Made available in DSpace on 2015-03-26T13:32:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 619084 bytes, checksum: 33699c369d9fd3f595c40375c27f4c43 (MD5) Previous issue date: 2013-01-16 / One of the current objectives of molecular biology is to measure and assess the gene expression profiles in different types of biological tissues, to understand the mechanisms of molecular transformation under certain conditions. Next-generation sequencing (NGS) technologies promote DNA sequencing in platforms capable of generating information about millions of base pairs in a single step. However these technologies still have high cost, making it difficult to obtain large number of repetitions of sample data. Therefore, it becomes necessary the discovery and the improvement of efficient statistical methodologies for optimizing analysis of data generated in genome sequencing platforms. The overall objective of this work was to evaluate the effect of the number of repetitions in the identification of differentially expressed genes, in RNA-Seq experiments, contributing to the clarification of the statistic that researchers will assist in data analysis in RNA-Seq experiments. Specifically, we evaluate empirically the effect of the number of repetitions in the statistical analysis of gene expression in RNA-Seq experiments. To carry out the analyses we used a dataset defined in Li et al. (2008), which compared treated and non-treated cancer cells. That work had four biological replications for the control group (non-treated) and three replications for biological treatment group (cells that have received the treatment). The data was analyzed using the package DESeq from the statistical environment R. A total of 2566 genes were considered differentially expressed (DE) when we evaluate the original and complete dataset. When we analyzed three replications of the control and treatment, we found, on average, 2153 genes DE. From the moment in which only two reps for both treatments were used, were identified, on average, 1241 genes DE. The major change in the number of genes DE was observed when replications were not used. In this case we identified around 44 differentially expressed genes. According to the results generated in the analysis, it was possible to verify that the number of repetitions is an essential factor in order to obtain a significant number of differentially expressed genes. / Um dos objetivos atuais da biologia molecular é medir e avaliar os perfis de expressão gênica em diferentes tipos de tecidos biológicos, para entender os mecanismos de transformação molecular sob determinadas condições. Tecnologias de sequenciamento de Nova Geração (NGS) promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informações sobre milhões de pares de bases em uma única etapa. Porém essas tecnologias ainda apresentam custo elevado, dificultando a obtenção de elevado número de repetições de dados amostrais. Assim, torna-se necessária a descoberta e o aprimoramento de metodologias estatísticas eficientes para a otimização das análises de dados gerados em plataformas de sequenciamento de genomas. O objetivo geral desse trabalho consistiu em avaliar o efeito do número de repetições na identificação de genes diferencialmente expressos, em experimentos de RNA-Seq, contribuindo para o esclarecimento de pesquisadores que venham a auxiliar nas análises de dados em experimentos de RNA-Seq. De forma específica, avaliamos empiricamente o efeito do número de repetições na análise estatística da expressão gênica em experimentos de RNA-Seq. Para a realização das análises foi utilizado um conjunto de dados definido em Li et al. (2008), o qual comparou células cancerígenas tratadas e não tratadas. Naquele estudo havia quatro repetições biológicas para o grupo controle (células não tratadas) e três repetições biológicas para grupo de tratamento (células que receberam o tratamento). Os dados foram analisados utilizando o pacote DESeq do Programa computacional R. Um total de 2566 genes foram considerados diferencialmente expressos (DE) quando avaliamos o conjunto de dados original completo. Quando analisamos três repetições do controle e do tratamento, nós encontramos, em média, 2153 genes DE. A partir do momento em que apenas duas repetições para ambos os tratamentos foram utilizadas, foram identificadas, em média, 1241 genes DE. A grande alteração no número de genes DE foi observada quando repetições não foram utilizadas. Nesse caso identificamos em torno de 44 genes diferencialmente expressos. De acordo com os resultados gerados nas análises, foi possível verificar que o número de repetições é um fator essencial para se obter um número significativo de genes diferencialmente expressos.

Ce travail consiste à étudier l’expression, le rôle et l’échange des microARNs (miARNs), dans le système nerveux (SN). Les microARNs (miARNs) sont des petits ARNs endogènes non-codants qui exercent une régulation négative sur l’expression desgènes, en s’hybridant sur la région 3’ non-codante des ARNm cibles.Dans un premier, nous avons dévoilé le rôle spécifique du miR-92a, dans lecontrôle de l’expression de la sous-unité GluA1 des récepteurs AMPA, dans un paradigme de plasticité synaptique homéostatique, dans lequel la plasticité synaptique est inhibée.Nous avons ensuite montré, par RNA-Seq que les miARNs sont différentiellement exprimés entre les structures du SN. Cette technologie nous a aussi permis de révéler la présence de nouvelles espèces de miARNs. De plus les résultats suggèrent que l’expression des miARNs (connus et nouveaux) participe à la signature transcriptomique singulière de chacune des structures.Dans un troisième temps, notre travail montre que les miARNs peuvent être échangés entre les cellules du système nerveux via les vésicules extracellulaires (EVs). Le contenu des EVs en miARNs varie en fonction de l’activité neuronale, et ces derniers ont pour cibles prédictives des protéines impliquées dans la régulation de la plasticité neuronale. Nos résultats suggèrent donc que l’échange de miARNs via les EVs est un nouveau mécanisme de modulation de la plasticité neuronale.Enfin, nous proposons un nouvel outil de purification des EVs, qui à l’avenir permettrait de purifier les EVs du SNC selon leur origine cellulaire.Pour conclure, ce travail apporte une meilleure compréhension du rôle des miARNs dans la régulation de la physiologie du SNC. / This work consists in stuying the expression, the role and the transport of microRNAs (miRNAs) in the central nervous system (CNS). microRNAs (miRNAs) are small endogenous non coding RNAs, exerting a negative regulation on gene expression.They inhibit protein translation by hybridization on the 3’ untranslated region of mRNA.First, we have revealed the specific role of miR-92a in the control of the expressionof GluA1, in an homeostatic plasticity paradigm in which the synaptic plasticity is inhibited.Second, by using RNA-Seq technology, we showed that miRNAs are differentially expressed in the different structures of the CNS. Moreover, we have discovered new species of miRNAs. Finally, our results suggest that the miRNA expression (of known and new miRNAs) participate in the singular transcriptomique signature of each structure.Third, we have shown that miRNAs are transported into EVs, and can be exchanged between the cells of the CNS. The miRNA content of EVs varies depending on neuronal activity. Target prediction of these miRNAs includes genes involved in the regulation of neuronal plasticity. Together, our results suggest that the exchange of miRNAs through EVs is a new mechanism involved in the modulation of neuronal plasticity. Finally, we propose a new tool for purifiying EVs depending on their cellular origin.To conclude, this study allows a better understanding of the role of miRNAs in the regulation of the physiology of the CNS.

Os elementos genéticos móveis (mobile genetic elements MGEs), são elementos extremamente importantes para plasticidade e evolução dos genomas. Uma das classes mais importantes de MGEs são as sequências de inserção (insertion sequences - IS). Estes elementos são encontrados em bactérias e archaea e apresentam grande diversidade de famílias e mecanismos de movimentação. Uma família interessante de IS é IS200/605, esta família encontra-se distribuída em bactérias, archaea e vírus e utiliza substratos de DNA de fita simples para seu processo de transposição. Neste trabalho, através da análise de dados públicos de transcritoma identificamos RNAs sobrepostos ao 3\' de genes tnpB de IS200/605 em archaea e bactérias, estes transcritos foram chamados de sense overlapping transcripts (sotRNAs). As extremidades 5\' e 3\' dos sotRNAs foram mapeadas através de dados de RNA-seq de pequenos RNAs (sRNA-seq) e validadas através da técnica de C-RACE. Análises de sequência e estrutura secundária demonstraram que estes RNAs apresentam um motivo conservado chamado de RE-like. Utilizando a sequência consenso deste motivo pudemos identificar RNAs intergênicos derivados de IS200/605 em H. salinarum NRC-1. Para caracterização funcional, construímos linhagens superexpressando os RNAs VNG_sot0042 e VNG_R0052, ambos contendo o motivo RE-like. Curvas de crescimento, utilizando as linhagens construídas demonstraram que a superexpressão destes RNAs aumenta o crescimento de H. salinarum demonstrando sua funcionalidade. Devido a presença do motivo RE-like, extremidades 5\' e 3\' determinadas e fenótipo visualizado em curva de crescimento padrão, o sotRNA VNG_sot0042 foi estudado mais a fundo. Realizamos experimentos de RNA-seq para avaliar o impacto desta superexpressão no transcritoma de H. salinarum NRC-1, assim como experimentos de SILAC para identificação de proteínas parceiras em larga escala. Nestes ensaios identificamos proteínas e genes associados ao processo de adesão, geração de células persistentes e resistência a metais pesados. Ensaios de adesão e sobrevivência a metais pesados demonstraram que a linhagem de superexpressão apresenta maior capacidade de aderir a vidro e maior sobrevivência em diversas condições de estresse. Deste modo, podemos sugerir que ncRNAs derivados de IS200/605 são importantes moléculas regulatórias em H. salinarum NRC-1 e nos ajudam a compreender a manutenção de IS200/605 e seus derivados nos genomas de procariotos. / Mobile genetic elements (MGEs) are extremely important for plasticity and evolution of genomes. Their impacts are diverse and could be related to antibiotic resistence or symbiosis. One of the most important class of MGEs are insertion sequences (ISs). These elements are found widespread throughout bacteria and archaea, presenting a great diversity of families. An interesting family is the IS200/605, this family is found widespread in bacteria, archaea and viruses and is divided in three subgroups according to it\'s genetic composition: IS200 with tnpA gene alone, IS605 with tnpA and tnpB and IS1341 with tnpB only. Another interesting aspect is the utilization of single-stranded DNA as a substrate during the transposition process. In this work, through the analysis of public available transcriptomic data we identified transcripts that overlaps the 3\' end of tnpB in IS200/605 in both bacteria and archaea. These transcripts were named sense overlapping transcripts (sotRNAs). Sequence and secondary structure analysis showed a conserved motif present in sotRNAs, the RE-like motif. Using the consensus sequence of this motif we identified novel intergenic ncRNAs containing this motif that are derived from IS200/605. For functional characterization we overexpressed a sotRNA (VNG_sot0042) and a intergenic (VNG_R0052), both containing the RE-like motif. Standard growth curves demonstrated that the overexpression of these ncRNAs improve H. salinarum growth showing that this RNA is functional. To further evaluate the impact of the overexpressions we prepared RNA-seq libraries of the strain overexpressing VNG_sot0042 and in parallel performed SILAC experiments to identify potential protein-RNA interaction partners. Differentially regulated genes and interacting proteins associated with adhesion and persistent cells generation were found. Adhesion and survival assays showed that the lineage overexpressing VNG_sot0042 has a better capability to adhere in glass surfaces and survive more in diverse stressful conditions.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é o principal produtor de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas utilizadas para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Para que o custo de produção de etanol de segunda geração (2G), em escala industrial, seja competitivo, uma mistura eficiente de enzimas hidrolíticas é necessária para degradar a biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos de enzimas de interesse biotecnológico, o presente trabalho se propôs a analisar o perfil global do transcriptoma de T. reesei em presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono, a fim de prover um melhor entendimento de como essas enzimas são produzidas por esse microrganismo. Para isso, foi utilizada a abordagem RNA-seq e duas linhagens de T. reesei: QM9414 (parental) e xyr1 (mutante). No Capítulo I, foram anlisados 22 genes que codificam celulases e xilanases, com o intuito de verificar a regulação da expressão gênica pelo fator de transcrição XYR1 em diferentes fontes de carbono. Foi observada uma dependência da fonte de carbono e redução da expressão destes genes que codificam celulases e xilanases quando se comparou a linhagem mutante com a parental, cultivados na presença de celulose e soforose. Na presença de glicose, a maior parte dos genes analisados apresentou aumento de expressão no mutante xyr1. Por meio de análises in silico foi identificado o elemento regulatório cis para o fator de transcrição XYR1 usando quatro conjuntos de dados de genes dependente-condição envolvendo os experimentos RNA-seq e qPCR-TR. Foram identificados dois motivos com o consenso de ligação proposto para o regulador XYR1 (nomeado PWMXYR1). Ao usar esses motivos identificados, foi analisada a presença e disposição dos putativos elementos regulatórios cis nesses conjuntos de dados, sendo que sítios com intervalos curtos foram mais associados a promotores dependentes de XYR1 do que sítios simples. Além disso, a abordagem utilizada permitiu a identificação de sítios de ligação XYR1, na região promotora dos genes cel7a e xyn1 e mapear a potencial sequência alvo do regulador na região promotora do gene cel6a. Adicionalmente, sete outros promotores (genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 e swo) apresentaram sítios de ligação putativos de XYR1. Usando a arquitetura do regulador PWMXYR1, foram identificados potenciais genes alvos de regulação direta por XYR1 no genoma de T. reesei. O mapeamento do referido sítio foi realizado, também, nos genes diferencialmente expressos na linhagem mutante xyr1, destacando que a regulação indireta desempenha um papel fundamental nas vias de sinalização. Estes resultados fornecem novas informações sobre os mecanismos de sinalização mediados por XYR1 na regulação de promotores de celulases. No Capítulo II, foi analisado o transcriptoma global da linhagem parental (QM9414) em diferentes fontes de carbono: celulose; soforose e glicose. Aplicando limites rigorosos de corte, 2060 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma das fontes de carbono analisadas. Clusterização hierárquica desses genes diferencialmente expressos identificaram-se três possíveis regulons, representando 123 genes controlados por celulose, 154 genes controlados por soforose e 402 genes controlados por glicose. A análise da rede regulatória demonstrou a inter-relação existente entre as condições, permitindo a identicação de 75 genes específicos do crescimento em soforose e 107 de celulose. Esses resultados revelaram novos genes envolvidos na degradação da celulose, tais como: proteínas acessórias, transportadores, fatores de transcrição e CAZymes que respondem especificamente a presença de celulose ou soforose. No Capítulo III, analisou-se o perfil transcricional da linhagem mutante xyr1 comparando com a linhagem parental (QM9414), na presença das três fontes de carbono. As análises de expressão gênica revelaram que 2185 genes foram diferencialmente expressos na condição celulose, 2124 genes na condição soforose e 46 genes em glicose. Esses genes foram utilizados para analisar a inter-relação existente entre as condições, com destaque para grande número de genes exclusivos nas condições de indução (celulose e soforose). Por meio da clusterização hierárquica foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados e 3 regulons por genes down-regulados. Na ausência do regulador XYR1, a expressão de genes CAZys, fatores de transcrição, transportadores, entre outros, foram afetadas de modo dependente da fonte de carbono. Essas análises permitiram verificar que o fator de transcrição XYR1 é fundamental no processo de indução de enzimas de interesse biotecnológico, além de participar de outros processos bioquímicos/moleculares. Desse modo, todos os resultados obtidos fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica durante a adaptação de T. reesei frente a diferentes condições ambientais como: diferentes fontes de carbono e necessidades nutricionais. Contribuindo, assim, para uma melhor caracterização desse fungo filamentoso em relação à produção de enzimas e o desenvolvimento de mutantes metabólicos para utilização industrial. / The filamentous fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is a major producer of cellulolytic enzymes used for biofuels production from lignocellulosic biomass. In order to achieve a low cost second generation ethanol production in industrial scale, an efficient mix of hydrolytic enzymes are required for the degradation of plant biomass into fermentable sugars. Given the growing demand for development of processes in order to reduce the cost of enzymes production, the present work proposes a large-scale transcriptomic analysis of T. reesei in presence of cellulose, sophorose, and glucose as carbon sources, in order to provide insights about the mechanisms of enzymes production by this microorganism. For this purpose, RNA-seq approach was employed, as well, as two T. reesei strains: QM9414 (parental) and xyr1 (mutant). In Chapter I, 22 genes encoding cellulases and xylanases were analyzed regarding the regulation through the transcription factor XYR1. This regulation seems to occur in a carbon source dependence manner, and the expression of cellulases and xylanases was diminished in the mutant strain compared to the parental strain in the presence of cellulose and sophorose. In glucose, most of the analyzed genes showed higher expression in the mutant compared to the parental strain. In silico analysis identified a cis regulatory element for XYR1 using four datasets of condition-dependent genes based on RNA-seq and qPCR experiments. Two binding motifs have been identified with the proposed consensus for the XYR1 (named PWMXYR1). Using these motifs, the presence and arrangement of putative cis regulatory elements was analyzed, and the results indicate that the sites with short intervals were stronger associated with XYR1 dependent promoters than single sites, even with high scores. Moreover, this approach allowed the identification of XYR1 binding sites in the promoter region of cel7a and xyn1, as well as, map the potential target sequence in the promoter of cel6a gene. In addition, seven other promoters from genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 and swo presented XYR1 putative binding sites. Using the cis-regulatory architecture of PWMXYR1, potential targets for direct regulation by XYR1were identified in a genome wide manner. The putative binding sites were also mapped in the differentially expressed genes identified in the mutant strain xyr1, suggesting that indirect regulation plays a key role in signaling pathways. Taken together, the data provided here provides important information regarding signaling mechanisms mediated by XYR1 in the regulation of cellulases promoters. In Chapter II, the transcriptome of the parental strain (QM9414) was analyzed in three carbon sources, cellulose, sophorose and glucose. By applying a stringent cut-off threshold, 2,060 genes were identified as differentially expressed in at least one of the carbon sources analyzed. Hierarchical clustering of differentially expressed genes identified three possible regulons, representing 123 genes controlled by cellulose, 154 genes controlled by sophorose and 402 genes controlled by glucose. The analysis of the regulatory network demonstrated the interrelation between the conditions, allowing the identification of 75 genes specifically expressed in soforose and 107 in cellulose. These results revealed new players involved in cellulose degradation, such as accessory proteins, transporters, transcription factors and CAZymes, that specifically respond to the presence of either cellulose or sophorose. In Chapter III, a genome wide comparative transcriptional analysis were performed between the mutant xyr1 strain and the parental strain (QM9414) using the three carbon sources. Gene expression analysis revealed 2,185 genes differentially expressed in cellulose, 2124 genes in sophorose and 46 genes in glucose. These differentially expressed genes were used to analyze the relationship between the conditions, revealing a greater number of exclusive genes in theinducing conditions (cellulose and sophorose). The hierarchical clustering analysis revealed 6 possible regulons, being three composed by up-regulated genes and 3 regulons composed by down-regulated genes. In the absence of the regulator XYR1, the expression of CAZy genes, transcription factors among other genes were affected in a carbon-dependent manner. These analyses showed that the transcription factor XYR1 has an essential role in induction of enzymes of biotechnological interest and participates in other biochemical/molecular processes. Taken together these results provide important information about the molecular events, involved in gene expression regulation during T. reesei adaptation to different environments such as: carbon sources and/or nutritional needs, thus contributing to a better understanding of this filamentous fungus regarding the the production of enzymes and the development of mutants for industrial applications.

O objetivo deste trabalho foi estudar o transcriptoma do músculo Longissimus dorsi (LD) de bovinos da raça Nelore associado as características de área de olho de lombo (AOL) e espessura de gordura subcutânea (EGS), a fim de encontrar genes diferencialmente expressos (GDE), conjuntos de genes co-expressos, vias metabólicas e processos biológicos que regulam essas características. Foram utilizados dados de 385 bovinos Nelore castrados para obtenção das medidas fenotípicas de AOL e EGS, mensuradas entre a 12ª e 13ª costelas do músculo LD. Estes animais foram separados em dois grupos extremos, alto e baixo, contendo seis animais cada, baseados nos valores genômicos estimados (GEBV), para AOL e para EGS. Estes conjuntos de 12 animais foram submetidos à análise de expressão diferencial afim de encontrar GDE entre os grupos. Em seguida, a análise de enriquecimento funcional a partir da lista de GDE foi executada por meio do DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) e da combinação do BiNGO (Biological Networks Gene Ontology) e REVIGO (Reduce + Visualise Gene Ontology). Para AOL, foram identificados 101 GDE entre os grupos de alto e baixo GEBV. Desses, 72 genes apresentaram-se down-regulated e 29 up-regulated no grupo baixo. Para EGS, foram encontrados 18 GDE, dos quais treze apresentaram-se up-regulated e cinco down-regulated no grupo baixo. Dentre as vias metabólicas e processos biológicos encontrados para essas características, destacam-se a via de sinalização MAPK (bta04010) e a via da endocitose (bta04144) - AOL - e, os processos de biossíntese de andrógenos (GO:0006702) e via de sinalização canônica Wnt (GO:0060070) - EGS. Para encontrar conjuntos de genes co-expressos associados aos tratamentos (AOL e EGS), foi utilizado o pacote WGCNA (Weighted Correlation Network Analysis) do R, com dados de contagens de transcritos de 43 animais. Foram identificados 37 módulos, dentre eles, os módulos Azul, Verde-escuro e Salmon apresentaram correlação significativa de 0,3 com a EGS (P<0,10). Os genes destes módulos foram selecionados para análise de enriquecimento funcional quando seus valores de filiação ao módulo foram superiores a 0,7. O módulo azul apresentou o maior número de genes co-expressos, com 953 genes submetidos à análise de enriquecimento funcional. Foram encontradas seis vias metabólicas e 101 termos do Gene Ontology para este módulo, conforme análise do DAVID, além de 108 processos biológicos identificados pelo BiNGO/REVIGO. Os resultados do presente estudo enfatizam a complexidade da regulação gênica do músculo LD de bovinos Nelore associado às características de AOL e EGS. Estes resultados nos auxiliam a compreender melhor os diversos processos moleculares envolvidos na deposição muscular e de gordura de cobertura, características de carcaça economicamente importantes para a produção da carne bovina. / The aim of this work was to study the Longissimus dorsi (LD) muscle transcriptome of Nellore cattle associated with ribeye area (REA) and backfat thickness (BFT) to find differentially expressed genes (DEG), coexpressed gene modules, metabolic pathways, and biological processes that regulate these traits. Data from 385 Nellore steers were used to obtain the phenotypic measures of REA and BFT, measured between the 12th and 13th ribs of the LD muscle. These animals were divided into two extreme groups, high and low, with six animals each, based on the estimated genomic breeding values (GEBV) for REA and for BFT. These sets of 12 animals were submitted to differentially expressed gene analysis to find DEG between the groups. Then, the functional enrichment analysis from the list of DEG was performed by DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) and the combination of BiNGO (Biological Networks Gene Ontology) and REVIGO (Reduce + Visualize Gene Ontology). For REA, 101 DEG were identified between the high and low GEBV groups. Of those, 72 genes were down-regulated and 29 up-regulated in the low group. For BFT, 18 DEG were found, of which thirteen were up-regulated and five were down-regulated in the low group. Among the metabolic pathways and biological processes found for these traits, the MAPK signaling pathway (bta04010) and the endocytosis pathway (bta04144) - for REA -, the androgen biosynthetic processes (GO: 0006702) and the canonical Wnt signaling pathway (GO: 0060070) - for EGS - can be highlighted. To find coexpressed gene modules associated with the traits (REA and BFT), we used the WGCNA (Weighted Correlation Network Analysis) package from R, with data from transcript counts of 43 animals. A total of 37 modules were founded. Among them, the Blue, Dark Green and Salmon modules had a significant correlation of 0.3 with BFT (P<0.10). The genes of these modules were selected for functional enrichment analysis when their module membership values were higher than 0.7. The blue module had the highest number of co-expressed genes, with 953 genes submitted to functional enrichment analysis. Six metabolic pathways and 101 Gene Oontology terms were founded for this module by DAVID analysis, in addition, 108 biological processes were identified by BiNGO/REVIGO. The results of the present study emphasize the complexity of gene regulation in the LD muscle of Nellore cattle associated with REA and BFT. These results can help us to better understand the different molecular processes involved in muscle and fat deposition, which are economically important carcass traits for beef production.

O eucalipto (Eucalyptus spp.) é a arbórea comercial mais importante do Brasil, tendo um papel marcante na indústria de papel e celulose. O aumento no rendimento da extração da polpa celulósica e a redução nos custos de produção são os principais objetivos dos programas de melhoramento genético de eucalipto. Como o processo de deslignificação é fundamental para a extração da celulose, é suma importante compreender a biossíntese e deposição da parede celular secundária durante a xilogênese. A diferenciação dos elementos traqueais é caracterizada pela deposição da parede celular secundária, logo estudos de expressão gênica envolvendo essas células xilemáticas é uma estratégia interessante. Foi realizado o sequenciamento do transcriptoma de células em suspensão em diferentes fases de desenvolvimento (células meristemáticas, células alongadas e elementos traqueais) gerando 348 milhões de leituras paired-end com 100 pb cada uma, com a maioria das leituras (80 %) alinhada e mapeada contra genoma de referência. A análise dos genes diferencialmente expressos (GDEs) identificou um total de 3426, 1044 e 4665 GDEs nas comparações M vs. A, A vs. T e M vs. T, respectivamente. Sendo 1316, 567, 2637 genes up-regulated e 2110, 476, 2028 genes down-regulated nas comparações M/A, T/A, T/M, respectivamente. Um total de 4229 genes foram anotados funcionalmente e mapeados em 310 rotas identificadas pelo KEGG, obtendo-se 40 sequências relacionadas à rota dos fenilpropanoides, a quinta rota mais representativa. Quando foram considerados os GDEs com log2 fold change ≤ -1,5 e log2 fold change ≥ 1,5, 34 rotas metabólicas foram identificadas, destas, a principal foi a rota dos fenilpropanoides, com 14 sequências relacionadas a enzima lactoperoxidase. Foi realizado o enriquecimento dos termos GO e nas redes a biossíntese de celulose e xiloglucanos, rotas de sinalização de etileno, rotas de biogênese e organização da parede celular vegetal e de morte celular, entre outras, foram destaque. Identificaram-se 31 fatores de transcrição, sendo 3 fatores de transcrição MYB, 2 fatores de transcrição NAC e 10 fatores de transcrição WRKY. Além disso, 21, 7 e 23 genes da rota da celulose e hemiceluloses e 24, 8 e 21 genes da rota de síntese dos monômeros da lignina foram constatados nas comparações M vs. A, A vs. T e M vs. T, respectivamente. Assim como, foram encontrados genes codificadores de lacases e peroxidases, participantes da polimerização dos monômeros da lignina. Os resultados possibilitaram uma compreensão mais ampla da regulação transcricional da biossíntese da parede celular secundária nas células xilemáticas de eucalipto e revelou novos genes participantes da xilogênese. Este conjunto de dados transcricionais ajudará na realização de manipulações genéticas visando à obtenção de plantas de eucalipto com características de extratibilidade aspiradas pela indústria. / Eucalyptus (Eucalyptus spp.) is the most important commercial tree in Brazil, playing a significant role in the pulp and paper industry. An increase in the yield of cellulosic pulp extraction and a reduction of production cost are the main objectives of the eucalyptus breeding programs. As the delignification process is fundamental for the extraction of cellulose, it is highly important to understand the biosynthesis and deposition of the secondary cell wall during xylogenesis. The differentiation of the tracheary elements is characterized by the deposition of the secondary cell wall, so studies of gene expression involving these xylem cells is an interesting strategy. Sequencing of the transcriptome of cells in suspension at different stages of development (meristematic cells, elongated cells and tracheal elements) was performed generating 348 million paired-end reads with 100 bp each, with most readings (80%) aligned and mapped against reference genome. The analysis of differentially expressed genes (DEG) identified a total of 3426, 1044 and 4665 DEGs in the comparisons M vs. A, A vs. T and M vs. T, respectively. Being 1316, 567, 2637 up-regulated genes and 2110, 476, 2028 down-regulated genes in the M/A, T/A, T/M, respectively. A total of 4229 genes were functionally annotated and mapped in 310 routes identified by the KEGG, yielding 40 sequences related to the phenylpropanoid route, the fifth most representative route. When DEGs with log2 fold change ≤ - 1.5 e log2 fold change ≥ 1.5 were considered, 34 metabolic routes were identified. From these, the main route was the phenylpropanoids pathway, with 14 sequences correlated to the enzyme lactoperoxidase. The GO terms enrichment was carried out and the networks of cellulose and xyloglucans biosynthesis, ethylene signaling routes, biogenesis routes and the plant cell wall organization and cell death, among others, were highlighted. Thirty-one transcription factors were identified, being 3 MYB transcription factors, 2 NAC transcription factors and 10 WRKY transcription factors. In addition, 21, 7 and 23 genes of the cellulose and hemicelluloses pathway and 24, 8 and 21 genes of lignin monomer synthesis route were found in the M vs. A, A vs. T and M vs. T comparisons, respectively. Besides this, encoding genes laccases and peroxidases were found, participating in the polymerization of lignin monomers. The results allowed a broader understanding of the transcriptional regulation of secondary cell wall biosynthesis in eucalyptus xylem cells and revealed new genes participating in xylogenesis. This set of transcriptional data will help in the accomplishment of genetic manipulations in order to obtain eucalyptus plants with extractability characteristics aspired by the industry.

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Liana Jank / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo-Silva_Guilherme_D.pdf: 25638879 bytes, checksum: 40fca686426836cea01016a242b64c84 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: No Brasil, a pecuária bovina é baseada principalmente na utilização de pastagens cultivadas para alimentação animal. A espécie Panicum maximum Jacq., popularmente conhecida no Brasil como capim colonião, encontra-se entre as espécies mais utilizadas na alimentação do gado de corte. Grande parte das áreas destinadas a pastagens encontra-se estabelecida com cultivares exóticas e de reprodução clonal. O monocultivo representa sério risco para todos os sistemas de produção baseados no uso de pastagens. Nesse sentido, o melhoramento genético de forrageiras e o lançamento de novas cultivares de P. maximum surgem como alternativa para a diversificação das pastagens. O presente trabalho teve como objetivo principal contribuir para o conhecimento básico sobre a genética e a biologia molecular de P. maximum. Primeiramente, foi realizada a montagem de novo e análise do transcriptoma da espécie utilizando a metodologia de sequenciamento massivo paralelo de cDNA (RNA-seq), resultando em 38.192 unigenes, os quais foram anotados em diferentes bancos de dados. A maioria dos genes relacionados as vias de fixação de carbono C4 e de síntese de lignocelulose foram identificados. Ainda, foram identificados 5.035 marcadores microssatélites (SSR) e 346.456 marcadores do tipo single nucleotide polymorphism (SNP) em todo o transcriptoma. Na segunda parte deste trabalho, foram desenvolvidos 131 novos marcadores moleculares do tipo microssatélite para P. maximum. Estes marcadores foram utilizados juntamente a 43 marcadores SSR obtidos da literatura, para construção de mapas genético-moleculares, através da genotipagem dos híbridos F1 resultantes de cruzamento intraespecífico. Os mapas de ligação cobriram 672,2 cM e 802,2 cM dos genomas dos genitores S10 e Mombaça. Estes resultados contribuem para a pesquisa associada a P. maximum e forrageiras tropicais, assim como para os programas de melhoramento genético / Abstract: In Brazil, livestock feeding is mainly based on cultivated pastures. Panicum maximum Jacq., also known as capim-colonião, figures among the most cultivated tropical forage plants in brazilian pastures, which are established with exotic cultivars of clonal reproduction, leading to monoculture, and consequently offering serious risks to associated production systems. One possible solution to monoculture falls on new cultivars releases, throught breeding programs, diversificating livestock pastures in Brazil. The work presented here had an objective of elucidate some basic aspects regarding the genetics and molecular biology of P. maximum. First, we conducted a de novo assembly and analysis of leaf transcriptome, throught massive parallel cDNA sequencing (RNA-seq), resulting in 38.192 unigenes, which were annotated in different databases. Genes related to C4 metabolism and lignocellulose synthesis are valuable resource to breeding programs and were identified among assembled transcripts. Thus, several putative molecular markers were located in unigenes: 5.035 microsatellites (SSR) motifs and 346.456 single nucleotide polymorphism (SNP) positions. Also, we developed 131 new genomic and expressed SSR markers for P. maximum. These markers were used with 43 published SSR markers to develop a genetic map. A segregating F1 population were used for such, hybrids of S10 (sexual genotype) and Mombaça (apomictic genotype) crossing. Linkage maps covered 672,2 cM and 802,2 cM of parentals genomes respectively, using 88 and 96 markers each. Results presented in this work contributes to P. maximum and tropical grasses related research and breeding programs / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Antonio Augusto Franco Garcia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:06:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantello_CamilaCampos_D.pdf: 14575904 bytes, checksum: 3588e88f982780fe09718e2b837d7824 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Aproximadamente 2.500 espécies são conhecidas por produzirem borracha natural e a seringueira, [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell-Arg.], espécie nativa da Amazônia e pertencente ao gênero Hevea, é a maior fonte de borracha natural do mundo. A borracha natural é matéria prima para fabricação de mais de 40.000 produtos tendo importância fundamental na indústria de pneus. Apesar de a região Amazônica oferecer condições climáticas adequadas para seu crescimento e desenvolvimento, esta área também possui condições favoráveis à ocorrência do mal-das-folhas (Microcyclus ulei P. Henn v. Arx), doença também conhecida como mal sulamericano das folhas (South American Leaf Bligth ¿ SALB). Dessa maneira, a heveicultura se expandiu para áreas de escape que propiciam novas condições de estresse, limitando o seu crescimento e a produção de látex. O melhoramento genético vem buscando cultivares adaptados a estas regiões de escape, porém o ciclo de melhoramento da seringueira é longo e não permite o rápido desenvolvimento de novos cultivares. O desenvolvimento de ferramentas na biologia molecular permite o melhor entendimento da espécie e pode diminuir o tempo gasto nos ensaios de campo. O presente trabalho desenvolveu novos marcadores microssatélites (SSRs) a partir de bibliotecas enriquecidas em microssatélites. A caracterização destes marcadores mostrou a alta variabilidade alélica dentro de H. brasiliensis e o teste de transferibilidade dos SSRs em outras seis espécies do gênero Hevea mostrou alelos exclusivos para as mesmas e taxas de amplificação superior a 80%. Com o objetivo desenvolver novos marcadores SSRs e single nucleotide polymorphisms (SNPs) em larga escala, foi sequenciado na plataforma Illumina GAIIx o transcriptoma de painel de dois cultivares importantes para a heveicultura (GT1 e PR255). A montagem e a caracterização do transcriptoma permitiu o melhor entendimento da dinâmica do transcriptoma em H. brasiliensis e identificou novos transcritos para a espécie. As sequências do transcriptoma foram submetidas à busca de SSRs e SNPs. No transcriptoma, foram identificados 1.709 novas sequências contendo SSRs para seringueira, a uma frequência de um SSR a cada 2,8 kb. Já a busca de SNPs identificou 404.114 SNPs com frequência de um SNP a cada 125 pb. Através da anotação no Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), foram identificadas sequências anotadas a todas as enzimas referentes às duas vias de síntese de látex (mevalonato - MVA e C-metileritritol 4-fosfato -MEP). Apesar de as vias MVA e MEP serem muitos estudadas, esta foi a primeira vez que SNPs foram identificados e validados. Os marcadores SSRs e SNPs foram então mapeados em uma população segregante F1. O mapa genético obtido contém 383 marcadores mapeados em 20 grupos de ligação. Neste trabalho foram desenvolvidos 52 SSRs e 51 SNPs do total de marcadores mapeados. Como o número de grupos de ligação esperado é 18 (2n=36), conclui-se que o mapa genético obtido mostra que ainda há uma cobertura incompleta do genoma. Devido à alta frequência de SNPs no genoma, o desenvolvimento de novos marcadores poderá saturar o mapa de forma homogênea, permitindo o agrupamento dos marcadores nos 18 grupos de ligação esperados / Abstract: Approximately 2.500 species are known to produce natural rubber. Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell-Arg. also known as rubber tree is a species native to the Amazon rainforest and is the largest source of natural rubber in the world. Natural rubber has been used in more than 40,000 products and has great importance in the tire industry. Although the Amazon rainforest offers optimal conditions for growth and rubber yields due to its warm and humid climate, this region also provides optimal conditions for the fungus Microcyclus ulei P. Henn v. Arx which causes the South American Leaf Blight (SALB) disease. Thus, rubber tree plantations have expanded to escape areas that provides new stress conditions limiting their growth and latex production. The rubber tree breeding is trying to create a new cultivar that is resistant to these new conditions but the rubber tree cycle breeding is long and does not allow a rapid cultivar development. Thus, molecular biology techniques could provide a greater knowledge of H. brasiliensis genetic and could optimize field evaluation and, thus, reduce the time and area required for experiments. The present work developed new microsatellites (SSRs) markers for rubber tree from genomic enriched libraries. The new microsatellites were characterized and demonstrated a high allelic variability within H. brasiliensis genotypes. The transferability rate in other six species of the genus Hevea was greater than 80%. To develop new SSRs and single nucleotide polymorphisms (SNPs) markers, the panel transcriptome from two important cultivars (GT1 and PR255) was sequenced in Illumina GAIIx platform. The transcriptome obtained allowed a better knowledge about H. brasiliensis transcriptome and identified new transcripts for rubber tree public database. The sequences were submitted to a SSR and SNP search. The SSR frequency was one SSR each 2.8 kb and it was identified 1.709 new sequences with new SSRs for rubber tree database. A total of 404.114 putative SNPs were detected with a frequency of one SNP every 125 bp. Through Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) annotation, it was identified contigs corresponding to all the enzymes of mevalonate (MVA) and -C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP). Despite MVA and MEP pathways are being very well studied, since they are directly involved to rubber biosynthesis, this is the first time that molecular markers have been developed for such important pathways. The SSRs and SNPs developed were mapped in a full-sib population. The genetic linkage map has 383 molecular markers distributed in 20 linkage groups. This project contributed with 52 SSRs and 51 SNPs of the total mapped markers. Although the expected number of linkage groups are 18 (2n=36), the new genetic linkage map still has an incomplete coverage of the genome. Due to the high frequency of the SNPs in the genome, the development of new markers can saturate this map homogeneously / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_PauloJosePereiraLima_D.pdf: 96794209 bytes, checksum: ecb31f47caf999afd03d8b9da31315f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cacaueiro se destaca como uma das principais culturas perenes na agricultura, sendo economicamente relevante por fornecer a matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto que movimenta bilhões de dólares no mercado mundial a cada ano. Apesar de sua importância, o cacaueiro é drasticamente atacado por diversas doenças que diminuem sua produtividade e reduzem a qualidade das amêndoas do cacau. Dentre estas, a vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, é um importante fator limitante da produção cacaueira nas Américas. Utilizando tecnologias de sequenciamento de DNA de nova geração, realizamos uma abrangente análise transcriptômica da vassoura de bruxa neste trabalho. Um banco de dados denominado Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa foi construído, o qual compreende aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq representativas dos mais variados estágios de desenvolvimento, condições de crescimento e respostas a estresse do fungo M. perniciosa sob condições in vitro e in planta. O primeiro capítulo desta tese apresenta uma análise global do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa. Este conjunto de dados tem suportado uma série de estudos específicos relacionados a variados aspectos da doença, os quais são apresentados e detalhados nos demais capítulos da tese. Notavelmente, uma análise detalhada da interação biotrófica entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa (Capítulo II) revelou a ocorrência de intensa reprogramação transcricional e importantes alterações fisiológicas em plantas infectadas, incluindo a ativação de respostas de defesa ineficientes e a ocorrência de privação de carbono. Curiosamente, um processo de senescência prematura se estabelece no tecido infectado e parece ser um evento central no desenvolvimento da doença, possivelmente disparando o início da fase necrotrófica desta interação planta-patógeno. Ainda, nossos dados também permitiram a identificação de potenciais efetores de virulência em M. perniciosa, como também a caracterização do status metabólico do fungo durante a infecção do cacaueiro. Um modelo detalhado que sumariza os aspectos moleculares da vassoura de bruxa foi elaborado. De maneira geral, o Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa representa um importante avanço no estudo desta doença e tem servido como ponto de partida para uma série de estudos adicionais. A utilização destes dados na identificação e caracterização de potenciais fatores de patogenicidade de M. perniciosa (Capítulos III, IV e VI) e de mecanismos de defesa do cacaueiro (Capítulo V) também é apresentada nesta tese / Abstract: Cacao stands out as one of the major perennial crops in the world, being economically relevant as the source of chocolate, a multi-billion dollar product appreciated worldwide. Despite its importance, cacao is seriously affected by several diseases that reduce crop yield and decrease the quality of cocoa beans. Among them, the witches' broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, is a major constraint for cacao production in the Americas. Using next generation sequencing technologies, a comprehensive transcriptomic analysis of WBD was performed. We developed a database named "WBD Transcriptome Atlas", which comprises approximately 60 RNA-seq libraries that represent a wide range of developmental stages, growth conditions and stress responses of the fungus, either under in vitro or in planta conditions. The first chapter of this thesis presents a global analysis of the WBD Transcriptome Atlas. This data set has supported a number of specific analyses related to several aspects of WBD, which are presented and detailed in the other chapters of the thesis. Strikingly, a detailed analysis of the biotrophic interaction between M. perniciosa and cacao (Chapter I) revealed the occurrence of intense transcriptional reprogramming and remarkable physiological alterations in infected plants, including the activation of ineffective defense responses and the occurrence of carbon deprivation. Curiously, a premature senescence process is established in infected tissues and appears to be a central event in WBD, possibly triggering the onset of the necrotrophic stage of this plant-pathogen interaction. Additionally, our data also allowed the identification of potential virulence effectors in M. perniciosa, as well as the characterization of the metabolic status of the fungus during cacao infection. A detailed model summarizing the molecular aspects of WBD is presented. Overall, the WBD Transcriptome Atlas represents an important advance in the study of this disease and constitutes a starting point for a number of additional studies. The use of these data in the identification and characterization of potential pathogenicity factors of M. perniciosa (Chapters III, IV and VI) and defense mechanisms of cacao (Chapter V) will also be presented in this thesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:25:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_Javier_D.pdf: 13138837 bytes, checksum: 410e11bd8ba7df37c003fae0919eec2e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A doença vassoura de bruxa do cacaueiro, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa tem sido um dos maiores problemas fitopatológicos do hemisfério sul. O fungo tem uma fase biotrófica longa, pouco comum entre fungos com o estilo de vida hemibiotrófico. Este fato sugere que M. perniciosa deve dispor de importantes mecanismos de evasão do sistema de defesa da planta e que estes teriam um papel fundamental para o sucesso da infecção. Assim sendo, o objetivo deste trabalho é entender os mecanismos de supressão envolvidos na resposta de defesa basal da planta. Especificamente, aqueles mecanismos mediados por hormônios que poderiam influenciar na suscetibilidade da planta ao patógeno durante a invasão do M. perniciosa. Com este fim, foram construídas bibliotecas de RNAseq da interação cacau-M. perniciosa durante o inicio da fase assintomática da doença. As bibliotecas representantes desta interação mostraram expressão diferencial de genes relacionados com a sinalização de auxina, mas não foi observado indução de genes da biossíntese planta. Estes dados sugerem a presença de auxina "exógena" produzida provavelmente pelo patógeno. Adicionalmente, foram encontrados genes relacionados com o ácido jasmônico e etileno. Com o intuito de identificar se M. perniciosa era capaz de secretar um composto com função de auxina, sementes de Arabidopsis thaliana foram crescidas em amostras de sobrenadante do fungo. Estes experimentos mostraram alteração da morfologia das raízes semelhantes à adição de auxina exógena. Amostras de sobrenadantes do fungo foram submetidas às técnicas de RMN, LC MS/MS e GC-MS e mostraram a presença de um composto com estrutura semelhante ao indol-3-acetoácido sendo produzido pelo fungo. Estudos do time course de produção deste composto mostraram que a auxina produzida é rapidamente metabolizada formando diferentes derivados indólicos com provável função na patogênese do fungo. Finalmente, encontramos um novo composto com estrutura parecida à auxina e capacidade de indução de genes de resposta a este hormônio. Este trabalho é o primeiro relato a mostrar o time course da síntese de auxina por M. perniciosa e a indução de respostas de sinalização de auxina nos tecidos de cacau infectados pelo fungo. A intervenção nas vias de síntese de auxina pelo fungo seria um caminho plausível na tentativa por conter a doença vassoura de bruxa / Abstract: The witches' broom disease in Cacao is caused by the fungus Moniliophthora perniciosa has been one of the most important problems phytopathological in the southern hemisphere. The fungus has an unusual long biotrophic phase with the lifestyle hemibiotrofic suggesting that M. perniciosa must have important evasion mechanisms for breaking of the plant defense system and it would have a key role to success in the infection. Therefore, the aim of this work is to understand some of the mechanisms involved in the suppression of basal defense response of the plant. Specifically, hormones-mediated mechanisms that could influence plant susceptibility to pathogens during the infection of M. perniciosa. For this purpose, RNAseq libraries were constructed of the interaction cacao - M. perniciosa during the asymptomatic phase of the disease. Genes related with the auxin and jasmonic acid signaling and ethylene production were differential expressed during the initial stage of the disease. Furthermore, auxin-responsive genes were induced, but not observed induction of plant biosynthesis genes for this hormone. These data suggest presence of auxin "exogenous" probably produced by the pathogen. In order to identify whether M. perniciosa was able to secrete a compound like an auxin, Arabidopsis thaliana seedlings were grown in mediums with supernatant of the fungus. These experiments showed alterations on the roots morphology, similar to the addition of exogenous auxin. Samples of supernatants were subjected to the techniques of NMR, LC-MS/MS and GCMS and showed the presence of a compound with a similar structure of Indole-3- Acetic Acid (IAA) being produced by the fungus. A time course of the production of this compound was examinated by LC-MS/MS and showed that the auxin is produced by M. perniciosa, but is rapidly metabolized forming different indole derivatives, some of them with a probable role in the pathogenesis. Finally, we found a new compound with a structure similar to auxin and with the ability to induce gene response to this hormone / Doutorado / Genetica Vegetal / Doutor em Genetica e Biologia Molecular