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Papel dos receptores de adenosina e da concentração de glicose na modulação de macrófagos por antígenos de Staphylococcus aureusSouza, Luiz Fernando de January 2008 (has links)
As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. Os receptores de adenosina, em macrófagos, possuem função antiinflamatória em modelos de infecções por bactérias gram-negativas, no entanto, pouco se investigou a ação destes receptores em infecções por bactérias gram-positivas. O diabetes é uma doença metabólica comum que apresenta diversas complicações secundárias, muitas delas associadas aos níveis elevados de glicose. Os pacientes diabéticos apresentam uma ocorrência aumentada de infecções bacterianas, além de o diabetes tipo 2 estar associado com uma inflamação crônica, caracterizada por níveis plasmáticos aumentados de citocinas pró-inflamatórias. Adicionalmente, estes pacientes possuem maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares e aterosclerose, o que tem sido relacionado à hiperglicemia e à inflamação crônica. A regulação, pela glicose, da resposta inflamatória em macrófagos expostos a bactérias gram-negativas ou ao seu antígeno principal, o LPS, é descrita, entretanto, a ação da glicose em modelos de infecções por bactérias gram-positivas não é conhecida. O tratamento dos macrófagos RAW 264.7 com concentrações elevadas de glicose aumentaram a resposta inflamatória ao LTA, com o aumento da produção de NO, TNF-a e MMP-9. Estes resultados mostram que tanto os receptores de adenosina como concentrações elevadas de glicose modulam a resposta inflamatória a S. aureus. Os receptores de adenosina parecem atuar num mecanismo autócrino de modulação da resposta inflamatória, apontando um possível alvo terapêutico. Já a modulação da resposta inflamatória dos macrófagos por concentrações aumentadas de glicose pode contribuir para complicações associadas ao diabetes, como a aterosclerose e a inflamação crônica. / Infectious diseases are among the majors causes of mortality around the world. In bacterial infections, the bacterial cell wall components are described as the main antigens. The macrophages are key mediators of inflammatory response, acting in the attack to the pathogens and in the regulation of immune response. These cells act in the phagocytosis of pathogenic agents and in the production of inflammatory mediators, like cytokines, matrix-metalloproteinases (MMP), reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). These mediators participate of inflammatory response, acting in infection control, notwithstanding, exacerbated production of these molecules could contribute to inflammatory complications, like sepsis and multiple organ failure. Several studies has addressed the inflammatory response to gram-negative bacterial infections or lipopolysaccharide (LPS), the main antigen of these microorganisms, however grampositive bacterial infections are prevalent and associated to high mortality. The adenosine receptors are described to possess anti-inflammatory properties in macrophages in gram-negative bacterial infections models but the role of these receptors in gram-positive bacterial infections is unknown. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators.
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Triagem de extratos vegetais e fúngicos de diferentes biomas para identificação de antagonistas do receptor P2X7Bezerra, Rômulo José Soares January 2012 (has links)
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Previous issue date: 2016-02-23 / O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicas e metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistas específicos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas à ativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturas químicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagrado na medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção de uma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo de extratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN do Centro de Pesquisas René Rachou \2013 Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para o receptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu a triagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro de placas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800 extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista na faixa de corte pré-estabelecida [100 \03BCg/mL], com perfis de inibição de 65 %, 62 % e 61 % respectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células de linhagem murina (2,1 \03BCg/mL; 2.6 \03BCg/mL e 3.8 \03BCg/mL) quanto em células de linhagem humana (0.69, 0.92 e 1.5 \03BCg/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células de linhagem humana
Posteriormente avaliamos a ação destes sobre funções fisiológicas relacionadas à ativação do P2X7R, nessa etapa, observamos o efeito inibitório destes extratos sobre a liberação de IL-1beta, ROS e NO, onde os três compostos foram capazes de inibir estas funções numa faixa entre 50 % a 60 %. Para obtermos uma caracterização do efeito farmacológico destes extratos sobre o receptor P2X7, realizamos experimentos de eletrofisiologia, caracterizando assim uma ação inibitória dose-dependente destes, sendo que nos respectivos IC´s50 os perfis de inibição da corrente foram de: 76 %, 47 % e 75 %. Também avaliamos a citotoxicidade in vitro utilizando as células de ambas às linhagens e verificamos que não apresentaram significativa toxicidade quando tratadas por 24 h. em doses até quatro vezes maiores que o IC50, visto que os resultados foram semelhantes ao controle não tratado. Depois de avaliarmos a atividade antagonista destes extratos in vitro, partimos para os experimentos in vivo utilizando os modelos de úlcera induzida por etanol e de dor neuropática e inflamatória, pois existem trabalhos previamente descritos na literatura que correlacionam a atividade do P2X7R com a evolução dessas patologias. No ensaio de dor neuropática, apenas dois extratos mostraram atividade analgésica (8067 e 8549) inibindo o estímulo de dor em 68 % e 66 %, porém no contexto da dor inflamatória os três extratos mostraram efeito analgésico, inibindo o estímulo em: 8067 = 48%, 8549 = 50% e 8568 = 44 %
Os resultados obtidos do experimento de úlcera induzida por etanol demonstraram o efeito inibitório sobre a formação de úlceras desses extratos em: 88 %, 84 % e 51 %, inclusive foram mais efetivos que o BBG (antagonista reversível deste receptor) e que o medicamento utilizado na clínica (Lansoprazol), os quais inibiram a formação de úlceras em 43 % e 46% respectivamente. Nosso conjunto de resultados apontam extratos com significativa atividade antagonista sobre o P2X7R, com potencial para o desenvolvimento de novos fármacos com grande interesse para a indústria farmacêutica, além de contribuir para o conhecimento acerca de propriedades medicinais presentes na biodiversidade / The purinergic receptor P2X7 is involved in important physiological and metabolic
functions, but it also participates in pathology, especially when inflammatory in character. Despite
the importance of P2X7, it has no specifi
c antagonists yet available for use in clinical treatment of
diseases related to the receptor's activation. Today, many drugs on the market have chemical
structures related to natural products obtained from botanical species with traditional use in
indigen
ous medicine, forming the basis for studying natural products to obtain specific activity on
cellular targets. This work focused primarily on the study of plant and fungal species extracts
obtained from different biomes provided by LQPN of the Research Cen
ter René Rachou
-
Fiocruz
-
MG, aiming to identify antagonists for the P2X7 receptor. The first step was to standardize a
method that allowed the screening of approximately 60 extracts at the same time through the use of
a plate spectrophotometer. Once stand
ardized, the application of this methodology was promoted in
the screening of 1800 extracts. Of these, only three extracts (8067, 8549 and 8568) showed
antagonistic activity in the pre
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established cut range [100 mg/mL], with inhibition profiles of 65%,
62%
, and 61% respectively, on the P2X7R. Th
e
IC's50
of them were determinate
in murine (2.1,
2.6, and 3.8 mg/mL) and human (0.69, 0.92, and 1.5 mg/mL) cell lines.
Which an increased activity
was possible to verify when they were tested
in human cells. Consequ
ent evaluation of action on
physiological functions related to the activation of P2X7R revealed an inhibitory effect of these
extracts on the release of IL
-
1beta, NO, and ROS. The three tested compounds were able to inhibit
these functions in a range betwe
en 50% and 60%. To obtain a pharmacological characterization of
these extracts on the P2X7 receptor, electrophysiological experiments were conducted, which
characterized the dose
-
dependent inhibitory effects, exhibiting inhibitory current profiles of 76%,
47%, and 75%, respectively. In vitro cytotoxicity was also evaluated, using both cell strains,
showing no significant toxicity after 24 hours of treatment at doses of up to four times that of the
IC50; the results were similar to the untreated control. Aft
er evaluating the antagonistic activity of
these extracts in vitro, experiments using the in vivo models of ethanol
-
induced ulcers and
inflammatory and neuropathic pain were performed. Previous studies correlate the activity of the
P2X7R with the evolution
of these pathologies. In the neuropathic pain protocol experiment, only
two extracts showed analgesic activity (8067 and 8549) by inhibiting the pain stimulation by 68%
and 66%, but in the context of inflammatory pain, the three tested extracts showed ana
lgesic effects
by inhibiting the stimulus by the following percentages: 8067 = 48 %, 8549 = 50%, and 8568 =
44%. The results of the ethanol
-
induced ulcer demonstrated an inhibitory effect on the ulcer’s
development of 88%, 84%, and 51% by these extracts, a
nd found that the extracts were more
effective than BBG (reversible antagonist of this receptor) and the medicine used clinically
(Lansoprazole), which inhibited the formation of ulcers by 43% and 46%, respect
ively. The data set
links to extracts
with significant antagonist activity on the P2X7R,
and potential to the development xix
of new
medicines of
great interest to the pharmaceutical industry and important contributions to the
knowledge of medicinal properties present in biodiversity
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Efeito neuroprotetor do antagonismo do receptor P2X7 no Parkinsonismo experimental induzido por 6-OHDA / Neuroprotective effect of p2x7 receptors on experimental 6-ohda-induced parkinsonismCarmo, Marta Regina Santos do January 2015 (has links)
CARMO, Marta Regina Santos do. Efeito neuroprotetor do antagonismo do receptor P2X7 no Parkinsonismo experimental induzido por 6-OHDA. 2015. 110 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-17T13:13:51Z
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Previous issue date: 2015 / Parkinson’s disease (PD) is characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN) and a concomitant decrease of dopamine (DA) in the striatum, which can be modeled by 6-OHDA administration. Since ATP released from damaged cells can exert noxious effects on neurons, acting through its P2X7 receptors (P2X7R), the aim of the present study was to investigate the effects of a P2X7R antagonist, Brilliant Blue G (BBG) on 6-OHDA-induced neurotoxicity. Male Wistar rats received stereotaxic injections of 6-OHDA (18 µg/3µl) into the right striatum and were treated with BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48 h) for two weeks. In an additional experiment, animals were treated with the selective antagonist A-438079 (10 µM i.c.v.) for two weeks. BBG decreased the number of contralateral rotations in the apomorphine test, an effect mimicked by the selective P2X7R antagonist A438079. BBG has also improved the animals’ performance in the passive avoidance test (short-term memory) and in the cued version of the Morris Water maze. The antagonism of P2X7R by BBG has also prevented the reduction of dopamine content in the striatum and SN as well as the loss of dopaminergic neurons, and microgliosis and astrogliosis in the striatum. BBG treatment also decreased the IL-1β levels in striatum, despite the observed effect not being statistically significant. To grasp the mechanism of action of BBG, we used in vitro models exploring synaptotoxicity (striatal synaptosomes) and neurotoxicity (dopamine-differentiated SH-SY5Y cells). Besides showing that P2X7R are present in striatal dopaminergic terminals, we observed that BBG 100 nM prevented the 6-OHDA-induced synaptosomal dysfunction. Furthermore, we have shown the presence of P2X7 receptors in SH-SY5Y cells, their co-localization with tyrosine hydroxilase, and that BBG attenuates the cell damage, evaluated through lactate dehydrogenase release. The present results suggests that P2X7R contribute to PD pathogenesis through a triple impact on synaptotoxicity, gliosis and neurotoxicity, highlighting the therapeutic potential of P2X7R antagonists in the disease. / A doença de Parkinson (DP) é caracterizada por uma degeneração progressiva dos neurônios da substância negra (SN) e uma concomitante diminuição do conteúdo de dopamina no estriado, que pode ser mimetizada pela administração de 6-OHDA. Visto que o ATP liberado das células danificadas exerce efeitos deletérios diretos sobre os neurônios, agindo através de receptores P2X7, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do Brilliant Blue G (BBG), um antagonista dos receptores P2X7, sobre a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA. Ratos Wistar machos receberam injeções estereotáxicas de 6-OHDA (18 µg/3µl) no estriado direito e foram tratados com BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48hs) durante 14 dias. Em uma série adicional de experimentos, os animais receberam o antagonista seletivo A-438079 (10 µM i.c.v.) por 14 dias. O tratamento com BBG diminuiu o número de rotações contralaterais no teste da apomorfina, efeito que foi mimetizado pelo antagonista seletivo A-438079. O BBG também melhorou o desempenho dos animais no teste da esquiva passiva (memória de curta duração), assim como na versão com plataforma sinalizada do labirinto aquático. O antagonismo dos receptores P2X7 pelo BBG preveniu ainda a redução do conteúdo de dopamina no estriado e SN, assim como a perda de neurônios dopaminérgicos, a microgliose e astrogliose no estriado. O tratamento com BBG também diminuiu os níveis de IL-1β no estriado, apesar das diferenças observadas entre os grupos não serem estatisticamente diferentes. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação do BBG, foram utilizados modelos in vitro explorando a sinaptotoxicidade (sinaptossomas estriatais) e neurotoxicidade (células SH-SY5Y dopaminérgicas diferenciadas). Além da demonstração da presença dos receptores P2X7 nos terminais nervosos estriatais, foi observado que o BBG 100 nM preveniu a disfunção sinaptossomal. Também demonstramos a presença dos receptores P2X7 nas células SH-SY5Y, assim como sua co-localização com tirosina hidroxilase, onde o pré-tratamento com BBG 100 nM diminuiu o dano celular, avaliado através da liberação de lactato desidrogenase. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que os receptores P2X7 contribuem para a patogênese da DP através de um triplo mecanismo sobre a sinaptotoxicidade, gliose e neurotoxicidade, ressaltando o potencial terapêutico dos antagonistas desses receptores na doença.
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Papel de receptores P2Y2 y/o P2Y4 en venas intrapulmonares pequeñas en un modelo de hipertensión arterial pulmonarArellano Pérez, Óscar Leonardo January 2016 (has links)
Magíster en fisiología / La Hipertensión Pulmonar (HP) es una patología vascular compleja que conduce a falla cardíaca, menor expectativa de vida y tiene un impacto significativo en la sociedad, ya que produce la muerte de pacientes en edad productiva e implica altos costos de financiamiento en su tratamiento.
Existe evidencia sobre la contribución de venas intrapulmonares a la Resistencia Vascular Pulmonar (RVP). La Hipertensión Venosa Pulmonar (HVP) puede producir un incremento en la RVP y aumentar la Presión Arterial Pulmonar (PAP), debido a transmisión pasiva de la presión venosa al territorio arterial. La familia de receptores purinérgicos se encuentra ampliamente expresada en diversos vasos sanguíneos y se ha descrito respuesta contráctil de arterias intrapulmonares a nucleótidos, en particular a Uridín Trifosfato (UTP). La investigación del rol de la señalización purinérgica en la circulación pulmonar venosa podría aportar información relevante para abordar otra vía involucrada en la fisiopatología de la HAP. Se realizaron rebanadas de pulmón de ratas Sprague Dawley controles y con HAP inducida por Monocrotalina (HAP-MCT), en un vibrátomo a 150 μm de espesor. La respuesta contráctil de Venas Intrapulmonares Pequeñas (VIP) inducida por UTP se registró mediante videomicroscopía de contraste de fases (VMCF), demostrando actividad del nucleótido como agente vasoconstrictor en VIP, con mayor respuesta en la VIP provenientes de ratas con HAP-MCT (EC50= 8,8±1,4 μM) que en las control (EC50= 16 μM) (p<0,05). Las imágenes de inmunofluorescencia muestran expresión de los receptores P2Y2 y P2Y4 en la capa media de VIP de ratas control y con HAP-MCT. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo involucrado en la HAP, orientando el estudio de nuevas terapias para combatir el curso de la enfermedad, mejorar la sobrevida y la calidad de vida de pacientes que padecen HAP. / Pulmonary Hypertension (HP) is a complex vascular condition that leads to heart failure, lower life expectancy and has a significant impact on society, because it involves the death of patients of working age and involves high costs of financing treatment. Pulmonary Venous Hypertension (HVP) may cause an increase in Pulmonary Vascular Resistance (RVP), Pulmonary Artery Pressure (PAP) is increased by the HVP, due to passive transmission of venous pressure to arterial territory. There is also evidence on the contribution of intrapulmonary veins to the RVP. Purinergic receptor family is widely expressed in various blood vessels and described intrapulmonary artery contractile responses to nucleotides, especially Uridine Triphosphate (UTP). The investigation of the role of purinergic signaling in the pulmonary venous circulation could provide relevant information to address another pathway involved in the pathophysiology of Pulmonary Arterial Hypertension (HAP). Lung slices from Sprague Dawley rats controls and rats with Pulmonary Hypertension monocrotaline induced (HAP-MCT), were made from vibratome to 150 μm thick . The contractile response of small intrapulmonary veins (VIP) was recorded by videomicroscopy phase contrast (VMCF), showing nucleotide activity as a vasoconstrictor agent in VIP, with greater response in the VIP from rats HAP-MCT (EC50 = 8.8 ± 1,4 μM) than in control (EC50 = 16 ± 1,1 μM (p<0,05). Immunofluorescence images show expression of P2Y2 and P2Y4 receptors in the middle layer of VIP of control and HAP-MCT rats. These findings suggest a new mechanism involved in PAH, directing the study of new therapies to combat disease course, improve survival and life quality of these patients.
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Regulación de la migración, proliferación y diferenciación de osteoblastos de rata por el trifosfato de adenosina : rol de receptores P2 y mecanismos de señalizaciónLaiuppa, Juan Andrés 30 March 2017 (has links)
Existe una gran cantidad de patologías que afectan al esqueleto, en las que se ve comprometido el balance entre la formación y la resorción ósea. Generalmente, las alternativas terapéuticas apuntan a la modulación de la resorción ósea actuando a nivel del osteoclasto. Sin embargo, estos abordajes terapéuticos no resultan suficientes, generando la necesidad de implementar nuevas estrategias farmacológicas con blanco de acción en la fisiología de la célula formadora de hueso, el osteoblasto. Para ello, un extensivo y detallado conocimiento tanto de la función como de los procesos de proliferación, migración y diferenciación, de la citada célula, son necesarios.
El sistema de señalización purinérgico, donde los nucleótidos son liberados por las células, de manera controlada, y actúan como mensajeros extracelulares activando receptores purinérgicos en la membrana plasmática de la célula blanco es conocido desde hace unos 45 años. Desde entonces, se ha reportado un número creciente de células capaces de liberar nucleótidos, de manera controlada, al medio extracelular, lo que sumado al hecho de que, virtualmente, todas las células del cuerpo poseen algún tipo de receptor purinérgico (purinoceptor), hace de este sistema de señalización uno de los más importantes respecto de la regulación de la homeostasis del cuerpo.
El papel de los nucleótidos y sus receptores en los procesos de proliferación y diferenciación de los osteoblastos ha sido estudiado desde hace unos 25 años. Sin embargo, aún no se ha alcanzado la dilucidación completa de los mecanismos regulatorios de estos procesos.
El objetivo de esta tesis fue determinar los efectos de la activación de receptores purinérgicos, por nucleótidos extracelulares, en los procesos de migración, proliferación y diferenciación celular de cultivos primarios de calvaria de rata neonata. Se investigó también, el efecto de una concentración elevada de calcio extracelular en la proliferación y diferenciación celular y su influencia en la regulación de dichos procesos por la estimulación purinérgica. Además, se evaluó el rol de la enzima GSK3 (por inhibición con Litio), en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. Por último, se examinó el efecto de los agonistas mencionados sobre la expresión y localización de β-catenina.
La migración celular fue evaluada mediante “ensayo de la herida”. El tratamiento con los nucleótidos mostró estimular la migración de las células calvariales.
Para estudiar el proceso de proliferación se recurrió a citometría de flujo, recuento en cámara de Neubauer y tinción con Cristal Violeta. Los resultados obtenidos le atribuyen efectos positivos a los nucleótidos extracelulares. Por otro lado, el tratamiento con Litio provocó disminuciones en la capacidad proliferativa de las células. Mientras que no se observaron cambios en la proliferación por incubación de las células en un medio con elevada concentración de Calcio extracelular.
El análisis de la diferenciación de las células a un fenotipo osteoblástico se llevó a cabo mediante mediciones de actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina, cuantificación de ARNm de marcadores de maduración/diferenciación osteoblástica por QRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa) y detección de mineralización por tinción con rojo de Alizarina. Al respecto, el tratamiento con ATPγS exhibió un rol pro-osteogénico, al elevar la actividad enzimática de FAL, la expresión génica de marcadores de diferenciación y la capacidad mineralizante. En cambio, el agonista UTP no indujo cambios en la actividad de la enzima y, en la mayoría de los casos, reprimió la transcripción de genes osteogénicos.
Por su parte, la exposición a Litio incrementó la actividad de FAL pero reprimió la expresión de genes osteogénicos y disminuyó la mineralización de los cultivos.
Una elevada concentración de Calcio extracelular mostró efectos positivos a nivel de diferenciación, al incrementar la actividad FAL y la mineralización de los osteoblastos.
Finalmente, el tratamiento de los cultivos con nucleótidos extracelulares, en un medio conteniendo elevada concentración de Calcio, mostró leves efectos aditivos/sinergísticos en la estimulación de la diferenciación a células formadoras de hueso.
La expresión de β-catenina resultó aumentada bajo tratamiento con nucleótidos extracelulares, Litio o Calcio. Asimismo, la translocación a núcleo se vio incrementada por dichos tratamientos.
De acuerdo a los resultados obtenidos en esta tesis, puede atribuirse un rol regulatorio sobre la fisiología osteoblástica al sistema de señalización purinérgico y GSK3/ β-catenina. / There are a great number of pathologies that affect the skeleton, in which the balance between formation and bone resorption is compromised. Generally, the therapeutic alternatives point to the modulation of the bone resorption acting at the level of the osteoclast. However, these therapeutic approaches are not enough, generating the need to implement new pharmacological strategies targeting the physiology of the bone-forming cell, the osteoblast. To this end, an extensive and detailed knowledge of both the function and processes of proliferation, migration and differentiation of the aforementioned cell are necessary.
Purinergic signaling system, wherein nucleotides are released by cells in a controlled manner, and act as extracellular messengers activating purinergic receptors in the plasma membrane of the target cell is known for about 45 years. Since then, it has been reported an increasing number of cells capable of releasing nucleotides, in a controlled manner, to the extracellular medium, which together with the fact that virtually all cells in the body have some type of purinergic receptor (purinoceptor), makes of this signaling system one of the most important regarding the regulation of body homeostasis.
The role of nucleotides and their receptors in the proliferation and differentiation processes of osteoblasts has been studied for about 25 years. However, the complete elucidation of the regulatory mechanisms of these processes has not yet been reached.
The aim of this work was to determine the effects of the activation of purinergic receptors by extracellular nucleotides in the processes of cell migration, proliferation and differentiation in neonatal rat calvaria primary cultures. We also investigated the effect of a high concentration of extracellular calcium on cell proliferation and differentiation and its influence on the regulation of these processes by purinergic stimulation. In addition, the role of the GSK3 enzyme (by inhibition with lithium) was evaluated in the regulation of cell proliferation and differentiation. Finally, the effect of the mentioned agonists on the expression and localization of β-catenin was examined.
Cell migration was assessed by "wound assay". Treatment with nucleotides showed to stimulate the migration of the calvaria cells.
The proliferation process was studied by using flow cytometry, Neubauer chamber count and Crystal Violet staining. The results obtained attribute positive effects to the extracellular nucleotides. On the other hand, treatment with Lithium caused decreases in the proliferative capacity of the cells. While no changes in proliferation were observed by incubation of the cells in medium with high concentration of extracellular calcium.
The analysis of cell differentiation to an osteoblastic phenotype was carried out by measurements of Alkaline Phosphatase (FAL) enzyme activity, quantification of mRNA of osteoblastic maturation / differentiation markers by QRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction) and detection of mineralization by Alizarin red staining. In this regard, treatment with ATPγS exhibited a pro-osteogenic role, by raising the enzymatic activity of FAL, the gene expression of differentiation markers and the mineralizing capacity. In contrast, the UTP agonist did not induce changes in enzyme activity and, in most cases, repressed the transcription of osteogenic genes.
On the other hand, exposure to lithium increased FAL activity but repressed the expression of osteogenic genes and decreased the mineralization of the cultures.
A high concentration of extracellular calcium showed positive effects at the level of differentiation, increasing the FAL activity and mineralization of osteoblasts.
Finally, the treatment of cultures with extracellular nucleotides in medium containing high calcium concentration showed slight additive / synergistic effects in the stimulation of differentiation into bone-forming cells.
Expression of β-catenin was increased under treatment with extracellular nucleotides, Lithium or Calcium. Also nucleus translocation was increased by these treatments.
According to the results obtained in this work, a regulatory role on osteoblastic physiology can be attributed to the purinergic signaling system and GSK3 / β-catenin.
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Receptores purinérgicos en células de músculo liso vascular de la arteria umbilical humana: caracterización electrofisiológica y su rol en la regulación del calcio intracelularEnrique, Nicolás Jorge 09 April 2015 (has links)
El objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral es contribuir al conocimiento y desarrollo de un área básica de importante impacto sobre la salud humana como lo es la fisiología vascular. Nos interesa aportar al conocimiento de los vasos humanos, por lo cual planteamos utilizar en este estudio la arteria umbilical humana (AUH), un vaso sanguíneo accesible, que se descarta luego del parto junto con la placenta, y que tiene un importante rol fisiológico en la regulación del flujo sanguíneo feto-placentario. Analizar las propiedades del músculo liso que integra la pared de esta arteria nos permite profundizar en el conocimiento de los factores endógenos que pueden regular el flujo de este lecho vascular.
Los objetivos específicos son:
1) en primer lugar, estudiar la respuesta que genera el ATP extracelular en las células de músculo liso de la AUH, caracterizando los cambios bioeléctricos que puede generar este agonista actuando a través de sus receptores ionotrópicos.
2) en segundo lugar, indagar si este agonista produce variaciones en la concentración del calcio intracelular y cuáles son las estructuras celulares que intervienen en la respuesta.
3) por último, analizar si existe un acople funcional entre receptores purinérgicos ionotrópicos y el canal de K+ de alta conductancia sensible al voltaje y al Ca2+ intracelular, BKCa. Este canal es objeto de estudio de nuestro grupo de investigación y hemos caracterizado, en trabajos previos, sus propiedades electrofisiológicas e identificado su rol protagónico en la modulación del potencial de membrana de estas células.
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Investigação das ectonucleotidases na diferenciação de macrófagos e na ativação de plaquetas : o papel da homocisteínaZanin, Rafael Fernandes January 2010 (has links)
Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.
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Papel do receptor P2x7 no efeito da toxina a do Clostridium difficile em modelo de alça ileal em camundongos / Role of the P2x7 receptor on the effect of Clostridium difficile toxin on ileal loop model in miceSantos, Ana Angélica Queiroz Assunção 16 January 2017 (has links)
SANTOS, A. A. Q. A. Papel do receptor P2x7 no efeito da toxina a do Clostridium difficile em modelo de alça ileal em camundongos. 2017. 100 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-30T16:00:58Z
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Previous issue date: 2017-01-16 / Clostridium difficile (C. difficile) is the major cause of colitis associated with the use of antibiotics, with significant morbidity and mortality. The enteric nervous system (ENS) is located in the gastrointestinal tract (GIT) and has an important function of regulating the digestive system. The P2X7 receptor participates in the regulation of cellular permeability, cytokine release and apoptosis, processes that are involved in the pathogenesis of C. difficile induced disease.The aim of this study was to analyze the role of the P2X7 receptor in enteritis induced by C. difficile toxin A (TcdA). The mouse ileal loop was injected with saline (Sodium Chloride 0.9% - Control) or TcdA (50 μg / loop) in mice previously treated with the inhibitors: BBG (50 mg/kg) or A438079 (10 μM) i.p.injection 1 h prior to TcdA (TcdA + BBG; TcdA + A438079) or saline injection. The animals were euthanized after 4h latter and the ileal loop collected for the following analyzes: immunofluorescence for ChAT, NOS, P2X7 and calretinin in membrane preparations, immunohistochemistry for GFAP, HuC / D, S-100β, TUNEL and PCR for P2X7. The results demonstrated that TcdA significantly reduced myenteric plexus neurons in 66.42% when compared to the control, while in the membrane preparations a significant reduction of the immunoreactive neurons to ChAT was observed in 23.21% and Calretinin 28.17%. However, there was a 21.23% increase in labeling for the P2X7 receptor over the control. In the ileal tissue there was an increase of 411.95% and 22.40% respectively in the P2X7 positive area and in the gene expression. In relation to the glial markers, an increase of 125.71% and 144.30% was observed for GFAP and S-100β, respectively. In animals treated with inhibitors P2X7; BBG and A438079, as observed an improvement in histological parameters . In addition , a significant reduction in the number of apoptotic cells decrease in GFAP and S-100β-labeled cells, and cytokines ( TNF-α, IL-1β, IL -6 and IL-8) levels, compared to the control. This was associated with a significant increase in the HuC/D positive area . From these results, it is concluded that TcdA promotes changes in the enteric nervous system, increasing neuronal death and activating glial cells, and that the P2X7 receptor plays an important role in the changes induced by C. difficile TcdA. / O Clostridium difficile (C. difficile) é a maior causa de colite associada ao uso de antibióticos, com significante morbidade e mortalidade. O sistema nervoso entérico (SNE) está localizado no trato gastrointestinal (TGI) e possui importante função de regulação do sistema digestório. O receptor P2X7 presente nas células gliais entéricas (CGE) e no SNE participa na regulação da permeabilidade celular, liberação de citocinas e apoptose, processos que estam envolvidos na patogênese do C. difficile. O objetivo deste estudo foi analisar o papel do receptor P2X7 na enterite induzida pela toxina A (TcdA) do C. difficile. A alça ileal dos camundongos foi injetada com salina (Cloreto de Sódio 0,9%- Controle) ou TcdA (50 μg/alça) em camundongos previamente tratados com os inibidores: BBG (50 mg/kg) ou A438079 (10 μM) via intraperitoneal 1h antes da injeção da TcdA ou salina. Os animais foram eutanaziados após 4h da injeção e a alça ileal coletada para as seguintes analises: imunofluorescência para ChAT, NOS, P2X7 e calretinina nos preparados de membrana, imunohistoquímica para GFAP, HuC/D, S-100β, TUNEL e PCR para P2X7. Os resultados demonstraram que a TcdA reduziu significativamente em 66,42% os neurônios do plexo mioentérico quando comparado ao controle, enquanto nos preparados de membrana observou-se uma redução significativa dos neurônios imunorreativos a ChAT em 23,21% e Calretinina 28,17%, contudo, houve um aumento de 21,23% da marcação para o receptor P2X7 em relação ao controle. No tecido ileal verificou-se um aumento de 411,95% e 22,40% respectivamente na área positiva para P2X7 e na expressão gênica. Em relação aos marcadores gliais, observou-se um aumento de 125,71% e 144,30% para GFAP e S-100β, respectivamente. Nos animais tratados com os inibidores de P2X7: BBG e o A438079 observou-se uma melhora dos parâmetros histológicos, uma redução significativa do número de células apoptóticas, das células marcadas para GFAP e S-100β, das citocinas: TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 com relação ao controle e um aumento significativo na área positiva para HuC/D em relação a TcdA. A partir desses resultados, concluiu-se que a TcdA promoveu alterações no sistema nervoso entérico, aumentando a morte neuronal e ativando as células da glia, e que o receptor P2X7 tem participação importante nas alterações induzidas pela TcdA do C. difficile.
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Desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para glioblastoma através da nanotecnologia e da modulação do sistema imune e sistema purinérgicoFigueiró, Fabrício January 2015 (has links)
Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.
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Padronização da triagem de alto desempenho de antagonistas para receptores purinérgicos ativados por UTP a partir da mensuração de cálcio intracelularFerreira, Natiele Carla da Silva January 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os receptores purinérgicos são proteínas expressas na membrana plasmática de diversos tipos celulares e são ativadas por purinas e pirimidinas extracelulares. Eles são classificados em receptores P1 e P2, de acordo com o tipo de ligante fisiológico, entretanto, os P2R são ainda subdivididos nas classes: P2XR, que abrange os subtipos ionotrópicos e P2YR, que agrupa os subtipos acoplados à proteína G. Dentre os P2YR, os subtipos P2Y2 e P2Y4 vem sendo amplamente estudados em virtude de suas funções sobre diversos sistemas biológicos. Uma vez ativados pelo UTP, estes receptores promovem a ativação e inibição de canais iônicos, controlam o fluxo de íons através da membrana, induzem um aumento de cálcio intracelular, além de estimular a proliferação celular. Em vista disso, muitos grupos de pesquisa já vem estudando o P2Y2 e o P2Y4 como alvos terapêuticos para o tratamento de diversas doenças, tais como fibrose cística, doença do olho seco, doença de Alzheimer, entre outras. Entretanto, a escassez de moléculas com propriedade antagonista seletiva sobre estes receptores dificulta o avanço da caracterização de novos papéis funcionais associados a eles, e neste contexto, os produtos naturais podem atuar como uma importante fonte para a descoberta de compostos que apresentem a característica almejada
Por isso, o objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia de mensuração de cálcio intracelular induzido pelo UTP em células da linhagem de macrófagos murinos J774.G8 e realizar a triagem de extratos oriundos de produtos naturais a fim de identificar compostos com atividade antagonista sobre o P2Y2R e o P2Y4R. Para isso, foi padronizado um protocolo de carregamento celular com o indicador de cálcio Fluo-4AM com posterior leitura dos sinais de cálcio no FlexStation III em células J774.G8. A partir desta padronização foi realizada a caracterização dos subtipos de receptores P2 expressos nestas células que possuem vias de sinalização que aumentam o cálcio intracelular, além da triagem de 78 extratos de origem natural para averiguar a sua atividade antagonista sobre receptores P2YR ativados por UTP. Nesta triagem, identificamos 7 extratos com atividade antagonista sobre o aumento de cálcio induzido pelo UTP e que não demonstraram citotoxicidade após o tratamento de 15 e 60 minutos. Com isso, acreditamos que essa metodologia seja capaz de identificar novos antagonistas para estes receptores, o que irá contribuir significativamente para o campo de Farmacologia de Receptores Purinérgicos / The purinergic receptors are proteins expressed in plasma membrane of many cell types that are activated by extracellular purines and pyrimidines. They are classified in P1 and P2 receptors, according to physiological ligand. However, the P2R are further subdivided in two
classes: P2X for ionotropic subtypes and P2Y for G-protein coupled ones. Among P2YR, the P2Y2 and P2Y4 subtypes has been widely studied due to their functions in many biological systems. Once activated by UTP, these receptors promote the activation and inhibition of ion channels, control the flow of ions through the membrane, induce an increase of intracellular calcium and stimulate the cell proliferation. In view of this, many research groups have been studying the P2Y2 and P2Y4 as therapeutic targets for the treatment of several diseases like Cystic Fibrosis, Dry Eye Disease, Alzheimer, among others. However, the lack of molecules with selective antagonist property on these receptors difficults the advancement of characterization of new functional roles associated with them, and in this context, natural
products may act as an important source for the discovery of compounds that present this desired feature. Therefore, the aim of this study was to standardize a methodology for
measurement of intracellular calcium mobilization induced by UTP in a murine macrophage cell line J774.G8 and perform the screening of extracts derived from natural products in order to identify compounds with antagonist activity on the P2Y2R and P2Y4R. For this, it was standardized a protocol of cell labeling with calcium indicator Fluo-4AM in J774.G8 cells with subsequent detection of calcium signals in FlexStation III. With this standardization, it
was characterized the P2 receptors subtypes expressed in this cell line that have signaling
pathways of increase of intracellular calcium and the screening of 78 extracts from natural origin to verify its antagonist activity on P2YR receptors activated by UTP. In this screening, we identified 7 extracts with antagonistic activity on the increase of calcium induced by UTP
and they did not demonstrate cytotoxicity after treatment 15 to 60 minutes. Thus, we believe
that this method is able to identify new antagonists to these receptors, which will significantly contribute to the Purinergic Receptors Pharmacology field.
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