Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T13:59:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoGanharPerder.pdf: 1328809 bytes, checksum: 821ec1367eba2a3907940f17c6ff59b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-05T17:51:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoGanharPerder.pdf: 1328809 bytes, checksum: 821ec1367eba2a3907940f17c6ff59b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T17:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoGanharPerder.pdf: 1328809 bytes, checksum: 821ec1367eba2a3907940f17c6ff59b1 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A agressão e um comportamento que envolve uma ativação simultânea de componentes fisiológicos, bioquímicos, neurológicos e comportamentais e emoções, como ansiedade e raiva. Nos seres humanos, os esportes podem ser considerados como uma forma de display, pois permitem que a agressão seja expressada com uma baixa probabilidade de danos permanentes para os sujeitos. As competições tem sido usadas como modelos para avaliar a ativação produzida pelas diferentes fases de competição, tal como o resultado do combate. O judô tem sido utilizado como um modelo de agressão competitiva para avaliar as diferentes respostas corporais nos comportamentos agonisticos em seres humanos, pois oferece um contexto semelhante aos estudados nas lutas em animais. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do ganhar/perder nos níveis de raiva e ansiedade em lutadores de judô regional, do sexo masculino, vinculados a federação paraense de Judô, utilizando as escalas psicométricas STAXI e IDATE, assim como fazer uma comparação destes resultados com a população geral brasileira e uma análise de correlação para conhecer as diferenças entre os diferentes componentes com o numero de golpes, utilizando uma avaliação pré e pós lutas e a filmagens das lutas. Se encontraram diferenças entre vencedores e perdedores, assim como entre lutadores e a população brasileira; os perdedores apresentaram maiores níveis de raiva, enquanto que a ansiedade foi maior para os vencedores. / Aggression is a behavior that involves a simultaneous activation of physiological, biochemical, neurological and behavioral components and emotions, such as anxiety and anger. In humans, sports can be considered as a form of display because they allow aggression to be expressed with a low probability of permanent damage to subjects. The competitions have been used as models to evaluate the activation produced by the different stages of competition, such as the outcome of the combat. Judo has been used as a model of competitive aggression to evaluate the different body responses in agonistic behaviors in humans, since it offers a context like those studied in animal fights. The aim of this study was to evaluate the effect of win / lose in the levels of anger and anxiety in regional judo fighters, male, linked to the Para Federation of Judo, Using the STAXI and IDATE psychometric scales, as well as comparing these results with the Brazilian general population and a correlation analysis to know the differences between the different components with the number of strokes, using a pre/post fight evaluation and the filming of the fights. Differences were found between winners and losers, as well as between fighters and the Brazilian population; The losers presented higher levels of anger, while the anxiety was greater for the winners.

Este estudo teve como objetivo detectar a presença do vírus da raiva em diferentes órgãos de morcegos do gênero Artibeus empregando as técnicas moleculares como RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR. De aproximadamente 4000 espécimes de morcegos recebidas no Instituto Pasteur para o diagnóstico da raiva, foram selecionados 30 morcegos do gênero Artibeus, com resultados positivos para raiva pelas técnicas tradicionais de IFD e inoculação em células N2A utilizando suspensões feitas a partir do SNC. Para as técnicas moleculares, foram retirados glândulas salivares, bexigas urinárias, rins, pulmões e conteúdos fecais e ainda foram lavadas as calotas cranianas dos espécimes. Os órgãos e conteúdos fecais foram diluídos a 1:10 (P/V) e as bexigas urinárias a 1:20 (P/V). As suspensões foram inoculadas em células N2A para o isolamento viral. Foi realizada a extração do RNA total usando o TRIzol®, foram realizadas a transcrição reversa seguida da PCR e hnRT-PCR com utilização de primers específicos para o gene codificante da proteína N. A partir do produto da transcrição reversa foi realizada a técnica de Real Time RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para variante antigênica 3. Das 30 suspensões de lavado cerebral, 28 (93,33%) resultaram positivos, na inoculação em cultura de células, seguido de glândulas salivares (36,67%), bexigas (16,67%) e conteúdos fecais (3,33%). Os resultados encontrados da sensibilidade nas técnicas de RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 56,25%, 82,57% e 82,19% quando avaliadas as 180 amostras analisadas. A comparação das técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR feita pelo teste exato de Fisher quanto a proporção de positivos detectados mostrou que para o lavado cerebral, órgãos e conteúdos fecais a proporção foi igual (P>0,05). Em relação à positividade os resultados encontrados nas técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 100% em lavado cerebral; 90% e 93,33% em glândulas salivares; 83,33% e 90% em bexigas; 80% e 93,33% em rins; 76,67% e 50% em pulmões e 43,33% em ambas as técnicas em conteúdos fecais. Esses resultados sugerem que tanto as técnicas de hnRT-PCR como Real Time RT-PCR podem ser utilizadas como métodos complementares para o diagnóstico da raiva e são sensíveis o bastante para o uso em estudos de patogênese. A técnica de Real Time RT-PCR realizada neste estudo se mostrou eficiente em detectar o RABV em diferentes órgãos e tecidos extraneurais com a vantagem de ser uma técnica mais rápida e sensível. / This study was aimed to detect the presence of rabies virus in different organs of the genus Artibeus bats using molecular techniques such as RT-PCR, hnRT-PCR, and the Real Time RT-PCR. From about 4,000 specimens of bats received for rabies diagnosis at the Pasteur Institute, 30 bats of the genus Artibeus were then selected. The selected bats presented positive results by the traditional DFA and N2A-cells inoculation test using brain tissue suspensions. Samples of salivary glands, urinary bladders, kidneys, lungs, and fecal contents and washings of the skulls were collected for the molecular techniques testing. The organs and the fecal contents were diluted at 1:10 (w/v) and the urinary bladder, at 1:20 (w/v) and these suspensions were inoculated into N2A cells for viral isolation. The extraction of the total RNA was performed by using TRIzol® and followed by the reverse transcription and the PCR and the hnRT-PCR were performed by using specific primers for the gene encoding the protein N. The product obtained by the reverse transcription technique was submitted to the Real Time RT-PCR technique, using primers and probe specific for antigenic variant 3 of the rabies virus. Of the 30 suspensions of the brain washings, 28 (93.33%) were positive in N2A cell culture inoculation, followed by the suspensions of the salivary glands (36.67%), bladders (16.67%) and fecal contents (3.33%). For the 180 samples evaluated, the results of sensitivity found for the RT-PCR, hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques were 56.25%, 82.57%, and 82.19%, respectively. A comparison of hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques performed by Fisher\'s exact test showed that the proportion of positives detected by the brain washings, organs and of the fecal content was non-significant (P> 0.05). Regarding the results found in hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques, 100% positives were in brain washing, 90% and 93.33% in salivary glands, 83.33% and 90% in bladders, 80% and 93.33% in kidneys, 76.67% and 50% in lungs and 43.33% for both techniques on fecal contents. These results suggest that both hnRT-PCR and Real-Time PCR techniques can be used as complementary methods for the diagnosis of rabies and are sensitive enough for use in pathogenesis studies. The Real Time RT-PCR technique performed in this study proved to be faster and more sensitive and effective in detecting RABV in different organs and extra neural tissues of bats.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WanessaBM_DISSERT.pdf: 2965999 bytes, checksum: 15229eda004f6eb0eefb1d93516bce41 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rabies is a viral disease that affects the central nervous system, causing encephalitis and almost 100% lethality once the signs and symptoms start. This study describes the genetic characterization of rabies virus strains isolated in samples from domestic and wild animals acquired in the states of Rio Grande do Norte, Paraíba and Pernambuco in the period of 2001 to 2012, aiming to contribute to the understanding of the molecular epidemiology of rabies. Eighty fivesamplespositivethrough direct immunofluorescenceandbiological test,provided by theCentral Laboratoryof Public Healthof RioGrande do Norte(LACEN-RN) and theRabies Laboratoryof the Federal Universityof CampinaGrande(UFCG-Campos Patos) were analyzed, and underwent RT-PCR directedto thenucleoprotein geneand subsequentlysequencing was performed.In this study67% ofsampleswere positiveinRT-PCR and 40% presented viablesequences. Theaggregation patternobtainedin the phylogenetic treeresulted in the formationof the main expectedgroupsof rabies virussamples, i.e., antigenic variants2, 3; insectivorous batvariant;andfixed sample(CVS).The study andconstant monitoringof these variantsare extremely important, sincegenetic changescanlead toproteinmodifications, andwith itvaccineinefficiency / A raiva é uma enfermidade de origem viral, que afeta o sistema nervoso central, ocasionando encefalite e praticamente 100% de letalidade uma vez iniciados os sinais e sintomas. Este estudo descreve a caracterização genética das cepas de vírus rábico isoladas de amostras de animais domésticos e silvestres nos Estados do Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco no período de 2001 a 20012 visando contribuir para o entendimento da epidemiologia molecular da raiva. Foram analisadas 85 amostras positivas pela imunofluorescência direta e prova biológica cedida pelo Laboratório Central de Saúde Pública do Rio Grande do Norte (LACEN-RN) e o Laboratório de Raiva da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG-Campus Patos) e submetidas a RT-PCR direcionada ao gene da nucleoproteína e posterior sequenciamento.No presente estudo 67% da amostras apresentaram positividade na RT-PCR e 40% apresentaram sequencias viáveis. O padrão de agregação obtido na árvore filogenética resultou na formação dos principais grupos esperados de amostras do vírus da raiva, ou seja, variante antigênica 2, 3 e variante de morcego insetívoro e amostra fixa (CVS). O estudo e a monitoração constante dessas variantes são de extrema importância, pois alterações genéticas podem levar a modificações protéicas, e com isso ineficiência vacinal

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4615.pdf: 2688296 bytes, checksum: 18c8fbe6fb83004856a32c02827d70f5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Rabies is a zoonotic viral disease caused by a virus of the genus Lyssavirus that affects several species of mammals. Rabies remains a global public health threat that kills more than 55,000 people per year mainly in developing countries, this disease once established do not have a specific treatment. The RV envelope is composed of a glycoprotein, known as a unique antigen capable of conferring immune response against the rabies, and therefore, is the focus of research for development an efficient and safe recombinant vaccine based on this viral antigen. Cell line stably transfected S2 Drosophila melanogaster have been used in the production of many heterologous proteins and has been studied for the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP) in our laboratory. This approach involves the selection of high producing cell populations; procedure that requires considerable periods of time (months), increasing management and costs of production. In this sense, in recent decades, many systems focused on the expression of heterologous proteins by transient expression of genes, were analyzed because they allow obtaining significant quantities of recombinant protein in a short period of time (weeks). For the use of transient transfection technology can be found a variety of methods and available agents, such as electroporation, cationic lipids, cationic polymers and calcium phosphate precipitated. The choice and optimization of each of them depends mainly on the cell type and protein being expressed. Thus, the objective of this study was to evaluate the transient expression of the glycoprotein gene of rabies virus (RVGP) in insect cells of Drosophila melanogaster S2 lineage, evaluating the vehicles transfection: calcium phosphate, cationic lipid (Cellfectin) and cationic polymer (ExGen500 and JetPEI). In order to determine the most efficient transfection agent, experiments were performed in 6 well plate and bottle of 100 mL of culture, which analyzed the influence of cell density, the concentration of DNA and transfection reagent volume on the expression of RVGP assessed by ELISA and fluorescence microscopy. Yields ranging from 50-90 ng/107cel were obtained in different experiments on multiwell plate, suggesting strong effect of ratio DNA: transfection agent used. Comparison of transfection agents showed no significant differences. In transfections made in suspension culture was analyzed the effect of the plasmid (whether or not the signal of BiP cell secretion) on the expression RVGP. When we used the plasmid containing the signal BiP (pMTiRVGP) were obtained 160 ng/107cel of RVGP production, and 200 ng/mL of volumetric production without significant differences between the different transfection agents. However, significant differences were found when we used the plasmid not containing the signal BiP (pMTRVGP), with the RVGP production was 60 ng/107cells in cells transfected with Cellfectin, ExGen500 and calcium phosphate, except in cells transfected with JetPEI was reached a production of 120 ng/107cells. In preliminary experiment bottle type "spinner" with a working volume of 60 mL were achieved expressions of 140 ng/107cel of RVGP in cells transfected with JetPEI and calcium phosphate. This suggests that optimization of culture conditions and transfection are possible to increase recombinant protein expression in cultured on a large scale. / A raiva é uma enfermidade causada por um vírus do gênero Lyssavirus que afeta várias espécies de mamíferos. Esta doença apresenta um alto custo social e econômico principalmente em países em desenvolvimento. Na superfície do vírus da raiva está localizada a glicoproteína do vírus, reconhecida como antígeno capaz de conferir resposta imunológica contra a raiva, sendo, o foco de pesquisas no desenvolvimento de uma vacina recombinante. Células da linhagem Drosophila melanogaster S2 estavelmente transfectadas têm sido usadas na produção de muitas proteínas heterólogas e tem sido estudada para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em nosso laboratório. A abordagem para a obtenção de linhagens recombinantes estáveis envolve a seleção de populações celulares altamente produtoras; sendo um processo que requer consideráveis períodos de tempo (meses), uma elevada manipulação e altos custos de produção. Neste sentido, nas últimas décadas, muitos sistemas focados na expressão de proteínas heterólogas através da expressão transiente de genes foram analisados, porque eles permitem a obtenção de quantidades consideráveis de proteína recombinante em um curto período de tempo (semanas). Para o uso da tecnologia de transfecção transiente pode ser encontrada uma variedade de métodos e agentes disponíveis, tais como eletroporação, lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e fosfato de cálcio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão transiente do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2, avaliando os veículos de transfecção fosfato de cálcio, lipídeo catiônico (Cellfectin) e polímero catiônico (ExGen500 e JetPEI). A fim de determinar o agente de transfecção mais eficiente, foram feitos experimentos em placa de 6 poços e frasco de cultivo de 100mL, onde foram analisados a influência da densidade celular; a concentração de DNA, o volume do reagente de transfecção sobre a expressão da RVGP analisada através do método de ELISA. Quantidades de RVGP que variaram entre 50-90 ng/107cel foram obtidas nos diferentes experimentos feitos em placa, sugerindo um efeito da relação DNA: agente de transfecção. A comparação entre os agentes de transfecção não mostrou diferenças significativas. Nas transfecções feitas em cultura em suspensão foi analisado o efeito de transfectar o plasmídeo para expressão de RVGP contendo ou não o sinal de secreção celular BiP. Quando foi usado o plasmídeo contendo o sinal BiP (pMTiRVGP) foram atingidas valores de RVGP de 160 ng/107cel e produções volumétricas de 200 ng/mL, porém sem diferenças significativas entre os diferentes agentes de transfecção. Entretanto, foram encontradas diferenças quando foi usado o plasmídeo não contendo o sinal BiP (pMTRVGP), onde a produção de RVGP foi de 60 ng/107cells nas células transfectadas com Cellfectin, ExGen500 e fosfato de cálcio, porém as células transfectadas com JetPEI obtiveram uma produção de 120 ng/107cels de RVGP. Em experimento em frasco de cultivo tipo spinner com volume de trabalho de 60 mL, foram atingidas expressões de RVGP de 140 ng/107cel para células transfectadas com JetPEI e fosfato de cálcio, sugerindo que otimizações nas condições de cultivo e transfecção ainda podem ser testadas visando aumentar a expressão da proteína recombinante em cultivos em larga escala.

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

Objetivo: Realizou-se um estudo, no período de 2002 a 2009, com a finalidade de verificar se as mudanças nas classes de cobertura da terra e no uso do solo podem exercer influência na ocorrência da raiva, nos municípios de Jacareí e de Santa Branca, situados na Região do Vale do Paraíba, no Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil. Métodos: A ferramenta utilizada para avaliar estas alterações foi o sensoriamento remoto, através de imagens de satélite Land-sat. Para pesquisar a presença do vírus da raiva (RABV) foram coletados animais silvestres atropelados nas rodovias, morcegos encontrados na área urbana em atitude suspeita, morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus e animais de interesse econômico (ADIE) que vieram a óbito por enfermidade com sintomatologia nervosa. O material coletado, sistema nervoso central (SNC), desses animais foi encaminhado para o laboratório de referência nacional, o Instituto Pasteur de São Paulo (IP-SP) e para o Laboratório de Sanidade Animal da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA)- Pólo Regional do Vale Paraíba (PRDTA/VP) - Pindamonhangaba-SP. A determinação da presença do antígeno viral foi feita através da prova de imunofluorescência direta (IFD) e o isolamento do vírus através da inoculação intracerebral em camundongos (IC). Os inóculos das amostras foram submetidos à prova de reação em cadeia pela polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) para verificar a presença do vírus da raiva. Resultados: No período de estudo tivemos a ocorrência de dez casos da doença, sendo três em morcegos insetívoros na zona urbana de Jacareí, e sete em ADIE, sendo dois, em Jacareí e cinco, em Santa Branca. Todos os animais silvestres terrestres examinados foram negativos para a presença do vírus da raiva em todas as provas realizadas (IFD, IC, RT-PCR). O material proveniente dos morcegos foi negativo para as provas de IFD e IC, porém três amostras, oriundas de morcegos insetívoros, resultaram positivas para a prova de RTPCR. As amostras de ADIE examinadas resultaram positivas para todas as provas realizadas. O sequenciamento genético utilizou amplificações referentes à glicoproteína viral das 8 amostras positivas para rt-pcr, obtendo para os cinco isolados de ADIE linhagem de desmodus rotundus e para os três isolados de morcegos linhagens de nyctinomops laticaudatus e tadarida brasiliensis. Quando foi estudada a cobertura do solo e seu uso, considerando os municípios, constatou-se que não haviam ocorrido mudanças significativas entre 2002 e 2009. Optou-se por fazer buffers de raio de 3 km tendo como centro de cada buffer as coordenadas geográficas de casos positivos para raiva. Como em duas situações houve sobreposição entre áreas de buffers, resolveu-se considerar a área da união dos mesmos. Foi interessante que, mesmo nestes buffers não houve mudanças significativas, apesar da ocorrência da doença. Conclusão: Na escala utilizada, considerada micro, a enfermidade aconteceu, mesmo sem mudanças aparentes na região. Provavelmente, em uma escala macro outros resultados poderiam ser obtidos / Objective: This study was carried out during the period of 2002-2009, with the purpose to verify whether the changes in types of land cover and in land use can influence the occurrence of rabies in Jacareí and Santa Branca, situated in the Vale do Paraíba, State of São Paulo, southeastern brazil. Methods: The tool used to evaluate these alterations was the remote sensing through images of satellite land-sat. In order to search for the presence of rabies virus, brain materials were collected from wild animals roadkilled in highways, bats found in the urban area in suspicious attitude, desmodus rotundus hematophagous bats captured in rural areas and farm animals of economic importance (aei) dead with suspect of rabies. For rabies diagnosis, specimens of central nervous system (cns) of these animals were sent to the Pasteur Institute of São Paulo (IP-SP) - national reference laboratory and to the laboratory of animal Paulista Agency for Agribusiness Technology (APTA) - Polo Valley Regional of Paraíba (PRDTA / VP), in Pindamonhangaba, state of SP. The presence of viral antigen was determined by the direct fluorescent antibody technique (D-FAT) and the isolation of the virus by means of intracerebal mouse inoculation test (MIT). The brain suspensions were submitted to reverse transcriptase. Polymerase chain reaction to check the presence of rabies virus. Results: In the period of study, 10 positive cases were detected, being 3 in insectivorous bats in the urbane zone of jacareí, and 7 in aei, being 2 in jacareí and 5 in santa branca. All the terrestrial wild animals examined were negative for the presence of rabies virus in all tests performed (d-fat, mit, and rt-pcr). The materials from bats were found negative for the d-fat and mit, however, three samples originating from insectivorous bats turned out to be positive for rt-pcr. The positive samples from aei were positive for all tests carried out. The genetic sequencing of the g gene of eight rt-pcr positive rabies virus isolates derived from aie, five corresponded to the desmodus rotundus lineage and the three bat isolates were related to lineages of nyctinomops laticaudatus and tadarida brasiliensis. When land coverage and its use were analyzed, considering the municipalities, it was found that no significant changes occurred between 2002 and 2009. Then buffers of 3 km in radius were chosen taking as the center of each buffer the geographical coordinates of positive rabies cases. Since in two situations there was superposition between areas of buffers, it was resolved to consider the junction area of the buffers. Even in these buffers there was no significant change, despite the occurrence of the disease. Conclusion: it was concluded that the disease has occurred even without any apparent changes in the region, due to the (micro) scale used in this study. Probably, in a macro scale, other results might be obtained

As células de Drosophila melanogaster (S2) têm sido utilizadas como sistemas de expressão de proteínas recombinantes. Neste trabalho foi utilizada uma linhagem S2 geneticamente modificada com vetores de expressão para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV). O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento destas células cultivadas em processo contínuo, visando-se manter elevadas concentrações celulares. Para os ensaios contínuos, utilizou-se meio livre de soro fetal bovino SF 900 II em um reator Biostat B, com 500 mL de volume útil e controle de temperatura (28ºC), oxigênio dissolvido (30% da saturação com ar), frequência de agitação (90 rpm) e monitoramento do pH. Verificou-se o comportamento do metabolismo celular em diferentes vazões específicas de alimentação (0,8 dia-1, 0,5 dia-1 e 0,2 dia-1) através parâmetros como fatores de conversão e variáveis como concentração celular máxima, concentração residual de glicose e glutamina, dentre outras. Ainda, avaliou-se a influência de aminoácidos, tais como, glutamina, asparagina, prolina, serina e cisteína suplementados no meio de alimentação, sob a concentração celular alcançada no estado estacionário. Diferentes vazões específicas de alimentação - em estado estacionário - resultaram em concentrações celulares próximas entre si. A adição de glutamina (1,7 g/L) no meio de alimentação não contribuiu para o aumento na concentração celular, indicando que este aminoácido não limitou o processo de crescimento celular. Uma observação similar ocorreu quando o meio SF 900 II foi suplementado com asparagina, prolina, serina e cisteína. Porém, a adição de cisteína (0,3 g/L) isoladamente no meio de alimentação resultou em um aumento de 12% na concentração celular quando comparada ao meio SF 900 II puro. Assim, pode-se concluir que a cisteína limitava o crescimento celular. Verificou-se ainda que a célula não apresentou grande variabilidade nos diferentes ensaios, sob mesma vazão específica de alimentação. Isso indica que processo contínuo constituiria um método viável para a compreensão do metabolismo desta célula. / Drosophila melanogasters cells (S2) have been used as expression systems for recombinant proteins. This study uses a genetically modified S2 line with expression vectors for production of rabies virus glycoprotein (RVPG). The main objective was to evaluate the growth trend of S2 cells in a continuous process, aiming to maintain high cell concentrations. In order to set the continuous culture, the experiments used serum-free medium SF 900 II in a Biostat B reactor, with working volume of 500 mL and temperature controlled at 28 º C, dissolved oxygen at 30% air saturation, agitation speed at 90 rpm, and pH monitoring. Cellular metabolism behavior was observed under different dilution rates (0.8 day-1, 0.5 day-1, and 0.2 day-1) through parameters such as yield factors, in addition to variables such as maximum cell concentration, residual concentration of glucose and glutamine, among others. Yet, this work evaluates the influence of amino acids such as glutamine, asparagine, proline, serine and cysteine supplemented in the feed, over cellular concentration value reached in the steady state. Different dilution rates decreasing (under steady state) resulted in cell concentrations quite simillar. The addition of glutamine (1.7 g/L) in the feed did not contribute to the increase of cell concentration, which indicates that this amino acid did not limit cell growth process. A similar observation occurred when SF 900 II medium was supplemented with asparagine, proline, serine and cysteine. However, the cysteine addition (0.3 g/L) alone in the feed resulted in a 12% increase in cell concentration, compared to pure SF 900 II. Thus, it is possible to conclude that cysteine limited cell growth. It was also found that the cell did not show great variability in the various tests under the same dilution rate. This indicates that chemostat culture would be a viable method for understanding the metabolism of this cell.

Este estudo teve como objetivo detectar a presença do vírus da raiva em diferentes órgãos de morcegos do gênero Artibeus empregando as técnicas moleculares como RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR. De aproximadamente 4000 espécimes de morcegos recebidas no Instituto Pasteur para o diagnóstico da raiva, foram selecionados 30 morcegos do gênero Artibeus, com resultados positivos para raiva pelas técnicas tradicionais de IFD e inoculação em células N2A utilizando suspensões feitas a partir do SNC. Para as técnicas moleculares, foram retirados glândulas salivares, bexigas urinárias, rins, pulmões e conteúdos fecais e ainda foram lavadas as calotas cranianas dos espécimes. Os órgãos e conteúdos fecais foram diluídos a 1:10 (P/V) e as bexigas urinárias a 1:20 (P/V). As suspensões foram inoculadas em células N2A para o isolamento viral. Foi realizada a extração do RNA total usando o TRIzol®, foram realizadas a transcrição reversa seguida da PCR e hnRT-PCR com utilização de primers específicos para o gene codificante da proteína N. A partir do produto da transcrição reversa foi realizada a técnica de Real Time RT-PCR, utilizando primers e sonda específicos para variante antigênica 3. Das 30 suspensões de lavado cerebral, 28 (93,33%) resultaram positivos, na inoculação em cultura de células, seguido de glândulas salivares (36,67%), bexigas (16,67%) e conteúdos fecais (3,33%). Os resultados encontrados da sensibilidade nas técnicas de RT-PCR, hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 56,25%, 82,57% e 82,19% quando avaliadas as 180 amostras analisadas. A comparação das técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR feita pelo teste exato de Fisher quanto a proporção de positivos detectados mostrou que para o lavado cerebral, órgãos e conteúdos fecais a proporção foi igual (P>0,05). Em relação à positividade os resultados encontrados nas técnicas de hnRT-PCR e Real Time RT-PCR foram 100% em lavado cerebral; 90% e 93,33% em glândulas salivares; 83,33% e 90% em bexigas; 80% e 93,33% em rins; 76,67% e 50% em pulmões e 43,33% em ambas as técnicas em conteúdos fecais. Esses resultados sugerem que tanto as técnicas de hnRT-PCR como Real Time RT-PCR podem ser utilizadas como métodos complementares para o diagnóstico da raiva e são sensíveis o bastante para o uso em estudos de patogênese. A técnica de Real Time RT-PCR realizada neste estudo se mostrou eficiente em detectar o RABV em diferentes órgãos e tecidos extraneurais com a vantagem de ser uma técnica mais rápida e sensível. / This study was aimed to detect the presence of rabies virus in different organs of the genus Artibeus bats using molecular techniques such as RT-PCR, hnRT-PCR, and the Real Time RT-PCR. From about 4,000 specimens of bats received for rabies diagnosis at the Pasteur Institute, 30 bats of the genus Artibeus were then selected. The selected bats presented positive results by the traditional DFA and N2A-cells inoculation test using brain tissue suspensions. Samples of salivary glands, urinary bladders, kidneys, lungs, and fecal contents and washings of the skulls were collected for the molecular techniques testing. The organs and the fecal contents were diluted at 1:10 (w/v) and the urinary bladder, at 1:20 (w/v) and these suspensions were inoculated into N2A cells for viral isolation. The extraction of the total RNA was performed by using TRIzol® and followed by the reverse transcription and the PCR and the hnRT-PCR were performed by using specific primers for the gene encoding the protein N. The product obtained by the reverse transcription technique was submitted to the Real Time RT-PCR technique, using primers and probe specific for antigenic variant 3 of the rabies virus. Of the 30 suspensions of the brain washings, 28 (93.33%) were positive in N2A cell culture inoculation, followed by the suspensions of the salivary glands (36.67%), bladders (16.67%) and fecal contents (3.33%). For the 180 samples evaluated, the results of sensitivity found for the RT-PCR, hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques were 56.25%, 82.57%, and 82.19%, respectively. A comparison of hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques performed by Fisher\'s exact test showed that the proportion of positives detected by the brain washings, organs and of the fecal content was non-significant (P> 0.05). Regarding the results found in hnRT-PCR and Real Time RT-PCR techniques, 100% positives were in brain washing, 90% and 93.33% in salivary glands, 83.33% and 90% in bladders, 80% and 93.33% in kidneys, 76.67% and 50% in lungs and 43.33% for both techniques on fecal contents. These results suggest that both hnRT-PCR and Real-Time PCR techniques can be used as complementary methods for the diagnosis of rabies and are sensitive enough for use in pathogenesis studies. The Real Time RT-PCR technique performed in this study proved to be faster and more sensitive and effective in detecting RABV in different organs and extra neural tissues of bats.