Il s’agit d’étudier les effets du TEL du rayonnement, d’un soluté (oxygène, antioxydant, scavengers...) et d’une géométrie de confinement sur les processus physiques et chimiques. Nos études sur la production de radicaux libres en fonction de la pression d’oxygène et du TEL du rayonnement nous ont permis de noter une similitude entre la production des radicaux O2- / HO2 et l’effet oxygène décrit en radiothérapie. Ces résultats confortent l’idée que ce couple de radicaux pourraient jouer un rôle dans l’effet oxygène (radiothérapie) et expliqueraient la disparition de cet effet à haut TEL (hadronthérapie). Nous avons aussi montré que cette similitude persistait en présence de Glutathion (antioxydant majoritaire dans le noyau cellulaire) / -

Avec la chimiothérapie et la chirurgie, la radiothérapie fait partie intégrante de l'arsenal thérapeutique pour lutter contre le cancer. Afin de potentialiser l’efficacité des rayonnements ionisants, la radiochimiothérapie s’est développée mais en raison des résultats insuffisants de cette stratégie, de nouvelles voies permettant une modulation de la radiosensibilité tumorale sont évaluées. C’est dans ce contexte d’amélioration de l’efficacité de la radiothérapie que s’inscrit ce travail de thèse. Nous avons évalué l’intérêt thérapeutique de l’association d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN à la radiothérapie sur un modèle orthotopique de cancer bronchique et sur un modèle orthotopique de cancer de la tête et du cou. En raison de son rôle prépondérant dans la réparation des cassures simple brin, PARP1 a été ciblé dans un premier temps pour éprouver cette stratégie, à l’aide d’un inhibiteur chimique l’Olaparib. Le rationnel consistait à inhiber la réparation de dommages induits par l’irradiation, pouvant ainsi conduire à la mort des cellules tumorales. Les résultats obtenus in vitro ont montré que l’inhibition de PARP1 permettait en effet de potentialiser les effets de la radiothérapie. Cette association thérapeutique a, par la suite, été évaluée in vivo et a montré une très faible radiosensibilisation, limitée par une toxicité induite par cette association. Afin d’augmenter l’efficacité de cette stratégie thérapeutique, un inhibiteur d’ATR (AZD6738), une des protéines majeures de la réponse aux dommages de l’ADN et au stress réplicatif, a été ajouté à la combinaison initiale. Il a en effet été montré que Chk1, la cible principale d’ATR, était activée dans les cellules traitées avec l’Olaparib et/ou irradiées. Nous avons démontré in vitro et in vivo, que l’AZD6738 améliorait l’efficacité de la combinaison irradiation et Olaparib dans nos deux modèles tumoraux, suggérant le potentiel de cette triple combinaison en clinique. Enfin, en raison du rôle de l’irradiation et de PARP1 dans différents processus immunitaires, nous avons étudié de façon préliminaire l’influence de nos différentes combinaisons thérapeutiques sur l’infiltrat immunitaire tumoral. Sachant que l’efficacité de l’association Olaparib/irradiation avait été démontrée dans des modèles tumoraux implantés en sous-cutané, ce travail de thèse montre l’importance et la pertinence de modèles précliniques plus proches de la pathologie humaine, comme les modèles orthotopiques. En effet, il est très probable que les toxicités observées au cours de ce travail soit la conséquence d’une détérioration avancée des muqueuses présentes dans le champ d’irradiation et que celles-ci ne puissent être observées lors d’irradiation localisée de tumeurs implantées en sous-cutané. / With chemotherapy and surgery, radiotherapy is part of anti cancer therapeutic strategy. To increase ionizing radiations effects, radiochemotherapy has emerged, but because of inefficient results, new pharmacological strategies for modulation of radiosensitization has been assessed. My thesis project is part of this context of improvement of radiotherapy efficiency. We have evaluated therapeutic interest of association of DNA repair inhibitors and radiotherapy on lung cancer model and head and neck cancer model. Because of its implication in single strand break repair, PARP1 has been first, targeted to assess this strategy, with the chemical inhibitor Olaparib. The rational was to inhibit radio-induced damages, leading to cellular death. In vitro, we have demonstrated that Olaparib was promising for enhancing radiation efficacy, but has an in vivo limited radiosensitization, plus we observed with this association a toxicity. Non toxic association has been found by decreasing Olaparib dose, but association efficiency has been limited, meaning that Olaparib, in our model, has a restrained therapeutic index.To increase the efficiency of this combination, we have added an ATR inhibitor (AZD6738), one of the key proteins implicated in response to DNA damages and replicative stress. In fact it has been demonstrated, that ATR main target, Chk1, was activated in Olaparib-treated and/or irradiated cells. We have demonstrated in vitro and in vivo, that AZD6738 improved efficiency of Olaparib and radiotherapy combination in both models, suggesting the potential of this triple combination in clinic.Finally, because of effects of PARP1 and radiation on different immune processes, we have preliminary studied, the influence of this different combinations on immune infiltrate.Knowing that efficiency of the association Olaparib and radiotherapy has already been demonstrated in subcutaneous models, this work has shown the importance and relevance of preclinical models, closer to human pathologies, as orthotopic models. In fact, it is likely that toxicities observed during this work, are the consequence of mucous membrane damaging in the field of irradiation, which cannot be observed with localized irradiation of subcutaneous tumors.

Un des principaux buts du domaine de la radiobiologie est de donner une description complète des effets de la radiation ionisante (RI) sur les cellules vivantes et sur l'organisme humain, en analysant la séquence des événements par lesquels les radiations modifient un système biologique. Ce sont tout d'abord les événements ultrarapides (10[indice supérieur -15] -10[indice supérieur -12]s) qui initient tout le processus de modification (dommage). Les études présentées dans ce mémoire portent sur ce type d'évènement durant l'irradiation de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Ce choix est dicté par l'importance de l'ADN qui est la structure cible causant la létalité cellulaire. Les électrons de basse énergie (EBE) représentent un élément très important en sciences des radiations, surtout en ce qui concerne les phénomènes ultrarapides (de l'ordre de la femtoseconde (fs)) se produisant lors de l'impact de la radiation sur le milieu biologique. En effet, suite à l'impact du rayonnement ionisant (RI) sur l'ADN, des électrons appelés électrons secondaires (ES) sont arrachés de la cible. Il a été montré, lors d'études récentes, que l'énergie la plus probable de ces ES est de 9-10 eV et qu'ils portent en majorité une énergie inférieure à 25 eV (Pimblott et La Verne, 2007). En plus, dans une cellule irradiée, il y a environ 10 5 produits secondaires (PS) par 1 MeV d'énergie déposée (Pimblott et La Verne, 1995 ; Sanche, 2005), et parmi ces PS, il y a environ 4x10[indice supérieur 4] ES. Il est donc pertinent, voire nécessaire, d'étudier l'effet des ES de basse énergie sur l'ADN. Des études de ce genre ont été plusieurs fois réalisées auparavant. Cependant, les molécules neutres, qui pourtant ont un rôle très important dans le dommage à l'ADN, ne sont pas assez étudiées par rapport aux ions par exemple. L'effet sur des monocouches autoassemblées ("Self Assembled Monolayers" : SAM) d'oligonucléotides (ODN) simple brin chimisorbés sur un substrat d'or a été étudié par spectrométrie de masse des espèces neutres désorbées suite à l'impact électronique. Les SAM sont bombardées à haut courant (10[indice supérieur -6] Amp) et dans une chambre à hyper vide (10[indice supérieur -9] Torr) avec des électrons ayant une énergie de 3 à 25 eV, grâce à un canon collimé magnétiquement. Nos résultats montrent que les EBE ont des effets directs et indirects sur l'ADN. Ces effets semblent être principalement des cassures de brin. Il n'y a pas eu observation de molécules de sucre ou de fragments contenant du phosphore ou encore de bases d'ADN entières. Cependant, nous observons la formation de nouvelles (pour ce type d'expériences) molécules neutres. La section efficace absolue est obtenue à partir de la pression partielle absolue des molécules neutres. Nos résultats montrent qu'en plus des mécanismes résonnants tels que l'attachement dissociatif d'électron (ADE), des excitations non résonantes (dissociations directes) sont à l'origine du dommage à l'ADN. Et les courbes de section efficace obtenues pour la majorité des molécules neutres ont la même allure que les courbes de section efficace de cassure simple brin obtenues par Cai et al. (2006). D'autre part, avec la proximité de notre substrat d'or, les rendements de désorption de fragments neutres ont pu être réduits (Rowntree et al., 1996) et par conséquent les dommages pourraient s'avérer plus importants dans le milieu biologique. Nous avons aussi suggéré quelques mécanismes de formation des molécules neutres. Les EBE ont des effets importants sur l'ADN et ces effets dépendent de l'environnement et de la topologie moléculaire de l'ADN (Abdoul-Carime et al., 2000). L'importance de ces effets implique l'action des EBE en radiobiologie et en radiothérapie.

Les travaux effectués au cours de cette thèse ont été réalisés dans le cadre du développement d'une plateforme d'irradiation protons dédiée aux études en radiobiologie (Radiograaff) à partir de l'accélérateur Van de Graaff 4 MV de l'Institut de Physique Nucléaire de Lyon. Ceci, grâce à une collaboration étroite et interdisciplinaire entre les physiciens et ingénieurs de l'Institut de Physique Nucléaire de Lyon (IPNL) et des biologistes du Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire (LRCM) du CHU de Lyon Sud. Afin de présenter le développement de la plateforme Radiograaff, ce manuscrit se découpera en trois chapitres. Le premier chapitre présente les fondements de l'hadronthérapie et le contexte scientifique du projet. Nous traiterons, dans une première partie, de l'interaction ions-matière vivante afin de mieux cerner les concepts théoriques associés à l'hadronthérapie. Et nous présenterons, dans un second temps, les intérêts scientifiques et les objectifs du projet Radiograaff. Le deuxième chapitre concernera les développements instrumentaux de la ligne d'irradiation. Après avoir discuté du mode de délivrance et d'extraction du faisceau ainsi que des méthodes de simulation que nous avons employées pour le dimensionnement théorique la ligne d'irradiation, nous présenterons le système de contrôle de la dosimétrie. Le chapitre 2 sera conclu par les résultats de l'évaluation et de la qualification de la plateforme. Enfin, dans le troisième chapitre, après une brève présentation de quelques aspects de biologie et de radiobiologie, nous présenterons les premiers résultats obtenus concernant l'efficacité biologique relative des protons délivrés par la plateforme Radiograaff. Nous discuterons des protocoles, des conditions expérimentales ainsi que des méthodes d'analyse des résultats / The work done in this thesis has been made in the development of a proton irradiation platform dedicated for radiobiological studies from the 4 MV Van de Graaff accelerator of the Institut de Physique Nucléaire de Lyon (IPNL). These developments have been made through a close interdisciplinary collaboration between physicists and engineers from IPNL and biologists from the Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire (LRCM, CHU Lyon Sud). To present the development of Radiograaff platform, this manuscript will split into three chapters. The first chapter introduces the basics of hadrontherapy and the scientific context of the project. In the first part of this chapter, we present the interactions between ion and matter in order to better understand the theoretical concepts associated with the hadrons. Then, we present the scientific interests and objectives of the Radiograaff project. The second chapter concerns the instrumental developments of the beam line. After discussing the delivery mode and beam extraction in air and simulation methods that we used to design the theoretical line radiation, we present the dosimetric monitoring system. The chapter 2 is concluded by the results of the evaluation and qualification of the platform. Finally, in the third chapter, after a brief presentation of some aspects of biology and radiobiology, we present the first results on the relative biological effectiveness of protons delivered by the Radiograaff platform. We discuss the protocols, experimental conditions and methods for analysing results

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde, trouver des traitements plus efficaces est donc d’un intérêt majeur. La radiothérapie conventionnelle utilisant des rayons X peut détruire des tumeurs, mais provoque des effets secondaires nocifs pour les tissus sains environnants. L'hadronthérapie est un outil utilisant des ions pour irradier la tumeur et qui s’avère très efficace pour le traitement du cancer. Les propriétés physiques particulières des ions permettent de mieux cibler et donc d’irradier un volume bien défini comme la tumeur. Afin de renforcer le ciblage et l'efficacité des traitements, une amplification de la mort cellulaire spécifiquement dans la tumeur est nécessaire. Pour améliorer les traitements, nous proposons une stratégie innovante qui combine des nano-médicaments et l'irradiation par des ions rapides.Nous avons déjà montré que les sels de platine renforcent fortement l’endommagement à l'ADN induit par les différentes irradiations (telles que les rayons X et les ions rapides) et accélèrent la mort des cellules. Cet effet est attribué à l'ionisation des électrons du platine en couche interne par les électrons produits le long de la trace, suivi par la désexcitation Auger du métal. Ces électrons Auger peuvent induire des dommages de façon directe ou par effet indirect via les radicaux produits dans l’eau. Le défi est de déposer ces sensibilisateurs dans la tumeur. Les développements récents en matière de nanotechnologie apportent de nouvelles perspectives par l’utilisation de nanoparticules, qui peuvent être fonctionnalisées afin de cibler des tissus spécifiques.Notre étude montre que l'irradiation avec des ions carbone provenant du HIMAC (centre médical Japonais, leader en hadronthérapie) en présence de ces nanoparticules induit une augmentation significative des dommages à l'ADN. En particulier, notre travail permet de comprendre que cette combinaison induit des dommages plus complexes que lorsque les sels de platine sont utilisés. Cet effet est expliqué par l'auto-amplification des cascades d'électrons Auger à l'intérieur des nanoparticules. Des radicaux de l'eau sont produits à l'échelle de l’ADN et conduisent à son endommagement. Cette amplification des dommages a été observée dans les cellules vivantes en présence de nanoparticules bien qu’elles se trouvent exclusivement dans le cytoplasme. L’amplification des dommages décrite pour l’ADN peut avoir lieu dans n'importe quelle molécule contenue dans le cytoplasme ce qui peut mener à la destruction d’organites.Ce travail à l'interface de la physique, de la chimie et de la biologie présente un fort intérêt pour l'élaboration de protocoles médicaux tels que l'hadronthérapie et la nanomédecine, ceci afin d’améliorer l'efficacité et la précision des traitements. / Cancer is one of the major causes of death in the world, finding more effective treatments is therefore of major interest. Conventional radiotherapy using X-rays can destroy tumors but causes harmful side effects to surrounding healthy tissues. The hadrontherapy is a powerful tool for cancer treatment which uses ions to irradiate the tumor. The particular physical properties of ions allow better targeting, and therefore, an irradiation of the well-defined volume of the tumor. In order to further enhance the targeting and the efficiency of the treatments, an amplification of the cell death rate specifically in the tumor is of strong interest. To improve treatments, we propose an innovative strategy that combines nano-drugs and irradiation by fast ions.We already showed that platinum salts enhance strongly DNA damage induced by different radiations (such as X-rays and fast ions) and accelerate cell death. This effect is attributed to the ionization of inner shell electrons of platinum by the electrons produced along the track, followed by Auger de-excitation of the metal. These Auger electrons can induce damage by direct or indirect effect (water radicals mediated). The challenge is to locate these sensitizers in the tumor. Recent developments in nanotechnology pointed out new perspectives by using nanoparticles, which can be functionalized to target specific tissues.Our study shows that irradiation with carbon ions from HIMAC (Japanese medical center, leader in hadrontherapy) in presence of these nanoparticles induces a significant increase of DNA damage. In particular, our work helps to understand that this combination induces more complex lethal damage compared to platinum salts. This effect is explained by the auto-amplification of Auger electron cascades inside the nanoparticles. Numerous water radicals are produced at DNA scale leading to its damage. Same observation of damage amplification has been made in living cells loaded with nanoparticles while they stay exclusively in the cytoplasm. The amplification of damage described on DNA can occur in a cytoplasm included molecule and may induce organelle destruction.This work at the interface of physics, chemistry and biology finds strong interest for developing medical protocols such as hadrontherapy and nanomedicine improving effectiveness and accuracy of treatment.

Les travaux présentés dans ce document retracent mes activités de Recherche dans le domaine de la Biologie Cellulaire et Moléculaire, qui m'ont conduit de la Toxicologie Génétique à la Radiobiologie. L'action des génotoxiques sur le patrimoine héréditaire a toujours constitué le fil conducteur de mes activités. A chaque étape de mon parcours, j'ai développé des modèles biologiques destinés à répondre à des thématiques bien précises. <br />Mon travail de recherche a commencé pendant deux ans à Rhône Poulenc (1985 1986) par le test de la réparation de l'ADN in vitro et in vivo (UDS ou unscheduled DNA synthesis) sur hépatocytes de rats Sprague Dawley et Fischer 344. Ce test de « dommages primaires » permet de prédire l'activité génotoxique des xénobiotiques. Dans l'approche in vivo, mon étude mettait en évidence l'importance du métabolisme intestinal dans l'activation métabolique de certains agents génotoxiques indirects (dérivés dinitrotoluène). J'ai ensuite débutée une approche plus fondamentale au CNRS (1988 1992). En utilisant les outils de la Génétique Moléculaire, j'ai créé un nouveau modèle cellulaire exprimant un système de régulation génique qui permet de détecter rapidement les agents modifiant le profil de méthylation de l'ADN au niveau des sites 5'CpG3'. Ces xénobiotiques, à l'origine des « épimutations » et de la dérégulation de l'expression de certains gènes, ont une contribution importante et souvent sous estimée dans la progression tumorale.<br />En 1992, je me suis orienté vers la Radiobiologie au DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum ; Heidelberg, Allemagne) puis au CEA (LRA). Il s'agissait d'adapter à la Radiobiologie le modèle de culture de la peau humaine reconstituée in vitro, destiné auparavant à étudier la physiologie des kératinocytes normaux ou pathologiques. L'objectif était (i) d'irradier les spécimens de peau et d'étudier les effets d'une irradiation sur les kératinocytes et les fibroblastes), et (ii) de mimer in vitro la fibrose radioinduite. Ce modèle de culture alternatif prend en compte les interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Au cours de ce travail, je me suis intéressé à la protéine humaine HSAkin17. Mon activité s'est alors recentrée sur cette protéine. Le développement de nombreuses approches cellulaires et moléculaires au laboratoire (LGR) nous a permis de mettre en évidence l'implication de cette protéine dans la réplication de l'ADN, notamment lorsque la progression des fourches de réplication est bloquée par des dommages non réparés de l'ADN. Nous avons démontré que cette protéine était un composant nécessaire au complexe de réplication de l'ADN et qu'elle avait une activité de reconnaissance des origines de réplication endogènes.<br />Depuis la fin 2003, j'ai développé et valider les vecteurs pEBVsiRNA pour une interférence ARN (RNAi) à très long terme (> 500 jours). Ce travail a été mené sur de nombreux gènes (110 gènes ciblés), essentiellement des gènes de la réparation de l'ADN. Un brevet a été déposé en 2005. Cette approche nous permet maintenant de travailler sur les interconnexions entre les mécanismes de réparation de l'ADN dans des lignées isogèniques. A ce jour, je suis le seul à proposer un tel modèle cellulaire cohérent avec un aussi grand nombre de clones stables, maintenus en culture aussi longtemps. La création de clones silencieux, stables à très long terme, m'a permis de participer à l'élaboration de nouveaux projets de Recherche dans le cadre de nombreuses collaborations, dont certaines seront énoncées dans ce rapport. Par ailleurs, ma démarche a aboutit à une valorisation industrielle.

L'hadronthérapie est une technique de traitement de cancer basée sur l'utilisation de particules lourdes chargées. Les caractéristiques physiques de ces particules permettent un ciblage plus précis des tumeurs et une efficacité biologique supérieure à celle des photons et des électrons. Ce travail de thèse traite la problématique de la modélisation des effets biologiques induits par ce type de particules. Une partie de ce travail est consacrée à l'analyse de l'outil de simulation Monte‐Carlo " Geant4 ", utilisé pour simuler la phase physique de l'interaction des particules avec le milieu biologique. Nous avons évalué la capacité de " Geant4 " à simuler la distribution microscopique des dépôts d'énergie des particules chargées et confronté ces résultats à ceux d'un autre code de simulation dédié aux applications de radiobiologie. L'autre partie du travail est dédiée à l'étude de deux modèles radiobiologiques basés sur deux approches différentes qui sont le modèle LEM (Local Effect Model) basé sur une approche de trace amorphe et le modèle MKM (Microdosimetric Kinetic Model) basé sur une approche microdosimétrique. Une analyse théorique des deux modèles est effectuée ainsi qu'une comparaison de leurs concepts. Ensuite, nous nous sommes focalisé sur le modèle microdosimétrique " MKM " que nous avons analysé de manière plus approfondie. Enfin, nous avons appliqué le modèle MKM pour reproduire les résultats expérimentaux d'irradiation cellulaire obtenus au GANIL avec des ions carbone et argon sur des cellules tumorales (lignées SCC61 et SQ20B) de radiosensibilité différente.

Le traitement du lymphome B non hodgkinien (NHL) est généralement basé sur la combinaison d’un anticorps monoclonal anti-CD20, le rituximab, et de la chimiothérapie. Cependant, de nombreux patients deviennent réfractaires au ciblage du récepteur CD20. Dans cette thèse, l’effet d’un nouvel anticorps monoclonal anti-CD37 conjugué au Luthétium-177 (177Lu-lilotomab, Betalutin®) est étudié dans des modèles précliniques de lymphome non hodgkinien et comparé au rituximab radiomarqué au luthétium-177 (177Lu-rituximab). Nous avons développé une approche radiobiologique qui distingue les effets cytotoxiques dus à l’anticorps monoclonal et dus aux rayonnements ionisants dans des lignées cellulaires de lymphome humain. Cette méthode a permis de montrer qu’in vitro, le rituximab et le 177Lu-rituximab étaient plus cytotoxiques que le lilotomab et le 177Lu-lilotomab dans la lignée cellulaire radiorésistante Ramos (modèle du lymphome de Burkitt). Inversement, le 177Lu-lilotomab et le 177Lu-rituximab ont montré la même cytotoxicité dans la lignée cellulaire radiosensible DOHH2 (modèle de lymphome folliculaire transformé). Leur cytotoxicité était plus faible dans la lignée cellulaire Rec-1 (modèle du lymphome du manteau) que dans les cellules DOHH2. Ces résultats ont été confirmés in vivo sur des souris traitées par injection intraveineuse après xénogreffe sous-cutanée de cellules Ramos ou DOHH2. Le 177Lu-lilotomab et le 177Lu-rituximab ont montré la même efficacité thérapeutique chez les souris xénogreffées avec les cellules radiosensibles DOHH2, alors que le lilotomab non radiomarqué était moins efficace que le rituximab. Inversement, chez les souris xénogreffées avec les cellules radiorésistantes Ramos, la plus faible efficacité du 177Lu-lilotomab comparé au 177Lu-rituximab peut seulement être compensée par une augmentation de dose absorbée à la tumeur par le 177Lu-lilotomab. Mécanistiquement, la réponse cellulaire des tumeurs aux radiations dépend de la réponse apoptotique des cellules et de la réduction de l’arrêt en G2/M du cycle cellulaire via les phosphorylations médiées par WEE-1 et MYT-1 de la kinase dépendante des cyclines-1 (CDK1) sur la tyrosine 15 et thréonine 14. Ces résultats indiquent que l’interaction synergistique entre les effets cytotoxiciques du 177Lu et du lilotomab dans les tumeurs montrant une réduction des niveaux de phosphorylations de CDK1 peut compenser le manque d’efficacité thérapeutique du lilotomab comparé au rituximab. / Currently, B-cell Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) treatment relies on the anti-CD20 antibody rituximab and chemotherapy. However, some patients become refractory to this therapy. Here, the effect of the novel anti-CD37 antibody-radionuclide conjugate 177Lu-lilotomab (Betalutin®) was investigated in NHL preclinical models and compared to 177Lu-labeled rituximab (anti-CD20 antibody). We developed a radiobiological approach that discriminates between the cytotoxic effects of unlabeled antibodies and of radiation in human lymphoma cell lines. This method allowed showing that in vitro, rituximab and 177Lu-rituximab were more cytotoxic than lilotomab and 177Lu-lilotomab in the radioresistant Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Conversely, 177Lu-rituximab and 177Lu-lilotomab had similar efficacy in the radiosensitive follicular lymphoma DOHH2 cell line. Their cytotoxicity was lower in mantle cell lymphoma Rec-1 cells that are less radiosensitive than DOHH2 cells. These results were confirmed in vivo in mice treated by intravenous injection of these antibodies after subcutaneous xenografts of Ramos or DOHH2 cells. 177Lu-lilotomab and 177Lu-rituximab showed the same therapeutic efficacy in mice xenografted with radiosensitive DOHH2 cells, although unlabeled lilotomab was less efficient than rituximab. Conversely, in mice xenografted with radioresistant Ramos cells, the lower efficacy of 177Lu-lilotomab compared with 177Lu-rituximab could only be compensated by increasing 177Lu-lilotomab tumor absorbed dose. Mechanistically, the tumor cell response to radiation depended on the cell apoptotic response and reduction of G2/M cell cycle arrest through WEE-1 and MYT1-mediated phosphorylation of cyclin-dependent kinase-1 (CDK1) at tyrosine 15 and threonine 14. These results indicate that the synergistic interaction between 177Lu irradiation and lilotomab cytotoxic effects in tumors with reduced CDK1 phosphorylation levels can correct the lower therapeutic efficacy of lilotomab compared with rituximab.

The central hypothesis supporting the present work is that the effectiveness of radiation therapy for cancer is often limited due to defects in key apoptosis regulators, such as Bcl-2 family members, that contribute to cancer ability to evade apoptosis. One way to bypass this resistance to radiotherapy is to target cell death pathways, aiming to sensitize tumours to radiation and enhance the therapeutic ratio in cancer. To test this central hypothesis, we took a dual approach: one targeted apoptosis and the other targeted autophagy. / First, we focused on the apoptotic signaling. The Bcl-2 family comprises antiapoptotic members, such as Bcl-2, Mcl-1, and Bcl-XL, and proapoptotic members, such as Bax, Bak, and Bid. The Bcl-2 family controls the integrity of the outer mitochondrial membrane and is critical in determining the susceptibility of cells to apoptosis induced by the intrinsic pathway. The balance between cell survival and cell death is modulated by the ratios and interactions of antiapoptotic and proapoptotic Bcl-2 family proteins. Overexpression of Bcl-2 or Bcl-XL is observed in several cancers, including lung, colorectal, prostate, and breast cancers, and has been shown to confer resistance to various anticancer agents, including radiotherapy. In cancer cells, alterations in the amounts of these antiapoptotic Bcl-2 proteins promote cell survival, among others by contributing to their evasion from treatment-induced apoptosis. We made the observation that lung cancer cells have different radiosensitivity. On the basis of their relative response to radiotherapy, we stratified lung cancer cells into two groups (higher or lower sensitivity), and selected a representative cell line of each group for more in-depth study: A549 (resistant) and HCC2429 (sensitive). We found that the expression levels of Bcl-XL expression, which is antiapoptotic, was dramatically higher in A549, whereas almost not detected in HCC2429. We then hypothesized that AT-101, a pan-Bcl-2 inhibitor, had the potential to radiosensitize lung cancer by restoring radiation-induced apoptosis. When administered alone, AT-101 resulted in increased apoptosis in a concentration-dependent manner in both groups, with enhanced activity in HCC2429 even at lower concentration. Furthermore, AT-101 promoted radiosensitivity of A549 and HCC2429 cells (p < 0.005). A549 cells required increased AT-101 dose to achieve the same level of cytotoxicity than HCC2429 cells. These investigations suggest that the Bcl-2 family members may serve as effective therapeutic targets in lung cancer. However, the potential of AT-101 as an agent that enhances the therapeutic ratio of radiotherapy varies depending on the lung cancer clone. / Next, we turned to a different approach, focusing on the inhibition of apoptosis instead of its promotion. This work hypothesis was based on previous observations looking at the role of radiation-induced apoptosis by knockdown of Bak and Bax. The radiosensitivity of breast and lung cancer in vitro was increased through autophagy, an alternate type of programmed cell death. Consistently, radiation-induced apoptosis accounts for a minor portion of cell death in irradiated solid tumors. The hypothesis of our work was that apoptosis inhibition would increase radiation-induced autophagy and tumor sensitivity to radiation. To block apoptosis, we used Z-VAD, a broad-spectrum caspase inhibitor, and examined its in vitro and in vivo effects on breast and lung cancer models. Z-VAD markedly radiosensitized breast and lung cancer cells in vitro, with a radiation dose enhancement ratio of 1.31 (P < 0.003). The enhanced tumor cytotoxicity was associated with induction of autophagy. In both breast and lung cancer mice xenograft models, the administration of Z-VAD concurrent with radiation produced a significant tumor growth delay compared with radiation alone and was well tolerated. Interestingly, Z-VAD also had a dramatic antiangiogenic effect when combined with radiation both in vitro and in vivo. Thus, Z-VAD represents an attractive anticancer therapeutic strategy. We further explored the potential of apoptosis inhibition as a way to sensitize cancer to radiation using a more selective chemical, M867, which is a reversible caspase-3 inhibitor. In an in vivo mouse hind limb lung cancer model, the administration of M867 with ionizing radiation was well tolerated, and produced a significant tumor growth delay compared with radiation alone. A dramatic decrease in tumor vasculature and tumor cell proliferation was observed with M867 despite the reduced levels of apoptosis. The radiosensitizing effect of M867 through the inhibition of caspases was validated using a caspase-3/-7 double-knockout (DKO) mouse embryonic fibroblasts (MEF) cell model. Consistent with our previous results, autophagy contributed to the mechanism of increased cell death, following inhibition of apoptosis. Finally, we investigated the mechanism by which radiation triggers autophagy in caspase-3/7-deficient cells, and found the involvement of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER activates a survival pathway, the unfolded protein response, which involves ER-localized transmembrane proteins such as protein kinase-like ER kinase (PERK), inositol-requiring enzyme-1, and activating transcription factor-6. In this study, we found that PERK is essential for radiation-induced autophagy and radiosensitivity in caspase-3/7 double-knockout cells. Irradiation of these cells increased expression of phosphorylated-eIF2a. Similar results were seen after administration of tunicamycin (TM), a well-known ER stress inducer. We found that the administration of TM with radiation in MCF-7 breast cancer cells, which are lacking functional caspase-3 and are relatively resistant to many anticancer agents, enhances radiation sensitivity. Our findings revealed ER stress as a novel potential mechanism of radiation-induced autophagy in caspase-3/7-deficient cells and as a potential strategy to maximize efficiency of radiation therapy in breast cancer. Our data suggested that caspase-3 has a critical role in modulating the PERK/eIF2a pathway after radiation. / Many cancers exhibit multiple deregulations in cell death pathways, allowing for the subsequent promotion of tumor cell survival, and contributing to a relatively low response rate to therapies based on the use of pro-apoptotic strategies. As we have showed, there is a potential for novel anticancer strategies to overcome resistant cancer cells with defective apoptosis machinery in order to improve overall therapeutic outcomes. Such novel approach is to drive cancer cells towards autophagy, as demonstrated by our experiments that studied the effect of radiation on the induction of autophagy in caspase-deficient models. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en Sciences de la santé publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished