As proteínas são consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido à abundância em sistemas biológicos e às altas constantes de reações com estas espécies. Adicionalmente, têmse demonstrado que o triptofano (W) é um aminoácido extremamente susceptível a oxidação, inclusive pelo oxigênio singlete (1O2). A reação do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reação tem atraído mais atenção, uma vez que produtos de oxidação do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) têm sido associados com algumas condições patológicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formação de agregados covalentes da superóxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrófica. Entretanto, há poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reações, com estudos de estabilidade, identificação de subprodutos e propostas mecanísticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidação do triptofano pelo 1O2, através da análise e caracterização de produtos de oxidação gerados. Com este intuito, dois hidroperóxidos de triptofano isômeros (WOOH cis e trans, em relação ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por análises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidação do W pelo 1O2. Estes hidroperóxidos demonstraram ser relativamente estáveis às temperaturas ambiente e fisiológica, decompondo lentamente para os alcoóis correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das soluções contendo os WOOH leva a decomposição quimiluminescente dos WOOH à FMK. Utilizando hidroperóxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possível confirmar que a FMK formada durante esta decomposição era marcada com dois átomos de oxigênio. Este resultado demonstra que os dois átomos da FMK são derivados do grupamento hidroperóxido. Em adição, estas reações são quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermediário dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescência da decomposição dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescência da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espécie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisoméricas também foram caracterizadas como produtos de oxidação do triptofano pelo 102; uma possível via radicalar foi excluída. Em suma, este estudo contribuiu na elucidação das bases químicas envolvidas na oxidação do triptofano por 102, através da caracterização dos produtos formados e da investigação detalhada dos mecanismos de decomposição destes produtos. / Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydroperoxides (W18O18OH), it was possible to confirm the formation of a two-oxygen-labeled FMK molecule derived from W18O18OH decomposition. This result shows that both oxygen atoms in FMK are derived from the hydroperoxide group. In addition, these reactions are chemiluminescent (CL), indicating a dioxetane cleavage pathway. This mechanism was confirmed since the CL spectrum of the WOOH decomposition matched the FMK fluorescence spectrum, unequivocally identifying FMK as the emitting species. Diastereoisomeric dioxindoyalanine were also characterized as oxidation products derived from the reaction of W with 1O2. The involvement of radicals in this reaction was excluded. In summary, this work offers further insights into the chemistry involved in W-oxidation, through the characterization of photoproducts and the detailed investigation about the decomposition mechanism of these products.

O presente estudo teve por objetivo desenvolver metodologias para imobilização de sondas moleculares fluorescentes em matrizes de sílica de tamanho controlado, bem como estudar a interação das sondas livres e imobilizadas com oxigênio e ferro. A classe de fluoróforos escolhida foi a das porfirinas, que apresentam baixa solubilidade em água e têm seu uso limitado, apesar de apresentarem pelo menos duas propriedades interessantes: (i) interagem com oxigênio formando oxigênio singlete, sendo candidatas a drogas para terapia fotodinâmica, e (ii) têm sua fluorescência suprimida ao complexarem metais, podendo atuar como sondas fluorescentes. A imobilização de porfirinas em esferas de sílica de tamanho inferior a 100 nm foi realizada através de um processo sol-gel ou pelo uso de microemulsões. O método sol-gel exigiu a modificação prévia da molécula da porfirina com reagente organosilano e resultou em esferas na faixa de 70 nm. O método da microemulsão dispensou a modificação da porfirina e resultou em esferas na faixa de 30 nm, muito estáveis em água. Os fluoróforos imobilizados preservaram suas propriedades óticas e a sua capacidade de gerar oxigênio singlete. Os estudos envolvendo a detecção de oxigênio singlete foram realizados pelo método físico direto, a partir do registro da fosforescência característica no infravermelho-próximo, e pelo método químico indireto usando a sonda 1,3difenilisobenzofurano. O tempo de vida do oxigênio singlete obtido quando uma suspensão, em acetonitrila, de esferas de sílica carregadas com porfirinas foi excitada em 532 nm foi de 52 &#181;s e está de acordo com o valor determinado para uma solução padrão contendo azul de metileno sob as mesmas condições. As porfirinas imobilizadas em sílica apresentaram eficiência de geração de oxigênio singlete similar ou até superior ao rendimento quântico das porfirinas livres. Após estudos concluiu-se que a elevada geração de oxigênio singlete pode ser atribuída a mudanças no equilíbrio monômero-dímero após a imobilização das porfirinas na matriz de sílica. O emprego das porfirinas imobilizadas em esferas de sílica como sondas fluorescentes para detecção de ferro também foi investigado. Estudos da interação da hematoporfirina IX livre e imobilizada com ferro apresentaram sítios de forte e fraca interação de acordo com a faixa de concentração de ferro utilizada. A supressão da fluorescência da Hp IX livre e imobilizada em sílica obedece a um comportamento linear na faixa de concentração de ferro de 0 a 60 &#181;M. Portanto, a imobilização de porfirinas em nanoesferas de sílica permitiu a dispersão de porfirinas insolúveis em água e manteve as moléculas acessíveis ao oxigênio molecular e aos íons ferro, preservando suas propriedades e ampliando a possibilidade de aplicações. / The present study is focused on developing methodologies for the immobilization of fluorescent molecular probes in size controlled silica matrixes, and studying the interactions of free and entrapped molecules with molecular oxygen and iron. This study was based on porphyrins, a class of compounds with low solubility in water and limited use, but with at least two very interesting properties: (i) interaction with molecular oxygen to yield singlet oxygen, potential drug for use in photodynamic therapy; and (ii) fluorescence quenching by metal ions, potential fluorescent probe. The immobilization of porphyrins in silica spheres of size < 100 nm was achieved by the sol-gel or microemulsion approach. The sol-gel method required the modification of porphyrin molecules with an organosilane reagent and resulted in spheres of about 70 nm. The microemulsion method did not require the modification of porphyrin molecules and resulted in spheres of about 30 nm, very stable in aqueous solution. The immobilized porphyrins preserved their optical properties and the capacity to generate singlet oxygen. Singlet oxygen was detected by a direct method from its characteristic phosphorescence decay curve at near-infrared and by a chemical method using 1,3-diphenylisobenzofuran to trap singlet oxygen. The lifetime of singlet oxygen, when a suspension of porphyrin-loaded silica spheres in acetonitrile was excited at 532 nm, was determined as 52 &#181;s, which is in good agreement with the value determined for a standard methylene blue solution under the same conditions. The porphyrin-loaded silica spheres have an efficiency of singlet oxygen generation similar or even higher than the quantum yield of free porphyrins. This high efficiency of singlet oxygen generation was attributed to changes on the monomer-dimer equilibrium after photosentisizer immobilization in the silica matrix. The use of the immobilized porphyrins as fluorescent probes for iron sensing was also investigated. The interaction of free and silica immobilized hematoporphyrin IX with iron resulted in sites of strong and weak interaction according to the concentration range. The fluorescence quenching of Hp IX, free and immobilized in silica spheres follows a linear correlation with the iron concentration from 0 to 60&#181;M. In conclusion, the immobilization of porphyrins in silica nanoespheres allowed the dispersion of insoluble porphyrins in water, while preserving the accessibility to molecular oxygen and metal ions and broadening the scope of applications.

This master thesis deals with the methods of measurement of singlet oxygen steady state concentrations in surface water and the factors affecting this concentration. The first part of this work shows theoretical background and an introduction to photochemistry of surface water with respect to the reactive oxygen species. The second part describes the methodology of conducted experiments and discuss its results with respect to current literature.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um método de tratamento em que um composto fotossensibilizador (FS) é introduzido no organismo do paciente e, posteriormente, a região de tratamento é irradiada com luz. A combinação de oxigênio, luz e FS produz espécies que geram um efeito curativo. Os FS utilizados atualmente, embora eficazes, apresentam desvantagens. Neste trabalho, foram estudados os corantes ciânicos com dois cromóforos ou biscianinas (BCD) que apresentam características favoráveis na aplicação como FS na TFD. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da concentração, da composição do ambiente e da própria estrutura de três BCDs, com ângulos entre os seus cromóforos de 180°, 150° e 90°, nas características das suas fototransformações em tampão e na interação com micelas de SDS e DNA. A fototransformação pode causar a perda da fotoatividade do FS e gerar fotoprodutos (FPs) que tanto podem ser tóxicos como fotoativos. Os processos de tratamento na TFD e os de fototransformação são paralelos. Isso permite utilizar o monitoramento do processo de fototransformação para determinar o grau do processo de tratamento em tempo real. Por esse motivo, também foi estudada a fototransformação dos FPs formados durante a irradiação. A análise da fototransformação foi realizada utilizando técnicas espectroscópicas de absorção óptica e de fluorescência estática. Mudanças nos espectros de absorção óptica dos corantes indicaram a formação de agregados. A agregação diminui a velocidade de fototransformação devido ao aumento da probabilidade de dissipação da energia de excitação por processos não radiativos. Não houve formação de agregados na irradiação dos FPs, pois estes possuem menor tendência de agregação em comparação com o próprio corante. Semelhanças nos espectros dos FPs dos três corantes indicaram que eles possuem a mesma estrutura do cromóforo. Na ausência do oxigênio a velocidade de fototransformação diminui. Este fato juntamente com a relação entre os tempos da fotólise e os rendimentos quânticos do estado tripleto dos BCDs sugeriram a participação do oxigênio singleto na fototransformação. Na presença de sistemas biomiméticos em altas concentrações, os corantes estão em suas formas monoméricas. Nestas interações, os corantes também sofreram fototransformação, com velocidades diferentes daquelas em tampão, com formação de fotoprodutos. Na fototransformação dos corantes na presença de micelas de SDS, sugerimos que as moléculas dos corantes ficam mais protegidas do contato do oxigênio. Por outro lado, na interação com o DNA, as moléculas dos corantes ligadas na superfície do DNA se tornam mais suscetíveis ao ataque do oxigênio, fazendo com que a fototransformação seja mais rápida. / Photodynamic therapy (PDT) is a treatment that a photosensitizer compound (PS) is inserted into the patient\'s body and, subsequently, the treatment area is irradiated with light. The combination of oxygen, light and FS produce species that generate a curative effect. The FS currently used, although can be effective, have disadvantages. In this study, the cyanine dyes with two chromophores (BCD) or biscyanines that have favorable characteristics in the application as FS in PDT were studied. The aim of this study was to analyze the effects of concentration, environmental composition and the structure of three BCDs, with angles between chromophores 180, 150 and 90 degrees, in the characteristics of phototransformation of the dyes molecules in phosphate buffer and in the interaction with SDS micelles and DNA. The phototransformation can cause the loss of the FS photoactivity and generate photoproducts (PPs) that are both toxic as photoactive. The treatment processes in PDT and phototransformation are parallel. It allows the use of phototransformation monitoring process to determine the degree of realtime treatment process. For this reason, it was also studied the phototransformation of PPs formed during irradiation. The phototransformation analysis was performed using optical absorption and fluorescence spectroscopies. Changes in the optical absorption spectra of the dyes indicated the formation of aggregates. The aggregation reduces phototransformation rate due to the increased probability of dissipation of the excitation energy by non-radiative processes. There was no aggregate formation on irradiation of PPs because they have less tendency to aggregate compared with the dye. Similarities in the spectra of the three PPs indicated that they have the same structure of the chromophore. In the absence of oxygen phototransformation rate decreases. This fact together with the relationship between photolysis time and the quantum yields of the triplet state of the BCDs suggested the involvement of singlet oxygen in their phototransformation. The dyes were in their monomeric form at high SDS and DNA concentrations. In these interactions, the dyes also were phototransformed, with different rates compared with phosphate buffer, with formation of photoproducts. In the phototransformation of dyes in the presence of SDS micelles, we suggest that the dye molecules were more protected from oxygen contact. On the other hand, in the interaction of dyes and DNA molecules, the dye molecules bound on DNA surface become more available to oxygen attack, and the phototransformation becomes faster.

Mitocôndrias desempenham um papel central na homeostase celular. Estas organelas se diferem das demais não só por suas múltiplas funções, mas por terem seu próprio genoma, distinto do genoma nuclear. Estas organelas também participam de mecanismos de morte celular de forma central nos três mecanismos mais conhecidos: apoptose, necrose e autofagia. O mtDNA está localizado na face interna da membrana mitocondrial, onde são geradas grandes quantidades de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Em consequência, o mtDNA acumula modificações oxidativas, mesmo em condições normais de metabolismo. Entretanto as respostas celulares ao acúmulo de lesões no mtDNA ainda não são claras. Para investigarmos se lesões oxidativas no mtDNA causam morte celular, propomos um modelo no qual oxigênio singlete é gerado especificamente na mitocôndria, pela ação de fotossensibilizadores com diferentes localizações celulares (azul de metileno, AM, e cristal violeta, CV, citosólicos; Ro 19-8022, Ro, citosólico e nuclear). Mostramos, por microscopia confocal, que os corantes tem a localização esperada em células HeLa. Além disso, observamos que o AM gera oxigênio singlete proporcionalmente a concentração do corante e dose de fotoativação. Mostramos que células tratadas com os corantes diminuem a velocidade de duplicação 24 h após o tratamento, que resulta em morte celular. Para AM e Ro, estes efeitos foram proporcionais à concentração de corante e da dose de fotoativação. Por outro lado, CV apresentou uma alta toxicidade mesmo no escuro. Mostramos que as células tratadas com AM não apresentam fragmentação internucleossômica de DNA, típica de apoptose após 24 h e não apresentam quebras de fita e formação de sítios abásicos logo após o tratamento. Finalmente mostramos que células com depleção do número de cópias de mtDNA são menos sensíveis ao tratamento com AM e igualmente sensíveis ao tratamento com Ro que células HeLa normais, indicando que lesões oxidativas ao mtDNA determinam a sensibilidade celular ao AM. / Mitochondria play a central role in cell homeostasis. They differ from other subcellular structures not only due to their many functions but also because they have their own genome. Moreover, mitochondria also play a central role in cell death, in apoptosis, necrosis as well as autophagy. The mitochondrial DNA sits at the inner side of the inner mitochondrial membrane, where most of reactive oxygen species are generated, and in fact, mtDNA accumulates oxidative damage under normal physiological conditions. However, cellular responses to mtDNA damage are not clearly understood. In order to ascertain whether mtDNA damage induces cell death, we established a cellular model in which oxidative stress is induced exclusively in mitochondria, by using two photosensitizers that localize in the cytosol (methylene blue, MB and crystal violet, CV) and comparing to another one with diffuse distribution (Ro 19-8022, Ro). These molecules generate singlet oxygen locally upon photoactivation. Using confocal fluorescence microscopy we confirmed the cellular localization of the dyes, and found that. MB generates singlet oxygen in cells in a dose- and light-dependent fashion. Treatment with the dyes induced dose-dependent cell proliferation inhibition and cell death. The cytotoxic effects of MB and Ro were completely dependent on light-activation whereas CV induced cell death in the dark. We found that under these conditions, MB treatment did not induce internucleosomal DNA fragmentation or non-nucleosomic fragmentation, as we did not observe comet formation. These results indicate absence of nuclear DNA damage. On the other hand, cells depleted of mtDNA showed decreased sensitivity to MB but not to RO, indicating that mtDNA damage plays a key role in inducing cell death under these experimental conditions.

In the first part of this thesis is related to the regioselectivity in ene reaction of singlet oxygen with cyclic alkenes. The photooxygenation of 1-methyl-, 2,3-dimethyl-, 1,4-dimethylcyclohexa-1,4-dienes, 1,2,3,4,5,8-hexahydronaphthalene (16) and 2,3,4,7-tetrahydro-1H-indene (17) which are readily available through Birch reduction, yielded the ene products. The formed endocyclic dienes were trapped by the addition of singlet oxygen to give corresponding bicyclic endoperoxy-hydroperoxides. In the case of 1-methylcyclohexa-1,4-diene (13) and 1,4-dimethyl-cyclohexa-1,4-diene (15), cis-effect determined the product distribution. Photooxygenation of 2,3-dimethylcyclohexa-1,4-dienes (14) gave mainly exocyclic olefin, which was attributed to the lowered rotational barrier of the methyl group and increased reactivity of the methyl groups. Photooxygeneation of 1,2,3,4,5,8-hexahydronaphthalene (16) and 2,3,4,7-tetrahydro-1H-indene (17) shows importance of the geometry of the allylic hydrogen in the ground state. In the second part of this thesis is related to the stereoselective synthesis of carbaheptopyranose derivatives. Two new carbaheptopyranoses, 5a-carba-6-deoxy-&alpha / -DL-galacto-heptopyranose (184) and 5a-carba-6-deoxy-&alpha / -DL-gulo-heptopyranose (185) have been prepared starting from cyclohexa-1,4-diene. The addition of dichloroketene to cyclohexa-1,4-diene followed by subsequent reductive elimination and Baeyer-Villiger oxidation formed the bicyclic lactone 188. Reduction of the lactone moiety followed by acetylation gave the diacetate 182b with cis-configuration. Introduction of additional acetate functionality into the molecule was achieved by singlet oxygen ene-reaction. The formed hydroperoxide 189 was reduced and then acetylated. The double bond in triacetate was further functionalized either by direct cis-hydroxylation using OsO4 or epoxidation followed by ring-opening reaction to give the hepto-pyranose derivatives 184 and 185.

Ce travail de thèse est consacré à la synthèse de porphyrines fusionnées à des cycles imidazolium et à l’utilisation de ces derniers comme précurseurs de ligands carbènes N-hétérocycliques (NHC). Ces composés possèdent donc deux sites de coordination, interne (le macrocycle) et externe (le ligand NHC), permettant la synthèse de complexes dinucléaires. Cette étude est principalement axée sur la synthèse de métalloporphyrines conjuguées avec des complexes d’or(I) périphériques de type [(NHC)AuCl]. En vue d’application en thérapie photodynamique (PDT), la fonctionnalisation de ces complexes par des carbohydrates (mannose) a été réalisée par substitution des ligands chlorures des complexes d’or(I) périphériques. Les tests biologiques sur cultures cellulaires montrent une nette potentialisation des propriétés photodynamiques des photosensibilisateurs comportant des ligands mannoses liés à l’or(I). Suite à cette étude, la synthèse de porphyrines fusionnées à deux cycles imidazolium a été réalisée permettant pour la première fois la synthèse de complexes trinucléaires de type Au/M/Au (M = métal interne dans la porphyrine) possédant différentes géométries. Ces composés ont ouvert des perspectives intéressantes dans le but d’obtenir des photosensibilisateurs possédant deux groupements carbohydrates à leur périphérie. De plus, il a été mis en évidence que les complexes trinucléaires de type Au/Zn/Au peuvent être utilisés comme briques de construction moléculaires pour la synthèse de polymères organométalliques en vue d’applications en (photo)catalyse. / This PhD work is devoted to the synthesis of porphyrins fused to imidazolium rings and their use as precursors of N-heterocyclic carbene ligands (NHC). Therefore, these compounds possess two coordination sites, the internal (the macrocycle) and the external (the NHC ligand) ones, allowing the synthesis of dinuclear complexes. This study is mainly centered on the synthesis of metalloporphyrins conjugated with peripheral gold(I) complexes such as [(NHC)AuCl]. In view of applications in photodynamic therapy (PDT), the functionalization of these complexes by carbohydrates was achieved through the substitution of chloride ligands of peripheral gold(I) complexes. Biological tests on cell cultures show a clear potentialization of the photodynamic properties of the photosensitizers bearing mannose ligands bound to gold(I). Following this study, the synthesis of porphyrins fused to two imidazolium rings was achieved allowing for the first time the synthesis of trinuclear species such as Au/M/Au (M = inner metal in the porphyrin core) with different geometries. These compounds open interesting perspectives in view of obtaining photosensitizers having two carbohydrates at their periphery. Moreover, it was shown that trinuclear species such as Au/Zn/Au can be used as molecular building-blocks for the synthesis of organometallic polymers in view of applications in (photo)catalysis.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um método de tratamento em que um composto fotossensibilizador (FS) é introduzido no organismo do paciente e, posteriormente, a região de tratamento é irradiada com luz. A combinação de oxigênio, luz e FS produz espécies que geram um efeito curativo. Os FS utilizados atualmente, embora eficazes, apresentam desvantagens. Neste trabalho, foram estudados os corantes ciânicos com dois cromóforos ou biscianinas (BCD) que apresentam características favoráveis na aplicação como FS na TFD. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da concentração, da composição do ambiente e da própria estrutura de três BCDs, com ângulos entre os seus cromóforos de 180°, 150° e 90°, nas características das suas fototransformações em tampão e na interação com micelas de SDS e DNA. A fototransformação pode causar a perda da fotoatividade do FS e gerar fotoprodutos (FPs) que tanto podem ser tóxicos como fotoativos. Os processos de tratamento na TFD e os de fototransformação são paralelos. Isso permite utilizar o monitoramento do processo de fototransformação para determinar o grau do processo de tratamento em tempo real. Por esse motivo, também foi estudada a fototransformação dos FPs formados durante a irradiação. A análise da fototransformação foi realizada utilizando técnicas espectroscópicas de absorção óptica e de fluorescência estática. Mudanças nos espectros de absorção óptica dos corantes indicaram a formação de agregados. A agregação diminui a velocidade de fototransformação devido ao aumento da probabilidade de dissipação da energia de excitação por processos não radiativos. Não houve formação de agregados na irradiação dos FPs, pois estes possuem menor tendência de agregação em comparação com o próprio corante. Semelhanças nos espectros dos FPs dos três corantes indicaram que eles possuem a mesma estrutura do cromóforo. Na ausência do oxigênio a velocidade de fototransformação diminui. Este fato juntamente com a relação entre os tempos da fotólise e os rendimentos quânticos do estado tripleto dos BCDs sugeriram a participação do oxigênio singleto na fototransformação. Na presença de sistemas biomiméticos em altas concentrações, os corantes estão em suas formas monoméricas. Nestas interações, os corantes também sofreram fototransformação, com velocidades diferentes daquelas em tampão, com formação de fotoprodutos. Na fototransformação dos corantes na presença de micelas de SDS, sugerimos que as moléculas dos corantes ficam mais protegidas do contato do oxigênio. Por outro lado, na interação com o DNA, as moléculas dos corantes ligadas na superfície do DNA se tornam mais suscetíveis ao ataque do oxigênio, fazendo com que a fototransformação seja mais rápida. / Photodynamic therapy (PDT) is a treatment that a photosensitizer compound (PS) is inserted into the patient\'s body and, subsequently, the treatment area is irradiated with light. The combination of oxygen, light and FS produce species that generate a curative effect. The FS currently used, although can be effective, have disadvantages. In this study, the cyanine dyes with two chromophores (BCD) or biscyanines that have favorable characteristics in the application as FS in PDT were studied. The aim of this study was to analyze the effects of concentration, environmental composition and the structure of three BCDs, with angles between chromophores 180, 150 and 90 degrees, in the characteristics of phototransformation of the dyes molecules in phosphate buffer and in the interaction with SDS micelles and DNA. The phototransformation can cause the loss of the FS photoactivity and generate photoproducts (PPs) that are both toxic as photoactive. The treatment processes in PDT and phototransformation are parallel. It allows the use of phototransformation monitoring process to determine the degree of realtime treatment process. For this reason, it was also studied the phototransformation of PPs formed during irradiation. The phototransformation analysis was performed using optical absorption and fluorescence spectroscopies. Changes in the optical absorption spectra of the dyes indicated the formation of aggregates. The aggregation reduces phototransformation rate due to the increased probability of dissipation of the excitation energy by non-radiative processes. There was no aggregate formation on irradiation of PPs because they have less tendency to aggregate compared with the dye. Similarities in the spectra of the three PPs indicated that they have the same structure of the chromophore. In the absence of oxygen phototransformation rate decreases. This fact together with the relationship between photolysis time and the quantum yields of the triplet state of the BCDs suggested the involvement of singlet oxygen in their phototransformation. The dyes were in their monomeric form at high SDS and DNA concentrations. In these interactions, the dyes also were phototransformed, with different rates compared with phosphate buffer, with formation of photoproducts. In the phototransformation of dyes in the presence of SDS micelles, we suggest that the dye molecules were more protected from oxygen contact. On the other hand, in the interaction of dyes and DNA molecules, the dye molecules bound on DNA surface become more available to oxygen attack, and the phototransformation becomes faster.

O presente estudo teve por objetivo desenvolver metodologias para imobilização de sondas moleculares fluorescentes em matrizes de sílica de tamanho controlado, bem como estudar a interação das sondas livres e imobilizadas com oxigênio e ferro. A classe de fluoróforos escolhida foi a das porfirinas, que apresentam baixa solubilidade em água e têm seu uso limitado, apesar de apresentarem pelo menos duas propriedades interessantes: (i) interagem com oxigênio formando oxigênio singlete, sendo candidatas a drogas para terapia fotodinâmica, e (ii) têm sua fluorescência suprimida ao complexarem metais, podendo atuar como sondas fluorescentes. A imobilização de porfirinas em esferas de sílica de tamanho inferior a 100 nm foi realizada através de um processo sol-gel ou pelo uso de microemulsões. O método sol-gel exigiu a modificação prévia da molécula da porfirina com reagente organosilano e resultou em esferas na faixa de 70 nm. O método da microemulsão dispensou a modificação da porfirina e resultou em esferas na faixa de 30 nm, muito estáveis em água. Os fluoróforos imobilizados preservaram suas propriedades óticas e a sua capacidade de gerar oxigênio singlete. Os estudos envolvendo a detecção de oxigênio singlete foram realizados pelo método físico direto, a partir do registro da fosforescência característica no infravermelho-próximo, e pelo método químico indireto usando a sonda 1,3difenilisobenzofurano. O tempo de vida do oxigênio singlete obtido quando uma suspensão, em acetonitrila, de esferas de sílica carregadas com porfirinas foi excitada em 532 nm foi de 52 &#181;s e está de acordo com o valor determinado para uma solução padrão contendo azul de metileno sob as mesmas condições. As porfirinas imobilizadas em sílica apresentaram eficiência de geração de oxigênio singlete similar ou até superior ao rendimento quântico das porfirinas livres. Após estudos concluiu-se que a elevada geração de oxigênio singlete pode ser atribuída a mudanças no equilíbrio monômero-dímero após a imobilização das porfirinas na matriz de sílica. O emprego das porfirinas imobilizadas em esferas de sílica como sondas fluorescentes para detecção de ferro também foi investigado. Estudos da interação da hematoporfirina IX livre e imobilizada com ferro apresentaram sítios de forte e fraca interação de acordo com a faixa de concentração de ferro utilizada. A supressão da fluorescência da Hp IX livre e imobilizada em sílica obedece a um comportamento linear na faixa de concentração de ferro de 0 a 60 &#181;M. Portanto, a imobilização de porfirinas em nanoesferas de sílica permitiu a dispersão de porfirinas insolúveis em água e manteve as moléculas acessíveis ao oxigênio molecular e aos íons ferro, preservando suas propriedades e ampliando a possibilidade de aplicações. / The present study is focused on developing methodologies for the immobilization of fluorescent molecular probes in size controlled silica matrixes, and studying the interactions of free and entrapped molecules with molecular oxygen and iron. This study was based on porphyrins, a class of compounds with low solubility in water and limited use, but with at least two very interesting properties: (i) interaction with molecular oxygen to yield singlet oxygen, potential drug for use in photodynamic therapy; and (ii) fluorescence quenching by metal ions, potential fluorescent probe. The immobilization of porphyrins in silica spheres of size < 100 nm was achieved by the sol-gel or microemulsion approach. The sol-gel method required the modification of porphyrin molecules with an organosilane reagent and resulted in spheres of about 70 nm. The microemulsion method did not require the modification of porphyrin molecules and resulted in spheres of about 30 nm, very stable in aqueous solution. The immobilized porphyrins preserved their optical properties and the capacity to generate singlet oxygen. Singlet oxygen was detected by a direct method from its characteristic phosphorescence decay curve at near-infrared and by a chemical method using 1,3-diphenylisobenzofuran to trap singlet oxygen. The lifetime of singlet oxygen, when a suspension of porphyrin-loaded silica spheres in acetonitrile was excited at 532 nm, was determined as 52 &#181;s, which is in good agreement with the value determined for a standard methylene blue solution under the same conditions. The porphyrin-loaded silica spheres have an efficiency of singlet oxygen generation similar or even higher than the quantum yield of free porphyrins. This high efficiency of singlet oxygen generation was attributed to changes on the monomer-dimer equilibrium after photosentisizer immobilization in the silica matrix. The use of the immobilized porphyrins as fluorescent probes for iron sensing was also investigated. The interaction of free and silica immobilized hematoporphyrin IX with iron resulted in sites of strong and weak interaction according to the concentration range. The fluorescence quenching of Hp IX, free and immobilized in silica spheres follows a linear correlation with the iron concentration from 0 to 60&#181;M. In conclusion, the immobilization of porphyrins in silica nanoespheres allowed the dispersion of insoluble porphyrins in water, while preserving the accessibility to molecular oxygen and metal ions and broadening the scope of applications.

Le processus de photo-oxydation induite a été étudié au laboratoire en conditions contrôlées à l’aide de cultures non-axéniques sénescentes de diverses souches phytoplanctoniques. Le suivi de la dégradation de l’acide cis-vaccénique (marqueur bactérien) nous a permis de confirmer l’existence d’un flux d’1O2 des phytodétritus vers les bactéries attachées et de mettre en évidence une corrélation significative entre l’état de photodégradation des bactéries et la concentration en chlorophylle a (photosensibilisateur) des cellules phytoplanctoniques. Nous avons également démontré que les photoproduits formés au sein des bactéries et du phytoplancton (hydropéroxyacides) étaient rapidement dégradés dans nos conditions expérimentales en cétoacides et hydroxyacides correspondants. L’effet des matrices siliceuses et carbonatées sur l’efficacité du transfert d’1O2 des phytodétritus vers les bactéries attachées a également été étudié. Les résultats ont montré que contrairement aux matrices carbonatées (coccolithes) des coccolithophoridés, les matrices siliceuses (frustules) des diatomées, inhibaient fortement le transfert de l’1O2 limitant ainsi la photodégradation des bactéries attachées. L’étude des effets de l’1O2 sur la dynamique des communautés bactériennes attachées aux phytodétritus a montré que près de 90 % des bactéries attachées étaient mortes dans une culture d’E. huxleyi en phase stationnaire prolongée et que les bactéries vivantes étaient dominées par des bactéries pigmentées dont la résistance à l’1O2 serait liée à leurs fortes teneurs en caroténoïdes. Des analyses en DGGE ont montré que la diversité bactérienne était affectée par l’irradiation lumineuse. / Induced photo-oxidation processes were studied in the laboratory under controlled conditions using non- axenic senescent cultures of several phytoplankton strains. The monitoring of the cis- vaccenic acid (bacterial marker) degradation allowed us to confirm the existence of a 1O2 flow from phytodetritus to the attached bacteria and to highlight a significant correlation between the photodegradation state of bacteria and chlorophyll a (photosensitizer) concentration in phytoplankton cells. We also demonstrated that photoproducts formed, within bacteria and phytoplankton (hydroperoxyacids), were rapidly degraded under our experimental conditions into corresponding ketoacids and hydroxyacids. The effect of siliceous and carbonate matrices (mineral polar medium) on the efficiency of singlet oxygen transfer from phytodetritus to the attached bacteria was also studied. Results showed that, in contrast to the carbonate matrix (coccoliths) of coccolithophorids, siliceous matrix (frustules) of diatoms, strongly inhibited the transfer of 1O2, thus limiting the photodegradation of attached bacteria. The study of the effects of 1O2 on the dynamics of bacterial communities attached to phytodetritus showed that nearly 90 % of attached bacteria were killed in a culture of E. huxleyi in late stationary phase and showed that living bacteria were dominated by pigmented bacteria whose resistance toward 1O2 results likely from their high carotenoid contents. DGGE and lipid tracer analyses showed that bacterial diversity was significantly affected by light irradiation.