La détection de séquences génétiques par la technologie des puces à ADN se heurte à des problèmes de fiabilité et de reproductibilité, dus en grande partie à des problèmes de mélange. Dans toute cette thèse, nous montrons à quel point le mélange par advection chaotique améliore les performances de ces puces. Pour cela nous comparons, par une étude principalement numérique, l'efficacité de deux protocoles de mélange basés sur le principe d'injection alternée et périodique de fluide (modèle puits/sources) : l'un utilise des seringues réversibles, l'autre des pompes recyclant le fluide extrait, conduisant globalement à un mélange bien plus efficace et rapide. En outre, nous mettons en évidence le rôle important de la géométrie de la chambre. Dans un second temps, nous introduisons un modèle de capture chimique entre les monobrins d'ADN libres en volume (cibles) et ceux fixés sur la puce (sondes). Nous montrons alors numériquement que la réaction est généralement grandement limitée par la diffusion, mais que l'advection chaotique améliore les choses de manière très significative grâce au mélange. Ceci nous permet d'estimer les constantes de vitesses dans le cas statique (où la diffusion agit seule) et le cas dynamique (avec mélangeur). Enfin, profitant de l'opportunité d'un stage à l'Université de Sherbrooke, j'ai effectué un premier suivi en temps réel par SPR d'une cinétique de type "cibles en solution/sondes sur support" pour tenter de comparer les vitesses d'hybridation statique et dynamique.

L'ADN étant le support de l'information génétique, les lésions de l'ADN provoquées par différents stress physiques ou chimiques sont un défi pour les systèmes de réparation cellulaire. Parmi ceux-ci le système de réparation par excision de bases (BER) implique plusieurs enzymes dont les objectifs sont la reconnaissance et le retrait de la base lésée, fonctions bien connues pour deux glycosylases : Fpg Procaryote et OGG1 Eucaryote. De nombreuses approches ont été décrites pour étudier les interactions ADN/protéine in vitro. Avec la résonance plasmonique de surface par imagerie (SPRi), nous disposons d'une technique d'analyse en temps réel, sans marquage avec laquelle nous avons pu observer des interactions parallélisées d'une même protéine enzymatique purifiée (Fpg, OGG1, EndoIV ou Ape1) vis-à-vis de différentes lésions sur des oligonucléotides de synthèse immobilisés sur une surface d'or. Les dommages étudiés sont une base oxydée (8-oxoG), une base cyclisée (cycloadénine) et des analogues de sites abasiques (THF et C3). Nous avons également étudié l'action de ces mêmes enzymes sur des lésions multiples, en tandem, associant les bases 8-oxoG et 8-oxoA sur le même brin d'ADN. L'originalité de notre dispositif associe l'analyse directe de l'interaction ADN/protéine et l'approche indirecte de sa conséquence par une stratégie d'hybridation et d'amplification du signal après une rampe thermique. Les résultats obtenus permettent d'envisager l'utilisation de notre technique pour observer la réparation simultanée de certaines lésions par des extraits cellulaires pour des travaux de biochimie ou des extraits tissulaires humains pour des travaux de biologie médicale.

La phosphorylation du domaine C-terminal de l’ARN polymérase II permet à ce complexe protéique d’exécuter la transcription des gènes, en plus de coupler à la transcription des événements moléculaires comme la maturation des ARNm. Mes résultats montrent que même si cette phosphorylation suit un patron similaire à l’ensemble des gènes, il existe des exceptions pouvant être dues à des mécanismes alternatifs de phosphorylation du CTD. Le présent ouvrage s’intéresse également au rôle qu’occupe la variante d’histone H2A.Z dans l’organisation de la chromatine. Des études précédentes on montré que le positionnement de certains nucléosomes le long de l’ADN serait influencé par H2A.Z et aurait une influence sur la capacité de transcrire les gènes. Par une approche génomique utilisant les puces à ADN, j’ai cartographié l’impact de la délétion de H2A.Z sur la structure des nucléosomes. Enfin, des résultats intéressants sur la dynamique d’incorporation de H2A.Z à la chromatine ont été obtenus. / RNA Polymerase II is the molecular complex responsible for the transcription of class II genes. Proper transcription and associated events such as mRNA processing are thought to require the phosphorylation of its C-terminal domain. Here I show that this phosphorylation follows a similar pattern for most of the genes, althought some exceptions exist. These exceptions could be explained by alternative phosphorylation mechanisms. Also, this work provides data on how the variant histone H2A.Z influences chromatin structure. Previous studies have shown a role for H2A.Z in the positioning of some nucleosomes along the DNA, which would impact the ability to transcribe genes. Here I used a microarray technology to profile nucleosome positions in a genome-wide manner. My data provide further evidence that H2A.Z influences nucleosome positioning. Interesting results regarding the dynamics of H2A.Z incorporation into chromatin are also shown.

La bio-informatique est un champ pluridisciplinaire qui utilise la biologie, l’informatique, la physique et les mathématiques pour résoudre des problèmes posés par la biologie. L’une des thématiques de la bio-informatique est l’analyse des séquences génomiques et la prédiction de gènes d’ARN non codants. Les ARN non codants sont des molécules d’ARN qui sont transcrites mais pas traduites en protéine et qui ont une fonction dans la cellule. Trouver des gènes d’ARN non codants par des techniques de biochimie et de biologie moléculaire est assez difficile et relativement coûteux. Ainsi, la prédiction des gènes d’ARNnc par des méthodes bio-informatiques est un enjeu important. Cette recherche décrit un travail d’analyse informatique pour chercher des nouveaux ARNnc chez le pathogène Candida albicans et d’une validation expérimentale. Nous avons utilisé comme stratégie une analyse informatique combinant plusieurs logiciels d’identification d’ARNnc. Nous avons validé un sous-ensemble des prédictions informatiques avec une expérience de puces à ADN couvrant 1979 régions du génome. Grace à cette expérience nous avons identifié 62 nouveaux transcrits chez Candida albicans. Ce travail aussi permit le développement d’une méthode d’analyse pour des puces à ADN de type tiling array. Ce travail présente également une tentation d’améliorer de la prédiction d’ARNnc avec une méthode se basant sur la recherche de motifs d’ARN dans les séquences. / Bioinformatics is a multidisciplinary field that uses biology, computer science, physics and mathematics to solve problems in biology. One of the topics of bioinformatics is the analysis of genomic sequences and prediction of genes from non-coding RNA (ncRNA). The non-coding RNAs are RNA molecules that are transcribed but not translated into protein and have a function in the cell. The use of biochemistry and molecular biology techniques in order to find non-coding RNA genes is rather difficult and relatively expensive. Thus, the prediction of genes by bioinformatics methods is an important issue. This research describes a computer analysis to search for new ncRNA in the pathogen Candida albicans and an experimental validation. The strategy used was to combine several algorithms and to validate a subset of computer predictions with a microarray experience covering 1979 regions of the genome. We have identified 62 new transcripts in Candida albicans. We have also developed an analytical method for tiling array and attempted to improve the prediction of ncRNAs this with a method based on the search of RNA motifs in the sequences.

Les avancées en biotechnologie ont permis l’identification d’un grand nombre de mécanismes moléculaires, soulignant également la complexité de la régulation génique. Néanmoins, avoir une vision globale de l’homéostasie cellulaire, nous est pour l’instant inaccessible et nous ne sommes en mesure que d’en avoir qu’une vue fractionnée. Étant donné l’avancement des connaissances des dysfonctionnements moléculaires observés dans les maladies génétiques telles que la fibrose kystique, il est encore difficile de produire des thérapies efficaces. La fibrose kystique est causée par la mutation de gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), qui code pour un canal chlorique transmembranaire. La mutation la plus fréquente (ΔF508) induit un repliement incorrect de la protéine et sa rétention dans le réticulum endoplasmique. L’absence de CFTR fonctionnel à la membrane a un impact sur l’homéostasie ionique et sur l’hydratation de la muqueuse respiratoire. Ceci a pour conséquence un défaut dans la clairance mucocilliaire, induisant infection chronique et inflammation excessive, deux facteurs fondamentaux de la physiopathologie. L’inflammation joue un rôle très important dans l’évolution de la maladie et malgré le nombre important d’études sur le sujet, la régulation du processus inflammatoire est encore très mal comprise et la place qu’y occupe le CFTR n’est pas établie. Toutefois, plusieurs autres facteurs, tels que le stress oxydatif participent à la physiopathologie de la maladie, et considérer leurs impacts est important pour permettre une vision globale des acteurs impliqués. Dans notre étude, nous exploitons la technologie des puces à ADN, pour évaluer l’état transcriptionnel d’une cellule épithéliale pulmonaire humaine fibro-kystique. Dans un premier temps, l’analyse de notre expérience identifie 128 gènes inflammatoires sur-exprimés dans les cellules FK par rapport aux cellules non FK où apparaissent plusieurs familles de gènes inflammatoires comme les cytokines ou les calgranulines. L’analyse de la littérature et des annotations suggèrent que la modulation de ces transcripts dépend de la cascade de NF-κB et/ou des voies de signalisation associées aux interférons (IFN). En outre, leurs modulations pourraient être associées à des modifications épigénétiques de leurs loci chromosomiques. Dans un second temps, nous étudions l’activité transcriptionnelle d’une cellule épithéliale pulmonaire humaine FK en présence de DMNQ, une molécule cytotoxique. Notre but est d’identifier les processus biologiques perturbés par la mutation du gène CFTR en présence du stress oxydatif. Fondé sur une analyse canonique de redondance, nous identifions 60 gènes associés à la mort cellulaire et leur variance, observée dans notre expérience, s’explique par un effet conjoint de la mutation et du stress oxydatif. La mesure de l’activité des caspases 3/7, des effecteurs de l’apoptose (la mort cellulaire programmée), montre que les cellules porteuses de la mutation ΔF508, dans des conditions de stress oxydatif, seraient moins apoptotiques que les cellules saines. Nos données transcriptomiques suggèrent que la sous-activité de la cascade des MAPK et la sur-expression des gènes anti-apoptotiques pourraient être impliquées dans le déséquilibre de la balance apoptotique. / Biotechnical advances have allowed a large number of molecular mechanisms to be identified, and have also underlined the complexity of gene regulation. Nonetheless, we still only have a partial understanding of cellular homeostasis. Even with our current knowledge, molecular dysfunctionality observed in genetic illnesses such as cystic fibrosis remain largely misunderstood, prohibiting us from developing efficient treatments. Cystic fibrosis is caused by a mutation of the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene which codes for a chloric transmembrane channel. The most frequent mutation (ΔF508) causes the unfolding of the protein and its retention in the endoplasmic reticulum. This absence of a functional CFTR to the membrane has an impact on the ionic homeostasis and the hydration of the respiratory mucus. Consequently, the mucociliary clearance is disrupted, which leads to chronic infection and excessive inflammation - two fundamental factors of CF’s physiopathology. Inflammation plays a key role in the evolution of the illness and despite many studies on this subject, the regulation of the inflammatory process remains a mystery and CFTR’s role is not well established. Additionally, since the physiopathology cannot be explained by mutation alone, several authors suggest the importance of other factors (genetic and/or environmental) which are factors in the clinical picture of the illness. In our study, we use microarray technology to evaluate the transcriptional state of an epithelial lung cell issued from a human with cystic fibrosis. Initially, our analysis identifies 128 inflammatory genes which are over-expressed in the cystic fibrosis cells versus non-cystic fibrosis cells, showing several inflammatory gene families such as cytokines or calgranulins. An analysis of the publications and annotations of these transcripts suggests that their modulations depend upon the cascade of NF-κB and/or signalling pathways associated with interferons (IFN). In other words, their modulations could be associated with epigenetic modifications of their chromosomal loci. Secondly, we study the transcriptional activity of an epithelial lung cell issued from a human with cystic fibrosis in the presence of DMNQ, a cytotoxic molecule. Our goal is to identify the biological processus which are disturbed by the mutation of the CFTR gene in the presence of oxidative stress. Based on a canonical redundancy analysis, we identify 60 genes associated with cell death and their modulation in our study explained by the combined effect of mutation and oxidative stress. By measuring the activity of caspase 3/7, an effector of apoptosis (programmed cell death), we see that the cells containing the mutation ΔF508 could present a problem with apoptosis. Our transcriptomic data suggest that decreased activity of the MAPK cascade and over-expression of anti-apoptotic genes would be a factor in apoptotic imbalance.

Cette thèse porte sur la conception et la réalisation d'un microsystème d'éjection matriciel pour la fonctionnalisation in-situ des puces à ADN. L'objectif est de concevoir et réaliser un système flexible, peu onéreux et performant permettant le dépôt localisé de micro-gouttes de réactifs (nucléotides en solution dans l'acétonitrile en l'occurrence) sur la surface de la biopuce afin de synthétiser les séquences d'oligonucléotides in-situ. Les avantages d'un tel système sont le faible coût de l'équipement, une grande flexibilité dans le choix des séquences synthétisées et la possibilité de réaliser des puces à fortes densités d'unités d'hybridation. Après examen des différentes possibilités d'actionnement, l'éjection par actionnement thermique a été retenue. Le principe s'inspire du jet d'encre thermique mais la difficulté essentielle vient du fait que les éjecteurs sont disposés de façon matricielle avec une très grande densité et doivent être commandables individuellement les uns des autres. La conception du micro-injecteur passe par la compréhension du mécanisme d'éjection et nous a amené à traiter des aspects théoriques de l'ébullition et de l'éjection. Une première structure a été conçue et réalisée, devant répondre au cahier des charges imposé par l'application ainsi qu'à l'impératif d'une bonne reproductibilité de l'éjection. A ces fins, différentes simulations par des méthodes à éléments finis ont été effectuées à partir du logiciel CoventorWare. La structure retenue intègre des résistances chauffantes sur une fine membrane diélectrique et les buses d'éjection sont réalisées en résine photosensible SU8. Les propriétés du dispositifs permettent d'atteindre localement des températures suffisamment importantes pour provoquer la nucléation homogène des bulles gazeuses tout en confinant la chaleur générée autour d'une buse d'éjection, sans interaction thermique avec les voisines. Les éjecteurs réalisés ont été caractérisés et il a ainsi été montré que des g outtel ettes de 0,1pl à 3nl pouvaient être éjectées lorsque la tension d'alimentation varie entre 25V et 5V et l'impulsion électrique d'alimentation durait de 50µs à 50ms.

Les travaux présentés dans cette thèse s'intéressent à l'immobilisation de biomolécules pour le développement d'outils d'analyse multiparamétrique pour la caractérisation d'échantillons biologiques et le diagnostic, sur un support de type biopuce couplé à une détection colorimétrique.Un premier axe de recherche concerne le développement de tests d'hybridation d'acides nucléiques et d'immunotests à haut-débit automatisés sur plaque de filtration. Cette méthode a permis la mise au point d'un test de génotypage automatisé pour le dépistage transfusionnel haut-débit (génotypage érythrocytaire étendu) en collaboration avec l'Établissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). Il permet d'analyser 96 échantillons en quatre heures, et de caractériser six génotypes par échantillon. Cet outil a fait l'objet d'une validation sur un panel de 293 donneurs.La seconde partie des travaux présentés s'intéresse au développement d'un procédé d'immobilisation d'oligonucléotides sur un polymère particulier (PolyshrinkTM) pour l'élaboration d'un système d'analyse miniaturisé. Plusieurs stratégies d'activation ont été envisagées et ont abouti à la mise au point d'une technique d'immobilisation d'oligonucleotides in situ dans des plots d'hydrogel. La méthode de fabrication permet d'obtenir une matrice de plots d'hydrogel de 60 µm de diamètre et d'une hauteur de 6 µm en moyenne. En outre, il a été démontré que les oligonucléotides immobilisés dans les plots pouvaient détecter de façon quantitative et sélective les cibles complémentaires présentes dans l'échantillon analysé en utilisant une détection par colorimétrie ou par chimiluminescence.

Les puces à ADN, ont vu le jour à la fin du vingtième siècle. L'utilisation de l'Imagerie par Résonance des Plasmons de Surface dans de tels outils est très prometteuse. En effet, cette technique permet de suivre en temps réel et en parallèle, sans l'usage de marqueur, différentes interactions se déroulant sur une surface métallique. Elle nous a servi pour analyser les interactions ADN/ADN dans le but du diagnostic génétique. Pour cela nous avons fixé des molécules d'ADN biotinylées sur une surface d'or par l'intermédiaire d'une structure auto-assemblée composée successivement un acide thiolé, d'un polymère chargé positivement et de l'ExtrAvidine. L'analyse des interactions ADN/ADN montre que le système employé permet de distinguer la formation d'un double brin d'ADN totalement complémentaires de celle d'un double brin avec une mutation. Cette distinction est nette pour une délétion. Le cas plus subtil d'une substitution nous a poussé à examiner l'effet de la longueur des ADN sur la réponse optique du système. Cette étude a fait ressortir l'influence de la température de fusion des séquences sur le signal obtenu. La représentation des résultats en fonction de ce dernier paramètre a permis de les modéliser, d'expliquer la différence de comportement des diverses molécules utilisées et de prédire le résultat des hybridations entre oligonucléotides quelconques. Ainsi, pour valider notre modèle, nous avons conçu un ensemble de séquences capable de révéler six des plus fréquentes mutations de la mucoviscidose. Les résultats expérimentaux sont en bon accord avec les résultats théoriques. Les premiers essais de diagnostic génétique sont prometteurs.

La réalisation de microsystèmes de multidétection et sans marquage pour la reconnaissance de biomolécules est d'un intérêt fondamental pour la réalisation de tests rapides dédiés au diagnostic biologique. Ces développements nécessitent une méthode d'adressage des sondes de capture sur une plateforme multiplexée associée à une méthode d'analyse sensible. Dans cette étude, la méthode de détection choisie pour les tests développés sur la puce est la voltampérométrie cyclique, et le férrocène a été utilisé pour la modification de sondes oligonucléotidiques de type tige-boucle. Une stratégie d'électroadressage a été développée sur surface d'or. Elle a été réalisée via chimie " click " entre un alcyne et un azoture. Cette réaction peut être électro-catalysée en maintenant le catalyseur cuivre sous sa forme active par l'application d'un potentiel à l'électrode. Une première entité chimique de petite taille, constituée de deux groupements dithiol phosphate et d'un groupement hexynyle a été synthétisé par synthèse supportée et greffée sur électrode d'or. Par la suite, différents éléments ont été immobilisés par chimie " click ". Un dérivé ferrocène porteur d'une fonction azoture a été utilisé pour la détermination des conditions optimales de cette chimie. Puis, cette méthode a été exploitée pour l'immobilisation de nanoparticules fluorescentes et de protéines par l'intermédiaire de la formation du complexe biotine/streptavidine. Enfin, cette méthode a permis l'électroadressage de sondes de capture oligonucléotidiques de type tige-boucle, modifiées par des ferrocènes. Des tests d'hybridation ADN ont été menés en milieu complexe avec une limite de détection déterminée à 100fM

Depuis l'apparition de la vie sur terre, les pressions de sélection liées aux interactions biotiques et abiotiques ont généré une forte diversité des formes de vie. Ainsi, chaque espèce eucaryote coévolue avec sa communauté microbienne associée. Dans le cas des plantes, la diversité génétique se traduit au niveau de multiples traits phénotypiques (exsudation de substrats carbonés, architecture racinaire, densité et aération du sol, acidification, etc.) susceptibles d'influer sur les interactions avec les populations microbiennes du sol, et donc sur la composition et le fonctionnement de la communauté microbienne rhizosphérique. Notre hypothèse est que les différences entre communautés bactériennes rhizosphériques sont proportionnelles aux distances évolutives entre partenaires végétaux. L'objectif de cette thèse était donc de déterminer l'importance, dans le cas des Poacées et notamment du maïs, de l'histoire évolutive de la plante dans la capacité de sélection des communautés bactériennes de la rhizosphère. Les analyses faites à l'aide d'une puce à ADN taxonomique 16S indiquent que la composition de la communauté rhizobactérienne dépend du groupe génétique de maïs mais n'est pas liée aux marqueurs microsatellites de diversité du maïs. Par contre, à l'échelle des Poacées, une corrélation a été trouvée entre la phylogénie végétale et la composition de la communauté bactérienne (voire la prévalence de taxons bactériens particuliers). Cette corrélation n'était pas significative quand l'étude était limitée à l'effectif, le niveau de transcription de nifH ou la diversité du groupe fonctionnel des bactéries fixatrices d'azote. En conclusion, l'histoire évolutive du partenaire végétal à l'échelle des Poacées (mais pas à celle du maïs) est un facteur conditionnant les interactions avec les groupes bactériens taxonomiques (mais pas nécessairement fonctionnels) de la rhizosphère