A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes. / Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4\'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.

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A malária transmitida por transfusão sanguínea permanece como uma das infecções mais relevantes para os serviços de hemoterapia. Dados sobre a frequência de malária transfusional mostram valores que variam de menos que 0,2 casos por milhão de unidades de sangue em países não endêmicos a 50 casos ou mais em áreas com transmissão ativa. Embora no Brasil a incidência de malária por transfusão sanguínea não seja conhecida, este evento pode contribuir para a disseminação da doença em casos de falha na triagem clínico-epidemiológica ou na ocorrência de doadores assintomáticos nos bancos de sangue. Doadores que ocasionaram malária transfusional geralmente apresentavam parasitemias muito baixas com estimativa de um a 10 parasitos presentes por unidade de sangue, o que requer metodologias mais sensíveis para o diagnóstico e prevenção. O presente estudo de corte transversal e de abrangência nacional, visou a estimar a prevalência de marcadores específicos para malária em grande número de amostras de doadores de sangue agrupadas em pools, através de diferentes metodologias moleculares e um teste sorológico. Participaram 147 serviços hemoterápicos brasileiros, públicos e/ou privados localizados em áreas endêmicas e não endêmicas para malária e 13.338 doadores de sangue aprovados pelos métodos de triagem locais. As amostras foram agrupadas em pools de 10 totalizando 1299 pools. Esses pools foram processados por quatro técnicas diferentes de PCR em tempo real e uma técnica de nested PCR. Também foi empregado um teste rápido para detecção de anticorpos. Os pools positivos pelas PCRs foram ensaiados individualmente para detectar o(s) doador(es) positivo(s). Foram identificados 43 pools com amplificação para Plasmodium pela PCR em tempo real, sendo 4,72% de pools positivos da Região Amazônica e 3,19 da Extra-Amazônica. A nested PCR conseguiu identificar quatro pools com P. vivax, dois pools contendo P. falciparum e um pool com P. malariae, todos de doadores de Região Extra-Amazônica. Amostras dos pools positivos foram processadas individualmente e a PCR em tempo real mostrou amplificação em 25 doadores, uma positividade de 6,94% em 360 amostras individuais analisadas, sendo apenas uma de doador de Região Amazônica. A nested PCR identificou P. malariae em um doador e P. vivax em outro. O teste rápido revelou presença de anticorpos contra P. vivax em 13 pools de área não endêmica e 3 pools de área endêmica, sendo somente em um pool positivo pela PCR em tempo real. Limitações do estudo foram a descontinuação do teste rápido no Brasil que impediu a análise individual dos pools positivos e a problemas relativos à conservação das amostras de sangue individuais, o que dificultou a identificação de algumas amostras. A técnica de PCR em tempo real apresentou o melhor desempenho e foi capaz de identificar Plasmodium mesmo em amostras agrupadas em pool de 10, diminuindo desta forma o tempo e o custo do processamento. Os resultados deste estudo, que analisou amostras de sangue de doadores de áreas endêmicas e não endêmicas brasileiras, constituindo um painel nacional, revelaram o risco de malária transfusional em nosso país e a necessidade de validação de protocolos sensíveis para detecção de baixas parasitemias. Estes resultados poderão subsidiar as tomadas de decisões das agências reguladoras hemoterápicas, minimizando desta forma a transmissão de malária em bancos de sangue brasileiros / Malaria transmitted by blood transfusion remains one of the most important infections for hemotherapy services. Data on the frequency of transfusion malaria show values ranging from less than 0.2 cases per million units of blood in nonendemic countries to 50 or more cases in areas with active transmission. While in Brazil the incidence of malaria by blood transfusion is unknown, this event may contribute to the spread of the disease in cases of failure in the clinical and epidemiological screening or due to the occurrence of asymptomatic donors in blood banks. Donors that caused transfusion malaria mostly showed very low parasitemia with an estimated rate of 1 to 10 parasites per unit of blood, which requires sensitive methods for the diagnosis and prevention. This cross-sectional study with samples from whole country, aimed to estimate the prevalence of specific markers for malaria in large number of samples from blood donors grouped into pools, using different molecular methods and one serologic test. It was included 147 Brazilian public or private blood banks located in endemic and nonendemic areas for malaria with 13,338 blood donors that have been accepted by the local methods of screening. The samples were grouped into pools of 10 totalizing 1,299 pools that were processed by four different techniques of real time PCR and one nested PCR. It was also used a rapid test for antibody detection. Samples from the positive pools were tested individually by PCR to detect positive donors. Real-time PCR revealed amplification for Plasmodium in 43 pools with samples from Amazon Region (4.72%) and Extra-Amazon Region (3.19%). Nested PCR was able to identify four pools with P. vivax, two pools with P. falciparum and one pool with P. malariae, all related to samples from Extra-Amazon Region. Samples from positive pools were processed individually and real-time PCR revealed amplification in 25 donors, showing a positivity rate of 6.94% in 360 individual samples, with only one donor from Amazon Region. Nested PCR showed amplification in samples from two donors, one harboring P. malariae and one P. vivax. The rapid diagnostic test revealed the presence of antibodies against P. vivax in 13 pools from non-endemic area and in three pools from endemic area. Only one of the PCR positive pools resulted positive in the rapid diagnostic test. Limitations of this study were related to the unavailability of the rapid test in Brazil for processing the individual samples from the positive pools and problems concerning the storage of individual blood samples. Real-time PCR showed the best performance and was able to identify Plasmodium in pools of 10 samples, reducing time and cost of processing. The results of this study, which analyzed blood samples from donors from endemic and non-endemic Brazilian areas revealed the risk of transfusion malaria in our country and the need for sensitive validated protocols for detection of low parasitaemia. These results may support the decision making of blood donor screening criteria by regulatory agencies, in order to reduce malaria transmission in Brazilian blood banks

A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10µM, 25µM e 50µM) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%. Os resultados demonstraram diferenças nas digestões dos dois vetores plasmidiais, sendo o pmGENIE3 mais susceptível à degradação pelo extrato espermático, demonstrando ausência de bandas em algumas replicatas (mediana=1). O PCX-EGFP apresentou inibição parcial da degradação já com 10µM de ATA. Já o pmGENIE só apresentou inibição da degradação com 25 ou 50µM de ATA. Assim a concentração utilizada nos experimentos consecutivos foi a de 50µM. Para o experimento 2, espermatozoides de camundongos da linhagem Bl-6/DBA (F1) foram incubados com duas concentrações (500 ou 1000ng) do plasmídeo PCX-EGFP, com ou sem pré-incubação com ATA. As incubações ocorreram durante 5 horas, em ar com 5% de CO2 à 37ºC. Assim, os espermatozoides foram submetidos ao teste de susceptibilidade à denaturação ácida e ao ensaio de cometa alcalino para verificar possível fragilidade da cromatina. Os dados demonstraram que o uso do ATA em espermatozoides murinos leva à fragilidade do genoma, independente de serem incubados com DNA exógeno e a concentração do mesmo. Além disso, foi possível verificar que pode existir um limiar de concentração ótima para que as endonucleases causem fragmentação do DNA cromossomal, o qual foi de 500ng. O uso de concentrações maiores, como 1000ng, pode ter agido como fator protetor ao DNA genômico, podendo este DNA exógeno ter sido o alvo primário das endonucleases, já que quando as amostras foram incubadas com essa concentração de plasmídeo, não houve altos índices de fragmentação no DNA endógeno. No experimento 3, espermatozoides de camundongos foram incubados com 500 ou 1000ng de PCX-EGFP/106 células, sendo ou não pré-incubados com ATA. O DNA genômico das células espermáticas foi extraído pelo método de fenol clorofórmio, diluído para concentração de 1ng/µl e submetidos à quantificação de DNA plasmidial pela técnica de quantificação absoluta em tempo real (qPCR). Os resultados demonstraram que o ATA não melhorou a eficiência de incorporação, já que tanto na concentração de 500 quanto na de 1000ng de DNA exógeno, a porcentagem foi menor (0,001% para os dois grupos) em relação aos grupos nos quais este não foi utilizado. Os grupos em que o ATA não foi utilizado não apresentaram diferença entre si demonstrando que a quantidade de 500ng de DNA exógeno foi suficiente na internalização deste ao espermatozoide, sendo a porcentagem de incorporação maior do que 1000ng (0,20% contra 0,10%). Contudo, o uso do inibidor de endonucleases, ao invés de aumentar os índices de incorporação apresentou resultados opostos, indicando que seu uso não trouxe melhorias para a técnica de TGME. / The low efficiency and low repeatability of sperm-mediated gene transfer (SMGT) could be due to the activation of sperm endonucleases. The inhibition of this enzyme would avoid genomic DNA fragmentation enabling the use of higher concentrations of exogenous DNA, increasing the efficiency and ensuring the reproducibility of this technique. Aurintricarboxilic acid (ATA) is a general inhibitor of endonucleases (HALLICK et al., 1977), including sperm endonucleases (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). This study aimed to evaluate the inhibition of sperm endonucleases using the aurintricarboxilic acid (ATA). For that, three experiments were set: 1) evaluate the inhibition of sperm endonucleases by adding aurintricarboxilic acid after incubation with exogenous DNA, 2) study the inhibition efficiency of ATA in genomic DNA fragmentation and 3) detect exogenous DNA internalization after the use of ATA. For the first experiment, a plasmid digestion assay with pmGENIE3 and PCX-EGFP and three concentrations of ATA (10µM, 25µM and 50µM) were tested. The digestion of plasmid vector occurred by incubation of PCX-EGFP and pmGENIE3 with and without the presence of ATA with sperm extracts. Incubations took place for 1 hour at 37°C and the products were analyzed by electrophoresis (2 hours, 100mV) in 0,7% agarose gel. The results were evaluated on a cross scale whereas 1 was considered a total plasmid digestion and 3 no digestion. The results were analyzed with a significance level of 5%. The results show differences in the digestion of the two plasmid vectors, being pmGENIE3 more susceptible to degradation by sperm extract, demonstrating absence of bands in some replicates (median = 1). The PCX-EGFP showed a parcial inhibition of the degradation using 10µM ATA. PmGENIE3 presented inhibiting of degradation only using 25 or 50µM of ATA. Thus, the concentration used in the consecutives experiments was 50µM. For experiment 2, sperm from Bl-6/DBA (F1) mice strain were incubated with two concentrations (500 or 1000ng) of the PCX-EGFP plasmid, with and without pre-incubation with ATA. Incubation took place for 5 hours, with 5% CO2 in air, at 37°C. Sperm samples were subjected to acid denaturation susceptibility test and alkaline comet assay to check for possible chromatin fragility. The data showed that the use of ATA in murine sperm leads to a fragility of their genome, independently of the incubation with exogenous DNA and its concentration. Result showed that there might be a threshold concentration for chromosomal DNA fragmentation caused by endonucleases, which was 500ng of plasmid. The use of higher concentrations, as 1000ng, may be a protective factor for genomic DNA integrity, since exogenous DNA seems to be the primary target of endonucleases, showed by, lower DNA fragmentation levels. In experiment 3, sperm were incubated with 500 or 1000ng PCX-EGFP/106 cells, pre-incubated or not with ATA. Genomic DNA was extracted by phenol chloroform method, diluted to concentrations of 1ng/µl and subjected to quantification of plasmid DNA insertions by absolute quantification in real-time PCR (qPCR). The results showed that ATA did not improve the efficiency of DNA internalization, whereas both concentration of 500 and 1000ng presented a lower percentage of exogenous DNA integration (0.001% in both groups) compared with the groups in which ATA was not used. The groups without ATA did not differ indicating that the amount of 500ng of DNA was able to integrate exogenous DNA to sperm, and have higher percentage of incorporation compared to 1000ng (0,20% versus 0,10%). Thereby, the use of an endonuclease inhibitor instead of increasing integration indexes showed opposite results, indicating that its use did not bring improvements to the SMGT technique.

As MMPs são endopeptidases zinco dependentes que, em conjunto, podem degradar todos os componentes da MEC e gerar moléculas bioativas. São as principais responsáveis pelo remodelamento tecidual durante eventos fisiológicos normais como a embriogênese e organogênese e também em eventos patológicos como a invasão tumoral nos tecidos. As pesquisas na área de mineralização biológica têm buscado identificar os genes envolvidos nos mecanismos moleculares que regula o processo de ossificação endocondral. As MMPs e seus inibidores são responsáveis pelo controle da degradação desta matriz, como os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs) e a proteína RECK, que, muito provavelmente, determinam o grau de remodelação da matriz extracelular. Desta forma, nosso objetivo foi delinear o perfil temporal e espacial da expressão das MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3- MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP e MMP-25/MT6-MMP durante a ossificação endocondral em embriões de camundongos e em animais recémnascidos através das técnicas de PCR em tempo real e imunohistoquímica. Por imunohistoquímica, nós não encontramos imunomarcação para a MMP-15/MT2- MMP em nenhum dos períodos analisados, apesar da padronização do anticorpo primário. Tanto a MMP-16/MT3-MMP quanto a MMP-24/MT5-MMP foram imunolocalizadas, principalmente, nos osteoblastos do fronte de ossificação da placa de crescimento. Para a MMP-17/MT4-MMP, durante a diferenciação condrocítica (E13) os condrócitos proliferativos foram imunocorados, bem como os condrócitos hipertróficos no centro da cartilagem do molde cartilaginoso (E14). Durante a invasão celular e vascular (E15), as células mesenquimais oriundas do colar ósseo, provavelmente pré-osteoblastos, foram imunocorados na cavidade medular primitiva e osteoblastos fronte de ossificação foram imunocorados, de E16 a PN1. Observamos para a MMP-25/MT6-MMP o mesmo padrão de imunomarcação das demais MT-MMPs, exceto no molde cartilaginoso, onde apenas as células do periósteo e pericôndrio foram imunocoradas, diferentemente da demais que foram localizadas apenas no centro do molde cartilaginoso. A análise da expressão dos transcritos para todas as MT-MMPs revelou o mesmo perfil de expressão, sendo alta durante a fase de diferenciação condrocítica (E13), tendo queda de expressão de E14 a E16. Em E16 há um aumento de expressão até E18 e, novamente, queda até E20 e pouca ou nenhuma expressão em PN7. Apesar deste perfil semelhante, houve uma expressão diferencial entre elas, sendo a MMP-15/MT2-MMP > MMP- 17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que as MT-MMPs estão diferencialmente expressas durante a ossificação endocondral normal em camundongos, sugerindo que a atividade biológica destas enzimas esteja atuando na degradação da matriz extracelular pericelular tanto durante a fase de desenvolvimento quanto de formação óssea. / MMPs are zinc-dependent endopeptidases that, collectivelly, degrade all components of the ECM and generate bioactive molecules. They are able to remodelate the ECM during normal developmental processes such as embryogenesis and organogenesis, as well as in pathological processes such as tumoral invasion. The biological mineralization research looking for discovering the genes involved in the molecular mechanisms that control the endochondral ossification process. MMPs and their inhibitors (TIMPs and RECK) are responsable for bone matrix remodeling and, probably, determinate the level of its turnover. Thus, our goal was to evaluate the temporal-spatial expression of MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP, and MMP-25/MT6- MMP in mice embryos and newborns during endochondral ossification by Real Time PCR and immunohistochemistry. By immunohistochemistry, MMP-15/MT2-MMP signal was not detected. Both MMP-16/MT3-MMP and MMP-24/MT5-MMP were immunostained, mainly in osteoblasts at ossification front of growth plate. For MMP- 17/MT4-MMP, proliferative chondrocytes were immunopositive during chondrocyte differentiation (E13) as well as in hipertrophyc chondrocytes at the middle of cartilaginous template (E14). During cellular e vascular invasion (E15), mesenchymal cells from bone collar, probable pre-osteoblasts, were immunostained at primary bone marrow and osteoblasts at ossification front from E16 e PN1. For MMP- 25/MT6-MMP, perichondrial and periostal cellls were immunostained at cartilaginous template. All MT-MMPs evaluated showed the same transcript levels profile, being high in chondrocyte differentiation (E13), decreasing from E14 to E16. mRNA levels increased from E16 to E18 and, once more, decreasing from E18 to E20. Despite this profile, we observed difference levels: MMP-15/MT2-MMP > MMP-17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Our findings show, for the first time, that MT-MMPs are differentially expressed during normal endochondral ossification in mice, suggesting their biological activity act in pericellular extracellular matrix degradation in both development and bone formation.

O Epstein-Barr Vírus (EBV) é um vírus da família Herpes (HHV-4), presente em grande parte da população mundial. É o agente etiológico da mononucleose infecciosa e da leucoplasia pilosa. A leucoplasia pilosa é uma doença epitelial benigna associada ao EBV, caracterizada pela reprodução replicativa do EBV nas células do epitélio oral, e é uma das mais freqüentes lesões oportunistas em pacientes HIV positivos, sendo menos freqüente apenas que a candidíase, com uma prevalência média entre 10 % e 30%. Por ser uma lesão oportunista bucal fortemente relacionada com a infecção pelo HIV e com a imunossupressão, seu diagnóstico é importante, pois pode sugerir o diagnóstico da infecção em pacientes de sorologia desconhecida para o HIV, e auxiliar no estadiamento da doença. Sua detecção e correto diagnóstico são de particular importância por essa condição estar relacionada à capacidade imune do paciente. Além disso, em pacientes já diagnosticados, ela é indicadora da progressão da doença e da eficácia da terapia antirretroviral. O objetivo desse estudo foi avaliar a presença e a quantidade do EBV na saliva e no sangue de pacientes infectados pelo HIV atendidos no CAPE-FOUSP, verificar a presença clínica de leucoplasia pilosa, estabelecendo a possibilidade da existência de vínculo entre a carga viral do EBV, a manifestação clínica da lesão e a carga viral do HIV. Também se buscou estabelecer relação entre o tipo de terapia antirretroviral em uso e a presença de leucoplasia pilosa, bem como estabelecer relação entre a carga viral do EBV na saliva e no sangue. Foram analisadas 20 lesões de leucoplasia pilosa, num total de 94 pacientes avaliados. Foi encontrada uma correlação positiva entre a Carga Viral do EBV no sangue e na saliva (p=0,001). Quanto maior a carga viral no sangue, maior a carga viral na saliva. Foi encontrada associação entre a Carga Viral do EBV na saliva e a presença de Leucoplasia Pilosa (p=0,045). Indivíduos com Leucoplasia Pilosa apresentam maior Carga Viral de EBV na saliva do que indivíduos sem essa lesão. Foi encontrada uma correlação positiva entre a Carga Viral do HIV e a Carga Viral do EBV na saliva (p=0,006) porém não no sangue. Quanto maior a carga viral de HIV, maior a carga viral do EBV na saliva. Foi encontrada correlação positiva entre a Carga Viral do EBV no sangue e as contagens de CD4 mais baixa registrada e a mais atual (p=0,028 e p=0,030 respectivamente). Quanto maior Carga Viral do EBV no sangue, maior a contagem de CD4. Não foi encontrada associação entre o tipo de medicação antirretroviral em uso e presença de lesão de leucoplasia pilosa. / The Epstein-Barr Virus (EBV) is a herpes virus family (HHV-4), is present in great part of the world population. It is the causative agent of infectious mononucleosis and oral hairy leukoplakia. Oral hairy leukoplakia is a benign epithelial disease associated with EBV, which is characterized by the replicative reproduction of EBV in oral epithelial cells, and is one of the most frequent opportunistic lesions in HIV positive patients, only less frequent than candidiasis, with an average prevalence between 10% and 30%. Being an opportunistic oral lesion strongly associated with HIV infection and immunosuppression, its diagnosis is important, because it may suggests the diagnosis of infection in patients of unknown HIV serology, and assist in the staging of the disease. Its detection and correct diagnosis are particularly important because this condition is related to the patient\'s immune capacity. Moreover, in patients already diagnosed, it is indicative of disease progression and effectiveness of antiretroviral therapy. The aim of this study was to evaluate the presence and quantity of EBV in saliva and blood of HIV-infected patients treated at the CAPE-FOUSP, verifying the presence of clinical OHL, establishing the possibility of the existence of a link between viral load and EBV, clinical manifestation of the lesion, and HIV viral load. It was also aimed to establish the relationship between the type of antiretroviral therapy in use and the presence of oral hairy leukoplakia, as well as establish the relationship between viral load of EBV in saliva and blood. We analyzed 20 lesions of oral hairy leukoplakia, a total of 94 patients. Found a positive correlation between viral load of EBV in blood and saliva (p = 0.001). The higher the viral load in blood, the higher the viral load in saliva. Association was found between viral load of EBV in saliva and the presence of oral hairy leukoplakia (p = 0.045).Individuals with oral hairy leukoplakia have a higher viral load of EBV in saliva than those without such injury. Found a positive correlation between viral load and HIV viral load of EBV in saliva (p = 0.006) but not in blood. The higher the viral load of HIV, the higher the viral load of EBV in saliva. A positive correlation was found between viral load of EBV in blood and CD4 counts the lowest recorded and most current (p = 0.028 and p = 0.030 respectively). The higher viral load of EBV in blood, increased CD4 count. No association was found between the type of antiretroviral medications in use and presence of oral hairy leukoplakia lesions.

Introdução:Até 60% das mulheres com endometriose apresentam como sintoma a infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, especialmente quando não há distorção da anatomia pélvica. A etiologia multifatorial e comprometimento poligênico nesta doença têm sido amplamente aceitos. A aromatase é uma molécula das mais estudadas e há evidências de aumento da expressão do seu gene no endométrio eutópico e ectópico na endometriose. Esta enzima, codificada pelo gene CYP19A1, converte andrógenos a estrógenos e está presente normalmente nas células da granulosa, onde é fundamental para a produção esteroidogênica intrafolicular. Estudos in vitropor cultivo de células da granulosa, mostraram redução da atividade da aromatase em mulheres com endometriose. Devido à escassez de estudos que analisem a expressão do seu gene (CYP19A1) nessas células foi o que estimulou a proposta deste estudo. Este trabalho tem porobjetivo medir a expressão do gene da aromatase por PCR em tempo real nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 11 mulheres com endometriose e 11 com os fatores tubáreo ou masculino de infertilidade,submetidas à hiperestimulação ovariana controlada (HOC) para reprodução assistida, num total de 12 ciclos para o grupo com endometriose e 11 para o controle. Não houve diferença entre as características clínicas dos dois grupos quanto à idade e parâmetros do ciclo de HOC. As células da granulosa murais foram coletadas de folículos pré-ovulatórios maduros no dia da captação oocitária e isoladas. Posteriormente, procedeu-se à extração do RNA (clorofórmio/ isopropanol) e à transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada para quantificar os níveis de RNA mensageiro produzidos para o gene da aromatase, normalizados aos produtos do gene endógeno, ß-actina (expressão relativa). Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Resultados: não houve diferença na expressão do gene CYP19A1 nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo controle (p>0,05; Mann Whitney), mesmo na comparação combinada considerando-se separadamente os diferentes graus de endometriose (controle vs. endometriose mínima/leve vs. endometriose moderada/grave, p>0,05;Kruskall Wallis). Conclusão:Os resultados deste estudo sugerem que a aromatase apresenta um mecanismo complexo de controle para sua expressão gênica nas células da granulosa e, apesar de evidências prévias de sua reduzida atividade nessas células na endometriose, a expressão de seu gene parece não estar afetada pela doeça, de acordo com o presente estudo. / Background: Up to 60% of women with endometriosis have infertility symptoms. However, mechanisms remain unclear, mainly when there is no distortion of pelvic anatomy. The multifactorial etiology and polygenic involvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one of the most studied molecules and there are evidences of increased expression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in endometriosis. This enzyme, codified by the CYP19A1 gene, converts androgens to estrogens and is normally present in granulosa cells, where it plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In vitrostudies by granulosa cells culture have demonstrated reduced aromatase activity in women with endometriosis. The scarcity of studies assessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target cells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to quantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein-granulose cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study was conducted on 11 women with endometriosis and 11 with male or tubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), with a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. There was no difference between the groups regarding age or HOC parameters. Mural lutein-granulosacells were harvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly isolated. Later, RNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were performed. Real-time PCR was run to quantify RNAm products of aromatase gene normalized to those from the control gene, beta-actin (relative expression). All experiments were carried out in duplicate. Results: there was no difference between the groups regarding the gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different stages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that aromatase may have a complex control of its gene expression on granulosa cells and, despite of previous evidences showing its reduced activity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems not affected by the disease, according to this study.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-01-24T17:49:23Z No. of bitstreams: 1 2017 - Leandro Martins Ferreira.pdf: 2738374 bytes, checksum: a6ccde64b30f6cd52122b9030ab6c92e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-24T17:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017 - Leandro Martins Ferreira.pdf: 2738374 bytes, checksum: a6ccde64b30f6cd52122b9030ab6c92e (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES / Faperj / CNPq / Among the abiotic stress, drought is a major environmental stress seriously limiting plant growth and crop productivity. Rice is one of the most important staple food crops in the world and requires a larger quantity of water to produce, once it is a crop extremely sensitive to drought stress. For this reason, to obtain rice plants that cope with drought stress without major reduction in productivity is the challenge for breeding programs nowadays. This work aimed: (i) identify upland rice varieties with contrasting drought tolerance through the evaluation of morphological and physiological traits, (ii) analyse root parameters which could explain the differences between tolerant and sensitive varieties to the drought stress and, (iii) identify new biotechnological targets related with the tolerance through transcript profile analysis in the contrasting varieties. Six experiments were performed, two in greenhouse and four in growth chamber conditions. The experimental design adopted was completely randomized. The first experiment started with ten rice varieties submitted to control and stress conditions during the reproductive stage. The contrasting varieties were selected based on morphological and physiological traits. Experiments from II to IV aimed to correlate the tolerance to the drought stress with the root development and morphology. Experiment V aimed to evaluate the regulation of genes related to the drought tolerance and the experiment VI aimed to analyse the differential expression of genes through the RNAseq analysis in rice roots. Data obtained from the productivity components, tolerance index and multivariate analysis through the evaluation of morphological and physiological traits allowed to identify Catet?o and Piau? variety as the most tolerant and Quebra Cacho and Mira as the most sensitive. Drought tolerance was correlated with a lower root angle and increase in the root density and emission of lateral roots by Catet?o variety during drought stress. Moreover, Catet?o variety has showed higher expression levels and early induction of genes and transcription factors related with drought tolerance. The RNAseq analysis allowed to identify several potential genes which can be used in future breeding programs aimimg the improvement of drought tolerance in rice. / Dentre os estresses abi?ticos que podem limitar o crescimento das culturas agr?colas, a seca ? considerada um dos principais, sendo capaz de reduzir consideravelmente a produ??o global de alimentos. O arroz ? uma das mais importantes culturas agr?colas do mundo e sua produ??o demanda grande quantidade de ?gua, pois ? uma esp?cie extremamente sens?vel ao d?ficit h?drico. Portanto, a obten??o de plantas de arroz que lidam com o estresse h?drico, sem redu??o significativa de produtividade ? um desafio para os programas de melhoramento atuais. Este trabalho teve como objetivos: (i) identificar variedades de arroz de sequeiro contrastantes quanto ? toler?ncia ao estresse h?drico por meio da avalia??o de caracter?sticas morfol?gicas e fisiol?gicas, (ii) analisar par?metros radiculares que possam explicar a diferen?a entre variedades tolerantes e sens?veis ao estresse h?drico e, (iii) identificar novos alvos biotecnol?gicos envolvidos com essa toler?ncia por meio da an?lise do perfil de transcritos nas variedades de arroz contrastantes. Foram realizados seis experimentos, sendo dois em casa de vegeta??o e quatro em c?mara de crescimento. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. O primeiro experimento iniciou com dez variedades de arroz submetidas a condi??o controle e estresse h?drico durante o per?odo reprodutivo. As variedades contrastantes foram selecionadas com base em caracter?sticas morfol?gicas e fisiol?gicas analisadas. Os experimentos II a IV foram realizados a fim de correlacionar a toler?ncia ao estresse com o desenvolvimento e morfologia do sistema radicular. O experimento V foi realizado para avaliar a regula??o de genes relacionados a toler?ncia ao estresse h?drico e o experimento VI teve como objetivo analisar a express?o diferencial de genes por meio da t?cnica de RNA-seq em ra?zes de arroz. Os dados obtidos dos componentes de produtividade, ?ndices de toler?ncia ao estresse e an?lise multivariada das caracter?sticas morfol?gicas e fisiol?gicas permitiram identificar as variedades Catet?o e Piau? como as mais tolerantes ao estresse h?drico, e Quebra Cacho e Mira como as mais sens?veis. Foi observado que a toler?ncia ao estresse h?drico est? correlacionada com o menor ?ngulo radicular, aumento da densidade e emiss?o de ra?zes laterais em condi??es de d?ficit h?drico na variedade Catet?o. Al?m disso, essa variedade mostra indu??o r?pida e elevados n?veis de express?o de genes e fatores de transcri??o relacionados ? toler?ncia ao estresse h?drico em arroz. Por meio do sequenciamento do RNA foi poss?vel identificar diversos genes com potencial para serem utilizados em programas de melhoramento visando o aumento da toler?ncia ao estresse h?drico em arroz.

A combinação do aumento da população mundial e a melhoria nos padrões de vida estão levando a uma maior demanda por alimentos com alto valor nutricional. As variedades de laranjas de polpa vermelha são as únicas laranjas que acumulam licopeno na polpa e no suco. O licopeno é um carotenóide considerado como um composto antioxidante, com ação potencial na prevenção de alguns tipos de câncer. Apesar do valor nutricional agregado as laranjas de polpa vermelha, a caracterização fisiológica e molecular dos carotenóides nessas laranjas permanece pouco estudada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil de transcrição de genes envolvidos na via de biossíntese dos carotenóides e quantificar a concentração dos carotenóides na polpa dos frutos de duas laranjas de polpa vermelha e da laranja Pêra (controle). Para comparação entre variedades, os frutos das laranjas Sanguínea-de-Mombuca (\'SM\') e Bahia Cara-Cara (\'CC\'), que possuem polpa vermelha, e da laranja Pêra (\'P\') foram colhidos aos 270, 300 e 330 dias após o florescimento (DAF), em Cordeirópolis (CCSM). Para identificar a influência climática no acúmulo de carotenóides, frutos da laranja de polpa vermelha \'SM\' foram também colhidos frutos aos 270, 300 e 330 DAF em diversos locais: CCSM, Mogi-Mirim (MM) e São Bento do Sapucaí (SBS). A quantidade dos transcritos dos genes fitoeno sintase (PSY), fitoeno dessaturase (PDS), \'dzeta\'-caroteno dessaturase (ZDS), carotenóide isomerase (CRTISO), licopeno \'épsilon\'-ciclase (LCY\'\'épsilon\'), licopeno \'beta\'-ciclase (LCY\'beta\'), hidroxilase \'beta\'-caroteno (HY\'beta\') e zeaxantina epoxidase (ZEP), que codificam para as enzimas da via de biossíntese dos carotenóides, foram analisados por PCR em tempo real. A quantificação dos principais carotenóides presentes no suco dos frutos foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência. A análise quantitativa de transcritos obtidos a 330 DAF indicaram a existência de maiores níveis de expressão dos genes precursores dos carotenos (PSY, PDS, CRTISO, ZDS, LCY\'beta\') nas variedades de polpa vermelha, principalmente na \'SM\'. A quantidade dos carotenos fitoflueno, licopeno e \'beta\'-caroteno foram maiores nas laranjas vermelhas, em relação ao observado nos frutos de laranja Pêra, correlacionando com os níveis de expressão gênica. Nos frutos da laranja pigmentada \'SM\' coletadas aos 330 DAF pôde-se observar uma possível associação entre o clima do local de cultivo e o conteúdo de transcritos dos genes da via de carotenóides. O cultivo em clima mais quente (MM) resultou em frutos com maiores níveis de transcritos dos genes precursores de carotenos (PSY, PDS, ZDS, CRTISO e LCY\'beta\'), enquanto que o cultivo em região de clima mais frio (SBS) resultou no aumento do nível de transcritos dos genes precursores das xantofilas (HY\'beta\' e ZEP). Como consequência, houve um acúmulo maior dos carotenos fitoflueno, licopeno e \'beta\'-caroteno, nos frutos cultivados em locais quentes, porém, em regiões mais frias, houve maior acúmulo das xantofilas zeaxantina e violaxantina, nos frutos. Com o sequenciamento das regiões de diferentes genes da via de biossíntese de carotenóides, foram identificadas algumas mutações pontuais na sequência de nucleotídeos dos genes PSY, CRTISO e ZDS da variedade pigmentada \'SM\', em comparação com os mesmos genes da laranja Pêra. Algumas dessas mutações resultaram na alteração de aminoácidos na sequência das proteínas e deste modo, supõe-se que estes genes sejam os principais candidatos a serem os responsáveis pela alteração do fenótipo das variedades que produzem frutos com polpa avermelhada, ricos em licopeno / The increasing world population and improvement in living standards are leading to greater demand for foods with high nutritional value. The sweet orange varieties with red-flesh are the only ones that accumulate lycopene in the pulp and juice. Lycopene is a carotenoid compound with antioxidative property which may have a potential action in preventing some cancers. Despite of the high nutritional value in the red-fleshed oranges, the physiological and molecular characterization of carotenoids remains to be elucidated. The present work aimed to characterize the transcriptional profile of genes involved in carotenoids biosynthesis pathway and quantify the carotenoids in red-fleshed oranges and Pêra orange (as a control). For a direct comparison among the varieties, fruits of Sanguínea-de-Mombuca (\'SM\') and Bahia Cara-Cara (\'CC\') red-fleshed sweet oranges, and Pêra orange were harvested at 270, 300 and 330 days after flowering (DAF) in Cordeirópolis station (CCSM). To investigate the impact of climate variation on carotenoids accumulation, red-fleshed fruits \'SM\' orange were harvested on 270, 300 and 330 DAF in different climate locations: Cordeirópolis station (CCSM), Mogi-Mirim (MM) and São Bento do Sapucaí (SBS). Quantitative transcriptional analysis of the genes phytoene syntase (PSY), phytoene desaturase (PDS), \'dzeta\'-carotene desaturase (ZDS), carotenoid isomerase (CRTISO), lycopene \'épsilon\'-ciclase (LCY\'épsilon\'), lycopene \'beta\'-cyclase (LCY\'beta\'), hydroxylase \'beta\'-carotene (HY\'beta\') and zeaxanthin epoxidase (ZEP) related to the carotenoids biosynthesis pathway were performed by quantitative Real Time PCR. Further, carotenoids quantification in red-fleshed fruits was measured by high performance liquid chromatography. The transcriptional profile at 330 DAF revealed high expression levels for the carotene gene precursors (PSY, PDS, CRTISO, ZDS, LCY\'beta\') in red-fleshed oranges, in particular to \'SM\' orange when compared to Pêra orange. Carotenoids profiling displayed higher phytofluene, lycopene and \'beta\'-carotene concentrations in red-fleshed orange than Pêra orange fruits. Transcript levels of genes related to the carotenoids pathway were responsive to the climate variation in red-fleshed orange harvested at 330 DAF. In warmer climate conditions, increased expression levels were found for the genes related carotene precursors (PSY, PDS, ZDS, CRTISO and LCY\'beta\'), whereas under colder climate conditions, the red-fleshed fruits orange showed higher expression levels for the xanthophylls precursors genes (HY\'beta\' e ZEP). As a consequence, the carotenes phytofluene, lycopene and \'beta\'-carotene accumulated in warmer climate developed fruits, instead of colder climate conditions, where the fruits accumulate increased concentrations of xanthophylls such as zeaxanthin and violaxanthin. Moreover, the sequencing of fragments from different genes related to the carotenoids pathway enabled the identification of point mutations for the genes PSY, CRTISO and ZDS in the red-fleshed variety. These mutations caused amino acid changes in the protein which indicates that these genes might be responsible for the phenotypes red-fleshed fruits and increased lycopene levels shown in the variety \'SM\'

A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes. / Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4\'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.