Aquesta tesi es centra bàsicament en l'estudi i caracterització de tres gens de ratolí, que comparteixen la característica d'expressar-se a ronyó i d'estar regulats pels andrògens, els quals estimulen la seva expressió renal a nivell de mRNA.El primer d'ells correspon al gen Cyp4b1 -representant dels citocroms P450, enzims implicats en el metabolisme oxidatiu tan de substàncies endògenes com en la detoxificació de fàrmacs i xenobiòtics. S'ha estudiat la seva expressió en diversos teixits murins i, mitjançant hibridació in situ, s'ha localitzat la distribució del seus transcrits en el ronyó. En aquest darrer teixit, s'ha investigat l'efecte de les hormones andrògenes en la seva expressió, utilitzant ratolins castrats i control de vàries soques. A nivell genòmic, s'ha clonat el seu gen i les dues primeres kb de promotor del Cyp4b1, determinant la seva seqüència, la seva organització genòmica i els límits exó/intró corresponents. Amb el fragment de promotor aïllat s'han preparat construccions reporteres, amb les quals s'han realitzat assaigs de transfecció transitòria per tal d'analitzar i avaluar els possibles elements reguladors presents, tan a nivell d'expressió basal en línies renals, com a nivell d'inducció i capacitat de resposta androgènica.Els dos gens restants descrits -Oatp1 i Oatp-d/MJAM- eren prèviament desconeguts, pel que s'ha hagut de clonar i seqüenciar el seu cDNA sencer en aquest treball. Un cop identificats s'ha vist que ambdós corresponien a membres de la família murina dels transportadors d'anions orgànics, OATPs, proteïnes poliespecífiques de transport amb una ampli ventall de substrats que pot incloure des de sals biliars, esteroides conjugats i eicosanoides, fins a drogues i xenobiòtics orgànics. Al igual que pel Cyp4b1, s'ha estudiat la seva distribució tissular a nivell de missatger, i també la dependència androgènica de la seva expressió renal en diferents soques murines.Per Oatp1 en particular, s'ha realitzat una caracterització preliminar a nivell funcional determinant la seva afinitat per alguns substrats, amb assaigs de transport en oòcits de Xenopus laevis. A nivell genòmic, s'ha identificat temptativament la seqüència de la possible regió 5' adjacent del seu gen.Finalment, per Oatp-d (prèviament anomenat MJAM), s'han realitzat diversos estudis comparatius entre rosegadors i humans, que inclouen el mapatge cromosòmic del gen en ratolins i del seu corresponent ortòleg en rates. El posicionament dels gens Oatp-d de rata i OATP-D -l'ortòleg humà- en sengles regions genòmiques on han estat situats possibles loci genètics d'influència en hipertensió, ha fet que exploréssim a nivell preliminar una possible implicació d'aquest gen en els processos esmentats. S'ha abordat a través de comparar la seqüències dels cDNA corresponents i l'expressió renal de Oatp-d en rates de les soques WKY(normotenses) i SHR (hipertenses genètiques).El present treball hauria d'englobar-se dins el marc d'una aproximació als mecanismes moleculars específics reguladors de l'expressió gènica, per part dels andrògens. / This thesis is centered on the study and characterization of three murine genes with kidney androgen-regulated expression. The androgenic hormones stimulate their renal expression at the level of mRNA. The first gene corresponds to Cyp4b1, a member of cytochrome P450 family (enzymes implied in the oxidative metabolism of endogenous substances and also in detoxification of diverse drugs and xenobiotics. The expression-pattern of Cyp4b1 was analyzed in several mouse tissues and, by means of in situ hybridization, the distribution of its mRNA was located into the kidney. The effect of androgenic hormones on its renal expression was evaluated, using castrated and intact control mice of different strains. At genomic level, the organization of the Cyp4b1 structural gene was determined as well as its promoter region (about 2-kb of its proximal promoter being cloned and sequenced). With the promoter fragment isolated, it has been prepared several reporter constructs, to test the presence of putative regulatory elements in the promoter, in transient transfection experiments. The level of basal expression of those constructs in renal cell lines and the responsiveness to androgen was also evaluated. For the remaining two genes described (Oatp1 and Oatp-d/MJAM) that were previously unknown, it has been cloned and sequenced his corresponding full-length cDNAs. The both genes identified belongs to the murine organic anion transporting-polypeptide family (Oatp's), polyspecific organic anion transport proteins with broad range of substrates, which can include biliar salts, conjugated steroids and eicosanoids, organic drugs and xenobiotics. Like for the Cyp4b1, its tissue distribution at messenger level has studied, and also the androgenic dependency of its renal expression in several mouse strains. For mouse Oatp1, it has been characterized at functional level, determining his affinity for some anionic substrates in transport studies using Xenopus oocytes. At genomic level, it has been identified tentatively the 5'-flanking region of their gene.Finally, for Oatp-d (previously known as MJAM), several comparative studies between rodents and humans have been made, including the chromosomal mapping of the gene in mice and its corresponding orthologous in rats. The localization of the rat and human OATP-D genes in genomic regions where they have been described genetic loci with putative influence on hypertension, makes that we considered the analysis of the Oatp-d implication, at preliminary level, in the mentioned processes. These studies consisted in the sequencing and comparation of the corresponding cDNA full coding-regions (and also its renal expression), between Oatp-d in WKY(normotensive) and SHR (spontaneous hypertensive) rats. The present work would have to be included within the general frame of the study of molecular mechanisms of kidney androgen gene-regulation mechanisms. / Esta tesis se centra básicamente en el estudio y caracterización de tres genes murinos que comparten la característica de expresarse y estar regulados por los andrógenos en el riñón, los cuales estimulan su expresión renal a nivel de mRNA. El primero de ellos corresponde al gen Cyp4b1 -representante de los citocromos P450, enzimas implicadas en el metabolismo oxidativo tanto de sustancias endògenas como en la detoxificación de fármacos y xenobióticos. Se ha estudiado su expresión en varios tejidos murinos y, mediante hibridación in situ, localizado la distribución de sus transcritos en el riñón. En este último tejido, también se ha investigado el efecto sobre su expresión de las hormonas andrógenas, utilizando ratones castrados y control de diferentes cepas. A nivel genómico, ha sido clonado el gen del Cyp4b1 así como las dos primeras kb de promotor, determinándose su secuencia, su organización genómica y las intersecciones exón/intrón correspondientes. Con el fragmento de promotor aislado han sido preparadas diversas construcciones reporteras, con las cuales se han realizado ensayos de transfección transitoria para evaluar los posibles elementos reguladores presentes en el promotor, tanto a nivel de expresión basal en líneas renales, como a nivel de inducción y capacidad de respuesta androénica. Los dos genes restantes descritos -Oatp1 y Oatp-d/MJAM- eran previamente desconocidos, por lo cual se ha clonado y secuenciado su cDNA entero a partir de riñón. Uno vez identificados los correspondientes cDNAs, se ha visto que ambos correspondían a miembros de la familia murina de los transportadores de aniones orgánicos, OATPs, proteínas poliespecíficas de transporte con una amplio abanico de sustratos que puede incluir desde sales biliares, esteroides conjugados y eicosanoides, hasta drogas y xenobióticos orgánicos. Al igual que para el Cyp4b1, se ha estudiado su distribución tisular de ambos genes a nivel de mensajero, y también la dependencia androgénica de su expresión renal en diferentes cepas murinas. Para Oatp1 en particular, se ha caracterizado a nivel funcional de manera preliminar, determinando su afinidad por algunos sustratos mediante ensayos de transporte en oocitos de Xenopus laevis. A nivel genómico, ha sido identificada tentativamente la secuencia de la región 5' adyacente de su gen.Finalmente, por Oatp-d (previamente denominado MJAM), se han realizado varios estudios computacionales comparativos entre roedores y humanos, que incluyen el mapage cromosómico del gen en ratones y de su correspondiente ortólogo en ratas. El posicionamiento de los genes Oatp-d de rata y OATP-D -su ortólogo humano- en sendas regiones genómicas dónde se han descrito posibles loci genéticos con posible influencia sobre la hipertensión, ha hecho que exploráramos a nivel preliminar una posible implicación de este gen en los procesos mencionados. Dichos estudios se han abordado a través de la comparación de la secuencias de los cDNA correspondientes (y también su expresión renal) entre Oatp-d en ratas de las cepas WKY(normotensas) y SHR (hipertensas genéticas). El presente trabajo debería englobarse dentro del marco general de una aproximación a los mecanismos moleculares específicos reguladores de la expresión génica renal, por parte de los andrógenos.

Entre els gens sotmesos a regulació androgènica al ronyó de ratolí i amb una expressió pràcticament exclsuiva al túbul proximal es troba el de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP). L'mRNA del gen de la KAP és el més abundant del ronyó de ratolí mascle i la hibridació in situ sols es detecta en les cèl·lules epitelials dels túbuls corticals (Meseguer et al., 1987). L'especificitat tan restringida de l'expressió del gen de la KAP així com el dimorfisme sexual que manifesta ha permès distingir dos patrons diferents dins les cèl·lules S1/S2 i S3 que integren el túbul proximal. En les cèl·lules S3 l'expressió de KAP és dependent de l'hormona tiroïdal i en les cèl·lules S1/S2 l'expressió sols present en mascles respon a andrògens i és dependent de la presència puntual de l'hormona tiroïdal durant la maduració gonadal. La mutació de dues putatives seqüències d'unió per a factors C/EBP situades a -429 i -457 del promotor del gen suposa en assajos de transfeccio transitòria en la línia cel·lular PCT3 derivada dels segments S1/S2 amb constructes de 638 pb del promotor, una caiguda de la inducció per andrògens de -40 cops. En aquesta Tesi s'ha comprovat mitjançant assajos EMSA que el receptor d'andrògens (RA) és capaç d'unir l'element de reposta a andrògens (ARE) situat a -39bp de l'inici de transcripció. Assajos de transfecció transitòria han mostrat que la mutació A<G de la primera adenina de la caixa TATA situada a -28 pb solapada parcialment amb l'ARE suposa una caiguda dramàtica en l'activitat del promotor del gen. Mitjançant assajos EMSA hem vist que la unió de RA a l'ARE mutat que incorpora el canvi de nucleòtid en la caixa TATA no es veu afectada per aquest. Hem pogut concloure que el gen de la KAP presenta una caixa TATA funcional necessària per a què es produeixi la inducció per andrògens que té lloc per unió de RA a l'ARE solapat i que el gen no es comporta com un gen TATA-less en els contextos d'inducció androgènica. Hem comprovat que la seqüència GC situada a -100 pb del promotor és un lloc d'unió pel factor Sp1 que és capaç d'induir l'activitat del constructe que incorpora els primers 638 pb del promotor. La caixa GC també és unida pel factor Sp3 que al seu torn no és capaç d'induir l'activitat del promotor i competeix amb Sp1 fent disminuir el seu efecte inductor. Mitjançant assajos de transfecció transitòria s'ha vist que Sp1 sinergitza amb RA en la resposta a andrògens del promotor. S'ha comprovat per assajos EMSA la possible unió dels factors C/EBP a les caixes -429 i -457. Així s'ha vist que que la caixa -457 és unida per C/EBP&#61538; en cèl·lules PCT3 i pels factors C/EBP&#61537; i &#61538; al ronyó de ratolí. La caixa -429 no és unida per cap dels factors C/EBP testats. S'han realitzat cromatografies d'afinitat per la caixa -429 i se n'ha aïllat l' ATP-dependant RNA helicase DDX20, helicasa que s'uneix al factor Steroidogenic Factor 1, possible candidat a regular la KAP. La predicció in silico per a la caixa -429 apunta la possible unió per Receptor de Glucocorticoides (GR) fet que ha permès constatar la col·laboració que en el promotor del gen ocorre entre andrògens, glucocorticoides i Sp1. L'escenari final descrit en aquesta Tesi per a la regulació del gen de la KAP apunta a una resposta androgènica del promotor dependent de la presència simultània de l'ARE, la caixa GC i la caixa -429 suggerint la col·laboracio entre AR, Sp1 i el factor que uneix la caixa -429. La caixa -457 (C/EBP&#61538;&#61481; sembla no tenir implicació en aquesta la resposta androgènica. / The Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) gene is exclusively expressed in proximal tubules of mouse kidney. It displays a differential regulation of expression by steroid and thyroid hormones (THs) in different proximal tubule segments. Whereas the pars recta (PR cells) responds to thyroid and sexual hormones, the pars convoluta (PCT cells) represents a truly androgen-dependent compartment because expression occurs only in the presence of androgens and functional androgen receptors. Using several genetically deficient mouse models it was determined that thyroid and GH modulate CCAAT/enhancer binding protein &#61537; and &#61538; levels that, in turn, control KAP expression in PCT cells in a developmentally dependent manner. In this thesis we demonstrated that C/EBP &#61538; actually binds to CAAT box located at -457 bp of the KAP promoter meanwhile the putative CAAT situated at -429 bp is not bound by a C/EBP protein. We have proved that AR binds to an Androgen Response Element located at -39 bp that is overlapping with the TATA box of the gene. We saw that the androgenic response of KAP promoter is mediated and increased by Sp1 factor. The GC box, Sp target sequence, is found at -110 bp and we have seen Sp3 is also able to bound it eventhough this factor competes with Sp1 for the binding decreasing the androgen promoted transcription. With the aim of determining which factor is bound to box -429 promoting KAP transcription we performed DNA affinity chromatograpy. With these assays we could isolate ATP-dependant RNA helicase DDX20, an helicase that interacts with Steroidogenic Factor 1 (SF-1) a new candidate for KAP gene regulation. The in silico predictions for box -429 indicated the possible binding of Glucocorticoid Receptor (GR). Eventhough GR is not bound to -429 sequence, we could see a strong collaboration of glucorticoids in the AR-Sp1 response in KAP promoter. The final scenario for KAP regulation we could describe in this Thesis is an androgenic response of the promoter depending on the simultaneous presence of ARE, GC box and box -429 suggesting a collaboration between AR, Sp1 and the transcription factor that is bound to -429 box.

Aquest treball està centrat en l'estudi i caracterització del gen SA de ratolí. Inicialment, en el nostre laboratori, es va identificar com un gen regulat per andrògens d'expressió exclusivament renal. Analitzant la distribució tissular del gen SA s'ha observat que s'expressa en altres teixits com el fetge, l'estómac o el testicle. S'ha aprofundit en l'estudi de la regulació del gen SA per part de les hormones sexuals, andrògens i estrògens, en el ronyó i el fetge de ratolí, òrgans a on s'expressa de forma abundant, especialment al ronyó.S'ha clonat el gen SA de ratolí complert, determinant l'organització genòmica i els límits exò/intrò; s'han obtingut diferents transcrits resultat de la transcripció del gen, la diferència entre ells es troba en la regió 5' gràcies a les diverses combinacions que es donen entre els tres primers exons no codificants del gen. S'han clonat 2 Kb del promotor pròxim del gen SA. Diferents fragments d'aquesta regió s'han fusionat al gen reportador luciferasa i les construccions obtingudes s'han utilitzat per determinar l'activitat promotora, en assajos de transfecció transitòria. Aquests assajos han permés definir i posteriorment analitzar possibles elements reguladors presents en el promotor SA, implicats tant en l'expressió basal com en la resposta andrògenica del gen, en vaires línies cel.lulars renals i una línia cel.lular hepàtica. S'han produït anticossos policlonals contra pèptids sintètics específics de la proteïna SA que han permés idenficar-la en extractes proteics de ronyó de ratolí. S'ha comprovat que la seva regulació androgènica és paral.lela a la del corresponent mRNA. La SA s'ha identificat com una medium-chain acyl-CoA synthetase mitocondrial, en aquest treball hem demostrat la seva localització mitocondrial en una línia cel.lular renal, així com, la seva activitat enzimàtica en front a un substracte hidrocarbonat com l'àcid octanoic. L'elevada homologia a nivell de seqüència aminoacídica que presenta la SA amb altres enzims acil-CoA sintetasa ens ha permés identificar un domini d'unió a l'àcid gras en la proteïna molt conservat en tots aquests enzims. Mitjançant tècniques de mutagènesi hem observat que algun dels aminoàcids que formen aquest domini podrien ésser essencials en l'activitat enzimàtica de la SA.Donat que la proteïna SA participa en el metabolisme dels àcids grassos, en aquest treball hem estudiat la possible implicació dels receptor nuclears PPAR sobre l'expressió del gen SA, realitzant estudis in vitro a nivell d'activitat promotora en assajos de transfecció transitòria i, realitzant estudis in vivo amb ratolins mascle que s'han sotmés al tractament farmacològic d'agonistes específics per aquests receptors. / This work is based in the study and characterization of the mouse SA gene. We had first identified the mouse SA gene on the basis of its strong androgenic regulation in mouse kidney. Analyzing the tissue distribution of the gene it has been observed that is expressed in other tissues like the liver, the stomach or the testicle. It has been study the regulation of the gene by sexual hormones, androgens and estrogens, in the kidney and the liver of mouse, organs where it are expressed of abundant form, specially in the kidney. The complete mouse gene has been cloned, determining the genomic organization and the exon/intron boundaries; they have been obtained different transcripts result from the transcription of the gene, the difference among them is in the region 5' thanks to the diverse combinations that occur between the three first untranslated exons of the gene. We have cloned 2 Kb of the SA gene promoter. Different fragments from this region have cloned to the reporter gene luciferasa vector and the obtained constructions have been used to determine the transcriptional activity, by transitory transfection. These tests have allowed to define and later to analyze some regulating elements in SA promoter, implied so much in the basal expression as in the androgenic regulation of the gene, in several kidney and liver cellular lines. Polyclonal antibodies raised against SA-specific peptides revealed it in mouse kidney extracts. The protein androgenic regulation is parallel that of the mRNA. The SA protein has been identified like a medium-chain acyl-CoA synthetase located in the mitochondria, in this work we have demonstrated its mitochondrial location in a renal cellular line, as well as, its enzymatic activity forehead to a hydrocarbon substratum like octanoic acid. The SA present elevated homology with other enzymes acyl-CoA synthetase has allowed us to identify a binding domain to fatty acid in the protein very conserved in all these enzymes. By means of mutagenic techniques we have observed that some of the amino acids that form this binding domain be able essential in the SA enzymatic activity. Since SA protein participates in the metabolism of fatty acids, in this work we have analised the possible implication of the PPAR's on the SA expression gene, having made studies in vitro of transcriptional activity by transitory transfection and, doing studies in vivo with mice male that have been put under the farmacologycal treatment of specific agonists for these PPAR's.

L'interès de l'estudi de la regulació dels gens de proteïnes de reserva de cereals prové del fet que són gens específics de llavor, amb una expressió lligada al desenvolupament del gra, i molts d'ells mostren una gran eficiència transcripcional. Els patrons d'expressió d'aquests gens suggereixen l'existència de complexes reguladors constituïts per diferents activadors transcripcionals que reconeixen els elements en cis- implicats en la seva expressió. Tot i els nombrosos estudis fets, els mecanismes moleculars implicats es coneixen poc. A blat de moro, el nostre model d'estudi, les proteïnes de reserva s'acumulen majoritàriament a l'endosperma i, en menor mesura, a l'embrió. A endosperma s'acumulen les zeïnes (les prolamines de blat de moro), mentre que a embrió trobem globulines i oleosines. Tant les zeïnes com les globulines s'acumulen en orgànuls derivats del reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics, mentre que les oleosines s'acumulen en cossos lipídics. L'interès del nostre grup se centra en el gen gamma-Z, que codifica per una proteïna de reserva d'endosperma, la gamma-zeïna. El gen gamma-Z està present en una o dues còpies per genoma haploide i, en canvi, el seu producte representa fins al 15% del contingut proteic del gra, suggerint una fina regulació gènica.L'objectiu general d'aquest treball era caracteritzar nous factors de transcripció implicats en la regulació de l'expressió del gen gamma-Z i altres factors reguladors de l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específics d'endosperma però també lligats al desenvolupament de la llavor.Els objectius concrets així com els resultats obtinguts es descriuen breument a continuació:1) Caracterització funcional del factor proteic PBF com a regulador positiu del gen gamma-Z. Identificació del domini activador de PBF. PBF és un activador transcripcional del promotor del gen gamma-Z i volíem caracteritzar el domini responsable d'aquesta funció mitjançant estudis d'activació per expressió transitòria en endospermes joves de blat de moro. Aquests estudis van revelar que el domini activador de PBF es localitza en el seu domini C-terminal, però que l'activitat d'aquest factor proteic depèn de la seva capacitat d'unió al DNA. 2) Recerca de nous factors de transcripció responsables de l'expressió del gen gamma-Z i implicats en el reconeixement de seqüències presents a la regió proximal del seu promotor: clonatge del gen GAMYB de blat de moro i estudis d'immunolocalització. Caracterització d'aquest factor com a regulador transcripcional del gen gamma-Z. El gen ZmGAMYB codifica per un factor de transcripció de tipus Myb R2R3, que s'uneix de forma específica a la caixa AACA del promotor del gen gamma-Z i que és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. ZmGAMYB s'expressa específicament a endosperma de blat de moro en desenvolupament, coincidint amb el patró d'expressió de PBF i concordant amb la possibilitat de que reguli l'expressió del gen de la gamma-zeïna. El factor mGAMYB s'acumula a les capes més superficials d'aquest teixit (aleurona i subaleurona).3) Recerca de nous factors de transcripció implicats en l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específiques d'endosperma: clonatge del gen FUSCA3 de blat de moro, estudis d'immunolocalització a gra de blat de moro i posterior caracterització d'aquest factor.El gen ZmFUSCA3 codifica per un factor de transcripció de tipus B3 i s'expressa majoritàriament a embrió de blat de moro en desenvolupament. El factor mFUSCA3 s'acumula massivament a l'aleurona i a l'embrió, suggerint que sigui un regulador de l'acumulació de productes de reserva en aquests teixits. FUSCA3 és capaç d'unir-se a la caixa RY-like present a la regió proximal del promotor del gen gamma-Z, tot i que de forma poc específica, però no és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. / In cereals, major seed storage proteins are called prolamins and accumulate primarily in the endosperm. Prolamin genes are tissue specific and show high efficiency levels, suggesting tight genetic regulation. In maize, our model specie, prolamins are accumulated in ER derived structures called protein bodies, whereas other storage proteins such as globulins or oleosins accumulate in the aleurone layer and in the embryo. The interest of our group resides in the gamma-zein, an endosperm specific storage protein, which constitutes the 15% of the proteic content of the grain, whereas its gen is present in only one or two copies per haploid genome. The object of the present work was to characterize new transcription factors implicated in seed storage gene expression linked to grain development, especially those involved in gamma-Z gene expression. Specific objectives as well as results achieved are briefly described bellow. 1) Functional characterization of PBF as a positive regulator of gamma-Z gen. PBF is a transcriptional activator of gamma-Z gene and its activation domain is located in the C-terminal region of the protein, but its activity depends on its binding to DNA.2) New transcription factors involved in gamma-Z gene expression: cloning of GAMYB gene in maize and immunolocazation assays. Characterization of this factor as a transcriptional regulator of gamma-Z gene.ZmGAMYB encodes a Myb R2R3 transcription factor that specifically binds to the AACA box of the gamma-Z gene promoter and activates gamma-zein expression from this promoter. ZmGAMYB is specifically expressed in maize developing endosperm, as other gamma-Z regulators do. The proteic factor accumulates in the more superficial layers of this tissue (aleurone and subaleurone).3) New transcription factors related to seed storage gene expression: cloning of FUSCA3 gene in maize, immunolocazation assays and characterization of this factor.ZmFUSCA3 encodes a B3 transcription factor highly expressed in maize developing embryo. The proteic factor accumulates massively in the aleurone layer as well as in the embryo, suggesting a regulatory role in seed storage products accumulation in these tissues. FUSCA3 binds RY-like motives of the gamma-Z gene promoter, with weak specificity, but does not activate expression from this promoter.

Els resultats que es presenten en aquesta memòria aporten informació que ens permet donar un pas més en el coneixement de la regulació transcripcional del gen pfkfb3 i conseqüentment de la via glucolítica.En primer lloc, hem localitzat els elements de resposta de HIF-1 al promotor del gen i hem observat que aquests eren essencials per a la resposta a la hipòxia en cèl·lules de glioblastoma humà (T98G) i en fibroblasts embrionaris de ratolí (mEF). Seguidament, hem corroborat la implicació de la progesterona en la regulació del gen pfkfb3, que inicialment havien descrit Hamilton i col·laboradors {Hamilton, 1997 #93}. Hem posat de manifest l'augment d'expressió d'uPFK-2 i del seu mRNA en cèl·lules de càncer de mama (T47D) incubades amb la hormona. A més a més, hem determinat que aquest increment era degut a l'acció dels receptors de progesterona (PR, progesterone receptors). Hem localitzat una possible seqüència consens per aquests receptors (PRE, progesterone response element) al promotor del gen pfkfb3, però encara no hem pogut demostrar si el paper que exerceix la progesterona en la regulació d'aquest gen és a nivell transcripcional o a nivell d'estabilització del seu mRNA. Per comprovar els resultats obtinguts en cèl·lules aïllades, hem estudiat la regulació del gen pfkfb3 in vivo, utilitzant com a model d'experimentació animal la soca de ratolins C57/BL6. Els hem tractat amb STZ i hem observat l'increment d'expressió del mRNA del gen pfkfb3, d'uPFK-2, i de la concentració de Fru-2,6-P2 en el fetge d'animals diabètics. Paral·lelament, hem realitzat l'estudi de la regulació transcripcional del promotor del gen pfkfb3, in vivo, utilitzant la tècnica de transferència gènica per hidrodinàmia. Els resultats obtinguts demostren l'augment de la transcripció del gen en el fetge dels ratolins diabètics en condicions de dejuni. A més, hem realitzat estudis immunohistoquímics dels fetges diabètics i controls, demostrant que l'expressió del gen pfkfb3 es produeix principalment en els hepatòcits proliferants de la zona perivenosa del fetge dels ratolins diabètics. També hem estudiat les vies de senyalització que porten a l'augment d'expressió del gen pfkfb3, demostrant que la via PI3K/Akt/mTOR (activa en aquestes cèl·lules altament proliferants) hi té un paper essencial. Aquests resultats obtinguts sobre la regulació del gen pfkfb3, juntament amb els que ja s'havien descrit {Hamilton, 1997 #93}; {Chesney, 1999 #96}; {Atsumi, 2002 #110}; {Riera, 2002 #113}; {Minchenko, 2002 #144}; {Riera, 2003 #114}; {Bando, 2005 #102}; {Telang, 2006 #106}, ens confirmen la importància que té el fenotip glucolític en les cèl·lules proliferants o tumorals. El gen pfkfb3 controla la síntesi de la Fru-2,6-P2 que, com s'ha explicat a la introducció, és l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1. Per tant, podem considerar que el gen pfkfb3 és clau per a la regulació de la via glucolítica, de manera que el seu augment d'expressió en diferents tipus de cèl·lules proliferants i tumorals condueix a l'activació d'aquesta via i, conseqüentment, afavoreix el canvi cap a un fenotip glucolític.

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és l'estudi de l'activitat educativa en línea posant atenció en els processos de feedback com a promotors de la regulació de l'aprenentatge. Des d'una aproximació socio-constructivista, s'ha elaborat una primera part teòrica fonamentada, en primer lloc, en les teories de l'aprenentatge i les teories de l'educació a distància; en segon lloc, en els processos de regulació de l'aprenentatge per acabar, en darrer lloc, amb la conceptualització del feedback en el context de l'ensenyament i l'aprenentatge en línia.La segona part de la recerca permet, inicialment, descriure de forma exploratòria els processos de feedback en nou assignatures de diferent naturalesa i propietats. Aquesta descripció facilita la selecció de les tres assignatures que, sota uns criteris predefinits, han estat considerades les més regulatives. En la part final de la recerca hem caracteritzat els processos de feedback d'aquestes assignatures a partir de l'anàlisi de la interacció educativa en línia.En síntesi, aquest estudi permet posar de manifest la importància del feedback en els entorns d'ensenyament i aprenentatge asincrònics i escrits. / This research aims to respond to some difficulties emerging from the characteristics of an online environment, i.e. asynchronous and based on written communication. In this context, it is not easy to gather evidence showing that students are progressing towards achieving learning objectives. One of the mechanisms teachers have to facilitate learning is giving feedback during the educational activity. The focus of this research is to identify and characterize feedback processes in the specific context of online teaching and learning. Feedback is conceptualized as a source of external regulation, provided by an agent whose aim is to promote the regulation of learning in order to facilitate the construction of knowledge. Little empirical study has so far been done around this research issue. Two studies conform this dissertation. The first one is a quantitative study aiming to provide a general exploratory description of the feedback given in nine courses of different nature developed online. The results obtained allow us to identify the presence of feedback in virtual classrooms and a general exploratory description of the feedback from the student's point of view. The second study presents a micro-level analysis of the characteristics of feedback given by the teacher in the three courses which have been selected because, potentially, promote at their best the regulation of online learning.

CD69 és una lectina tipus C amb orientació tipus II, que participa en la migració de limfòcits i la secreció de citocines. CD69 s'expressa a la gran majoria de leucòcits durant processos infecciosos, autoimmunitaris i neoplàsics, i s'utilitza àmpliament com a marcador de l'activació del sistema immunitari. El seu targeting amb anticossos monoclonals ha resultat útil en el tractament de malalties en diferents models animals i, per tant, per esbrinar quins són els mecanismes que controlen la seva expressió a la superfície cel•lular és molt important. L’expressió de CD69 és induïble i està fortament controlada a nivell transcripcional. Després de processos d’activació, els transcrits de CD69 es detecten als 30-60 minuts i la proteïna a les 4-6 hores. La present tesi ha estudiat quins són els elements genètics necessaris per a una correcta expressió temporal i espaial de CD69 in vivo. L’anàlisi de la seqüència de l’ADN en una regió 45Kb per sobre del gen va rebel•lar una conservació evolutiva del promotor i de quatre seqüències no codificants que van ser anomenats CNS1, CNS2, CNS3 i CNS4 (CNS, Conserved Non coding Sequence). Mitjançant experiments de digestió amb DNasa i d’immunoprecipitació de la cromatina, es va veure que aquests CNS eren regions obertes de cromatina amb modificacions epigenètiques específiques. A més, en assajos de luciferasa en cèl•lules T, es va veure que els elements CNS2 i CNS4 mostraven una activitat enhancer constitutiva i induïble. La generació de ratolins transgènics amb el reporter hCD2 va permetre analitzar la seva funció in vivo. El promotor conferia una expressió regulada durant la selecció positiva dels timòcits, però no podia donar suport a una expressió regulada en limfòcits madurs. La inclusió de CNS1 i CNS2 va causar la supressió de l'expressió del reporter i l'addició de CNS3 i CNS4 va donar lloc a una expressió regulada a les cèl•lules T, però no a les cèl•lules B. Vam concloure que CNS1-4 són elements reguladors importants que interactuen tant positivament com negativament amb el promotor de CD69 i que contribueixen de manera diferent a l'expressió CD69 a les cèl•lules T i B. D’altra banda, l’anàlisi in silico de regions intragèniques del gen de CD69 va revel.lar una estructura de la cromatina específica entre les seqüències codificants I i II (Intró I) que estava associada a nucleosomes posicionats. A més, en aquesta regió del locus CD69 humà es va identificar un lloc nou d’hipersensibilitat que era induïble per estimulació. Una anàlisi en el locus murí va rebel•lar una regió similar d’hipersensibilitat que sembla implicar almenys les primeres 2Kb de l'Intró I. Pel que fa a l’estructura de la cromatina, en timòcits negatius per CD69, aquesta regió intrònica mostrava nivells baixos i intermedis de l'acetilació i dimetilació de la lisina 4 i de la histona H3 respectivament. L’expressió de CD69 en aquest mateix tipus cel•lular durant la selecció positiva es va associar amb una inducció clara de l'acetilació de la histona H3 a l’Intró I. Curiosament, els limfòcits T perifèrics presentaven alts nivells d'aquestes marques de forma independent a l’expressió CD69. Per tant, l'Intró I pot jugar un paper crucial en el control de l'expressió del gen de CD69. Amb aquesta tesi hem observat que l'epigenètica i els elements distals d’ADN són importants la regulació de l’expressió de CD69, s'han ampliat considerablement els coneixements sobre els possibles mecanismes, que fins ara s'havia focalitzat només en el promotor, i proposa una nova base per a futurs estudis. / Thesis: "Transcriptional regulation of CD69 gene" Summary CD69 is a type II C-type lectin involved in lymphocyte migration and cytokine secretion.CD69 expression represents one of the earliest available indicators of leukocyte activation and its rapid induction occurs through transcriptional activation. In this thesis we examined the molecular mechanism underlying mouse CD69 gene transcription in vivo in T and B cells. Analysis of the 45kb region upstream of the CD69 gene revealed evolutionary conservation at the promoter and at four non-coding sequences (CNS) that were called CNS1, CNS2, CNS3 and CNS4. These regions were found to be hypersensitive sites in DNase I digestion experiments and chromatin immunoprecipitation assays showed specific epigenetic modifications. CNS2 and CNS4 displayed constitutive and inducible enhancer activity in transient transfection assays in T cells. Using a transgenic approach to test CNS function, we found that the CD69 promoter conferred developmentally regulated expression during positive selection of thymocytes but could not support regulated expression in mature lymphocytes. Inclusion of CNS1 and CNS2 caused suppression of reporter expression whereas further addition of CNS3 and CNS4 supported developmental-stage and lineage-specific regulation in T cells but not in B cells. We concluded CNS1-4 are important cis-regulatory elements that interact both positively and negatively with theCD69 promoter and that differentially contribute to CD69 expression in T and B cells. In silico analysis of intragenic regions of CD69 gene also revealed a specific chromatin structure between coding sequence I and II (intron I) associated with positioned nucleosomes. Intron I contained a novel hypersensitive site region that was inducible upon stimulation and, interestingly, its chromatin structure appears to be developmentally regulated. Thus, Intron I may also contain an important DNA regulatory element important for the correct expression of CD69.

L'objectiu principal d'aquesta tesi fou aprofundir en el coneixement de la relació estrès hídric-estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu és una de les moltes respostes de les plantes al dèficit hídric. Mentre que l'estrès oxidatiu és la conseqüència d'un desequilibri entre les espècies actives de l'oxigen i les espècies antioxidants a favor de les primeres; el dèficit hídric es dóna quan l'absorció d'aigua per les arrels és menor que la pèrdua d'aigua deguda a la transpiració per les fulles. Entre les espècies actives de l'oxigen, el peròxid d'hidrogen està involucrat en: inducció de l'estrès oxidatiu; alleujament de cadenes de transport d'electrons sobrecarregades; mort cel·lular programada; enduriment de parets cel·lulars; formació de xilema i senyalització intra- i inter- cel·lular en les respostes de les plantes a molt tipus d'estrès.Per una altra banda existeix el que s'anomena regulació redox, que inclou l'equilibri entre les espècies actives de l'oxigen i les espècies antioxidants, així com l'equilibri entrte les diferents parelles redox, com són les formades per ascorbat/dehidroascorbat, NAD(P)H/NAD(P)+ i glutatió/diglutatió, entre d'altres. L'equilibri entre aquestes parelles redox influeix sobre la formació i la destrucció de ponts disulfur de gran nombre d'enzims, que al seu torn indueix canvis conformacionals i en regula l'activitat, de manera que la regulació redox és clau en el metaboisme cel·lular vegetal. En primer lloc es va incidir en conèixer en la funció del peròxid d'hidrogen en l'aclimatació al dèficit hídric d'una espècie arbustiva mediterrània resistent a la sequeraAmb aquest objectiu es va estudiar la funció del peròxid d'hidrogen en l'aclimatació al dèficit hídric de Cistus albidus L. en condicions de camp. C. albidus es pot fer servir com a model de planta mediterrània resistent a la sequera, doncs és una planta arbustiva escleròfila, semi-decídua amb una resposta molt característica i fàcil de caracteritzar. Resisteix continguts hídric molt baixos a les seves fulles durant períodes de temps llargs i no presenta exigència davant el tipus de sòl en el que creix. Els resultats obtinguts mostren que el peròxid d'hidrogen va augmentar en resposta al dèficit hídric i que contribueix a l'aclimatació de C. albidus a la sequera d'estiu. En primer lloc, es va comprovar que el peròxid d'hidrogen no provoca estrès oxidatiu, ans al contrari, doncs simultàniament va augmentar la concentració d'ascorbat i va disminuir la de MDA (marcador de peroxidació lipídica). Altres estudis complemetaris demostren que l'augment de peròxid d'hidrogen està involucrat en la formació d'esclerènquima (mort cel·lular programada i engruiximent de la paret); formació d'àcid ascòrbic via àcid abscísic; formació de xilema; i fins i tot podria estar involucrat en la síntesi de metil-jasmonat.En segon lloc, com a mesura directa de la relació estrès hídric estrès oxidatiu es van estudiar els canvis en l'estat redox del citoplasma de les cèl·lules foliars de plantes d'Arabidopsis thaliana transformades amb proteïnes c-roGFP1. Aquestes plantes expressen proteïnes amb fluorescència verda (Green Fluorescent Protein) que són sensibles a l'estat redox del citoplasma on s'expressen, en aquest cas el citoplasma. Els resultats obtinguts mostren que el dèficit hídric gradual incrementa l'estat redox del citoplasma, tot i que aquest canvi no és el primer que experimenten les plantes, doncs el primer paràmetre on es va observar el canvi fou a l'àrea foliar de les plantes estudiades. / The aim of this thesis was deepening into the knowledge of the relationship water stress-oxidative stress. Oxidative stress is one of the many responses of plants to water deficit. Whereas oxidative stress is the consequence of an imbalance between active oxygen species and antioxidant species, favouring the first; water deficit is produced when there is less absorption of water from the roots than the loss of water from the leaves (transpiration). Among active oxygen species, hydrogen peroxide is involved in oxidative stress induction, relieve of overreduced electron transport chains, programmed cell death, cell wall hardening, xylem formation and intra- and inter-cellular signalling.The first aim was to know the function of hydrogen peroxide in the acclimation of a drought-resistant Mediterranean shrub. The chosen plant species was Cistus albidus L. because it can be used as a model of Meditarrean drought-resistant plant. C. albidus is a schlerophyllous shrub, semi deciduous with a characteristic and easy to characterize response. It is able to resist very low water contents and it has no special necessities regarding to soil characteristics.The results obtained show that hydrogen peroxide increased in response to water deficit, and that contributes to the acclimation of C. albidus to summer drought. First of all it was shown that hydrogen did not induce oxidative stress. Complementary studies show that hydrogen peroxide increase is involved in sclerenchyma formation, ABA-induced ascorbate formation, xylem formation, and could even be involved in methyl jasmonate biosynthesis. The second aim, a direct measurement of the relationship water stress oxidative stress, was based on the changes in the redox state of the cytoplasm of the leaf cells of Arabidopsis thaliana plants transformed with c-roGFP1 protein. These plants express proteins with green fluorescence that are sensitive to the redox state of the compartment where they are espressed, in this case the cytoplasm. The results obtained show that gradual water deficit induces an increase in the redox state of the cytoplasm, even though this is not the first change experienced in these plants. Among the parameters studied, the first was the reduction of leaf area.

Los objetivos principales de esta Tesis doctoral fueron: 1) cuantificar los efectos agudos y crónicos de fármacos opiáceos (mi-, delta- y kappa-selectivos) así como los cambios inducidos durante los estados de abstinencia (procesos de tolerancia y dependencia) sobre la vía de señalización del receptor Fas (formas de expresión de Fas, proteína de acople FADD y caspasas efectoras) en cerebro de rata; 2) identificar el tipo de receptor opioide involucrado en la modulación del complejo de señalización Fas/FADD mediante la utilización de ratones deficientes en receptores opioides (mi-, delta- y kappa-KO), e investigar la posible existencia de un tono opioide endógeno regulando las proteínas de esta vía en el cerebro; 3) averiguar si la modulación del complejo Fas y/o FADD por fármacos opiáceos implica (como mecanismo molecular) la participación de MAPK ERK1/2, analizando la reversión de un efecto opioide tras inhibición selectiva de los enzimas MEK1/2, tanto "in vitro" (PD98059) en células SH-SY5Y, como "in vivo" (SL 327) en cerebro de rata; 4) cuantificar en cerebro humano "postmortem" el estatus de la vía Fas/FADD y caspasas efectoras, así como los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC/PKA/CREB) y de las MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) en la corteza prefrontal de adictos a opiáceos, como modelo experimental más directo al problema de la adicción en humanos.Las diversas proteínas de estudio se cuantificaron mediante técnicas inmunológicas cuantitativas (separación electroforética seguida de Western blot) empleando anticuerpos específicos. Los principales resultados y conclusiones mayores de este trabajo de Tesis doctoral son:1. La adicción a opiáceos en cerebro de rata se asocia con incrementos en la densidad del receptor apoptótico Fas y con decrementos de la proteína FADD, transductora de la señal de muerte, sin que además se alteren las caspasas efectoras 8 y 3, lo que sugiere que los procesos de adicción a estos fármacos no están asociados con la inducción de apoptosis cerebral mediados por esta vía.2. La modulación de Fas (receptor nativo) por opiáceos depende mayormente del receptor mi-opioide, y la regulación de sus formas agregadas (trímeros relevantes en el inicio de la señalización) así como la de FADD se asocia con el receptor delta-opioide, lo que demuestra una modulación diferencial de los componentes de esta vía por el sistema opioide que podría tener repercusiones terapéuticas.3. La modulación inhibitoria de FADD por agonistas delta-opiáceos es dependiente, a través de un mecanismo indirecto, de la activación de las quinasas MAPK ERK1/2, vía de señalización que a su vez se ha relacionado con la regulación de varios mecanismos anti-apoptóticos. 4. La adicción a opiáceos en cerebro humano se asocia con una disminución en la densidad de FADD en la corteza prefrontal (efectos a corto y largo plazo) sin que se alteren las diversas formas del receptor Fas y ciertas caspasas efectoras, lo que de nuevo demuestra una probable menor actividad de esta proteína acopladora de Fas en este modelo humano de adicción a opiáceos. 5. La adicción a opiáceos en cerebro humano (efectos a largo plazo) también se asocia con una aparente normalización de los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC I, PKA, CREB y pCREB) y con una marcada inhibición de la vía de las MAPK (formas fosforiladas de MEK y de ERK1/2), lo que sugiere la inducción de alteraciones de plasticidad neuronal en estos cerebros humanos.En su conjunto, los resultados de esta Tesis demuestran la clara participación del complejo Fas/FADD en la adicción a opiáceos, tanto en los procesos de tolerancia como de dependencia física, lo que añade un nuevo nivel de complejidad a la señalización de los receptores opioides, probablemente mediatizando efectos no-apoptóticos relacionados con fenómenos de plasticidad neuronal. / The aim of this PhD work was to investigate the interactions between opioids receptors and the signaling pathway of the Fas/FADD (Fas Associated-Death Domain) receptor, involved in the regulation of apoptosis and neuronal plasticity. The main results and conclusions are: 1) opiate addiction in rat brain is associated with a strong up-regulation of the pro-apoptotic Fas receptor and a moderate down-regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 oncoprotein, without altering the content of caspases-8/3, suggesting that possible apoptotic signals engaged by Fas activation would be offset by decreased signal transduction through FADD and effector caspases-8/3; 2) the mi-opioid receptors appears to be associated with a tonic stimulation of monomeric Fas receptor, whereas the delta-opioid receptors tonically inhibits the basal density of trimeric Fas as well as that of FADD. This suggests posible homeostatic interactions between mi- and delta-opioid receptors in the control of Fas receptor machinery, being a major task of the delta-receptor to restrain the activation of Fas signalling; 3) the direct involvement of the two MAP kinases (sequential activation of MEK and ERK) in the in vivo regulation of FADD by the opiate; 4) opiate addiction in human brain is associated with a down-regulation of the inmunodensity of FADD in the prefrontal cortex (short-term and long-term abuse) without altering Fas receptor and effector caspases-8/3; 5) opiate addiction in human brain (long-term abuse) is associated with a normal regulation of the components of the cyclic AMP pathway components (AC I, PKA, CREB, pCREB) and with an important down-regulation of the MAPK (specially pMEK and pERK) pathway components in the prefrontal cortex, suggesting alterations in the neuronal plasticity in those human brains. In summary, the results of this PhD work demonstrated a clear participation of the complex Fas/FADD in opiate addiction, suggesting a new level of complexity in the signaling mediated through the activation of opioids receptors, probably mediating non-apoptotic effects related with neuronal plasticity.

No description available.