vai aumentar não somente no Ocidente, mas também em países emergentes, por causa das mudanças relacionadas aos hábitos alimentares. Sendo assim, a previsão é de que nos próximos anos, o diabetes se torne a causa mais importante de morbidade e mortalidade relacionada às doenças cardiovasculares. Buscando alcançar maior entendimento a respeito das complicações decorrentes do diabetes mellitus, apresentamos nos Capítulos 1 e 2 os resultados de estudos in vivo utilizando diferentes modelos animais. No Capítulo 1, foi mostrado que o consumo de frutose causa disfunção renal em camundongos, estando o grau de disfunção positivamente correlacionado tanto com a variabilidade pressão arterial, como com o componente low frequency da mesma, importantes preditores de lesões em órgãos-alvo. No Capítulo 2, utilizamos o modelo de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) tratados com a substância diabetogênica estreptozotocina (STZ) para estudar os efeitos do treinamento físico sobre as alterações metabólicas e cardiovasculares presentes na associação hipertensão-diabetes. Neste estudo, mostramos que a ocorrência simultânea destas doenças promove efeitos deletérios sobre a função cardiovascular, e que o treinamento físico moderado atenua a progressão de tais alterações, aumentando significativamente o índice de sobrevida de animais hipertensos-diabéticos. Sabe-se que as respostas benéficas sobre a hipertensão e o diabetes, induzidas pelo treinamento físico, estão relacionadas a fatores hemodinâmicos, neurais e humorais, incluindo alterações dinâmicas em sistemas que produzem e secretam substâncias vasoativas, como o Sistema Renina Angiotensina (SRA). Como o SRA desempenha importante papel na regulação da pressão arterial e no equilíbrio hidro-eletrolítico, tanto em condições fisiológicas como em condições patológicas, existe especial interesse no monitoramento de componentes deste sistema como marcadores de doenças cardiovasculares. Sendo assim, no Capítulo 3 apresentamos os resultados referentes à padronização de uma metodologia rápida, sensível e precisa, alternativa aos ensaios já existentes. Este novo ensaio foi utilizado para quantificação da atividade proteolítica da enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2), importante componente do SRA. Com a utilização da espectrofotometria de massa (MS) foi possível monitorar de maneira eficaz a atividade enzimática da ECA2 recombinante e renal de camundongos controle. E finalmente, no Capítulo 4, utilizando o mesmo ensaio citado anteriormente, mostramos que em condições fisiológicas, as enzimas ECA2 e endopeptidase 24.11 (NEP) cerebrais parecem exercer papel predominante sobre a enzima conversora de angiotensina 1 (ECA1) na metabolização das angiotensinas, contribuindo de maneira significativa para a formação de angiotensina (1-7), principal metabólito produzido em extratos hipotalâmicos de camundongos. Com base nos resultados apresentados nesta tese, concluímos que a utilização de modelos animais e de novas tecnologias, bem como a padronização de ensaios alternativos, são essenciais para a compreensão da fisiopatologia e medidas de prevenção e tratamento do diabetes e hipertensão / Abstract: The diabetes mellitus, as well as its complications, has becoming the major health problem of Western Countries. It is estimated that 200 million people are diabetic in the world, and that the prevalence of the disease will increase not only in the West, but also in emerging countries, because of the changes on diet. Therefore, it is believed that in the next few years, diabetes will become the most important cause of morbidity and mortality related with cardiovascular disease. With the aim to understand the complications of diabetes mellitus, we present in Chapter 1 and 2 the results from in vivo studies using different animal models. In Chapter 1, it was shown that fructose diet induces renal dysfunction in mice, which is positively correlated with both variability and low frequency component of blood pressure, important predictors of end organ damage. In chapter 2, the model of spontaneous hypertensive rats (SHR) treated with streptozotocin (STZ) was used to study the effects of exercise training on metabolic and cardiovascular alterations induced by hypertension and diabetes. In this study, it was shown that the concomitant occurrence of the diseases causes deleterious effects on cardiovascular function, and moderate exercise training attenuates the progression of complications, increasing the survival in SHR-STZ model. It is known the benefic effects of exercise training on hypertension and diabetes are induced by hemodynamic, neural and humoral factors, including adaptations of some systems that produce and secret vasoactive substances, like Renin Angiotensin System (RAS). The RAS has an important role on blood pressure regulation and hydroelectrolytic balance, under physiological and pathological conditions, and because of this there is special interest on monitoring its components as markers for cardiovascular diseases. Therefore, in Chapter 3, we presented a rapid, sensitive, and precise assay, as an alternative method to the existing assays to quantify the proteolitic activity of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), an important component of RAS. Using mass spectrometry (MS) it was possible to monitor in a precise manner the activity of recombinant and renal ACE2 in mice. And finally in Chapter 4, using the same MS assay, it was shown that under physiological conditions, brain ACE2 and neutral endopeptidase 24.11 activities seem to be predominant over angiotensin converting enzyme 1 (ACE1) on the metabolism of angiotensins, contributing to the generation of angiotensin (1-7), the main peptide present in mice hypothalamic extracts. Based on the results, we conclude that the use of animal models and new technologies are essential for the comprehension of physiopathology of hypertension and diabetes and also for the study of therapeutic interventions to prevent and treat the diseases / Doutorado / Fisiologia Oral / Doutor em Odontologia

Durante a evolução da doença renal crônica (DRC) em cães, um dos mecanismos importantes envolvidos na autoperpetuação e progressão da lesão renal envolvem, teoricamente, o comprometimento inicial do glomérulo pelo mecanismo de hiperfiltração glomerular, e este processo pode acarretar no desenvolvimento de microalbuminúria ou de proteinúria pela presença de proteínas de alto peso molecular (albumina). Com o progredir da doença, as altas concentrações de proteína no filtrado glomerular pode também desencadear lesões tubulares e intersticiais, ocasionando a perda urinária também de proteínas de baixo peso molecular (PM) pelo comprometimento da reabsorção dessas proteínas pelos túbulos renais. Outras teorias de progressão da lesão renal também são suscitadas tais como o comprometimento inicial da porção túbulo-intersticial. Assim, espera- -se que durante a evolução da DRC, a avaliação das proteínas urinárias quanto à qualidade (determinação de albumina e os pesos moleculares) e a quantidade possam trazer informações relevantes sobre a velocidade de progressão e o local da lesão renal. O objetivo deste estudo foi de avaliar, sequencialmente, a albuminúria e a proteinúria (pelos métodos quantitativos e qualitativos - eletroforese de proteínas) dos cães com DRC nos estágios 1, 2 ou 3 ao longo do período de pelo menos 5 meses, e verificar a existência de alterações na intensidade ou no aparecimento de proteinúria e/ou albuminuria. Dezesseis cães (Grupo 1= 5 cães do estágio 1; Grupo 2= 5 cães do estágio 2 e Grupo 3= 6 cães do estágio 3), 9 fêmeas e 7 machos de raças variadas e idades entre 24 a 168 meses, foram acompanhados por 5 a 18 meses e os exames clínico e laboratorial realizados a cada 30 dias. Os cães dos Grupos 1 e 2 apresentaram bom controle clínico, entretanto o Grupo 3 apresentou evolução mais rápida da doença (3 cães vieram a óbito). No Grupo 1, o aumento da razão proteína:creatinina urinária (RPC; variação de 0,154 a 1,14) foi observada somente em um dos cães (no 1) e esta não era decorrente de albuminúria, mas sim da presença de proteínas de baixo peso molecular (lesão tubular) e também foi constatada diminuição progressiva da taxa de filtração glomerular pelo o aumento das concentrações de cistatina C sérica; os demais cães deste grupo apresentaram RPC e razão albumina:creatinina urinária (RAC) normais, entretanto com predomínio de proteínas de baixo peso molecular em 2 cães. No Grupo 2 fato semelhante também foi constatado, nos cães no 6 (inicialmente hipertenso) e 8 em que a RPC variou de 4,89 a 12,77 e 0,5 a 1,0, respectivamente; no cão no6 foi não foi detectada macroalbuminuria, mas somente microalbuminúria e com o predomínio de proteínas de baixo PM (lesão tubular), como também no cão no 8 (ausência de micro ou macroalbuminuria) em que houve o predomínio de 78 a 100% de proteínas de baixo PM e com 3 a 6 bandas. No Grupo 3, proteinúria foi constatada nos cães de no 11, 13 e 15 e a microalbuminúria somente no cão no11; o predomínio de proteínas de baixo PM foi observada nos cães no 11 e 13 e proteinúria mista no cão no 15. Assim, a avaliação sequencial ou seriada da proteinúria, pelo conjunto de informações obtido pela RPC, RAC e eletroforese de proteínas urinárias nos com cães com doença renal crônica, ao longo de um período, trouxe informações mais precisas acerca da qualidade das proteínas, identificando os segmentos do néfron que provavelmente foram comprometidos ao longo da evolução da doença. / During the course of chronic kidney disease (CKD) in dogs, one of the mechanisms involved in the autoperpetuation and progression of renal disease, in theory, is glomerular hyperfiltration, and this process may result in the development of microalbuminuria or proteinuria due to the presence of high molecular weight proteins (albumin). As the disease progresses, the presence of high concentrations of proteins in the glomerular filtrate may also cause the development of interstitial and tubular injuries, and in consequence the presence of low molecular weight proteins in urine as the impairment of tubular reabsorption mechanism of proteins is affected. Other theories of progression of renal injury are also raised such as the initial involvement of the tubulointerstitial segment. Thus, it is expected that during the course of CKD, the evaluation of the quality (determination of albumin and molecular weights) and quantity of urinary proteins may indicate relevant information about the location and rate of progression of renal injury. The objective of this study was to evaluate, longitudinally, albuminuria and proteinuria (by quantitative and qualitative methods - protein electrophoresis) of dogs with CKD in stages 1, 2 and 3 over the period of at least 5 months, and observe the changes in intensity or the appearance of proteinuria and / or albuminuria. Sixteen dogs (Group 1 = 5 dogs in stage 1, Group 2 = 5 dogs in stage 2 and Group 3 = 6 dogs in stage 3), 9 females and 7 males of various breeds and ages ranging from 24 to 168 months, were followed-up for 5-18 months and medical and laboratory monitoring data were recorded every 30 days. Dogs of Groups 1 and 2 showed good clinical control, however the Group 3 had a progressive deterioration of the disease (3 dogs died). In Group 1, the increase in urinary protein-to-creatinine ratio (UPC; ranging from 0.154 to 1.14) was observed in only one dog (no. 1) and albuminuria was not involved, however low molecular weights proteins (LMWP) were detected (tubular injury) and also the progressive decrease in glomerular filtration rate was noticed by the increase of serum concentrations of cystatin C; the remaining dogs in this group demonstrated normal UPC and UAC (urinary albumin-to-creatinine ratio), however the predominance of LMWP in 2 dogs was observed. In Group 2, similar findings were also noticed in CKD dogs no. 6 (initially hypertensive) and 8 , UPC ranged from 4.89 to 12.77 and 0.5 to 1.0, respectively; dog no. 6 demonstrated no macroalbuminuria but only microalbuminuria, and the predominance of LMWP (tubular injury) was observed as well as the dog no. 8 that had 78 to 100% of LMWP with 3 to 6 bands and no micro or macroalbuminuria was detected. Group 3 presented proteinuria in dogs no. 11, 13 and 15 and microalbuminuria was only observed in dog no. 11; the predominance of LMWP was noticed in dogs no.11 and 13, and mixed proteinuria in dog no. 15. Thus, the sequential or longitudinal study of proteinuria by means of several information obtained of UPC, UAC and urine protein electrophoresis in dogs with chronic kidney disease, followed-up over a period, could give more accurate information about the quality of proteins, allowing the possible identification of the segments of the nephron involved that could probably be affected throughout the course of the disease.