En conditions de stress biotiques et abiotiques la production de plusieurs espèces réactives de l’oxygène (ERO) dans différents compartiments spécialisés de la cellule végétale est inévitable. L’oxygène singulet (1O2) a été identifié comme la principale ERO produite dans le chloroplaste au cours d’un stress lumineux. Cette ERO est très réactive et a une durée de vie courte d’environ 3 s dans les tissus biologiques, ce qui amène à penser que l’oxygène singulet agit principalement par cytotoxicité. Cependant, il a été récemment établi que l’oxygène singulet fonctionne aussi comme une molécule signal impliquée dans la signalisation rétrograde chloroplaste-noyau conduisant soit à la mort cellulaire programmée, soit à l’acclimatation. En raison des propriétés particulières de l’oxygène singulet, il est peu probable que cette ERO voyage en dehors du chloroplaste pour induire des changements d’expression de gènes nucléaires. Une possibilité est que l’oxygène singulet agisse via des médiateurs. Nous avons identifié un produit d’oxydation du β-carotène, le dihydroactinidiolide (dhA), comme intermédiaire dans la voie de signalisation de l’oxygène singulet, qui agit d’une manière similaire à un autre produit d’oxydation du β-carotène, le β-cyclocitral, précédemment identifié comme intermédiaire dans la voie de signalisation de l’oxygène singulet. Nous avons aussi mis en évidence le rôle dans la voie de signalisation régulée par le β-cyclocitral de la protéine MBS1 (METHYLENE BLUE SENSITIVITY 1), et montré que la mort cellulaire programmée induite par l’oxygène singulet chez l’Arabidopsis est controllée par une serine-threonine kinase, OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL INDUCIBLE 1). / During biotic and abiotic stress conditions, the production of several reactive oxygen species (ROS) at different specialized compartments of the cell is inevitable. Singlet oxygen (1O2) was identified to be the predominant ROS produced in the chloroplast during high light stress. This molecule is highly reactive, with a short life time of about 3 µs in biological tissues. Such properties make believe that the predominant effect of 1O2 in plants is cytotoxicity. However, 1O2 has been identified to function as a chloroplast-to-nucleus retrograde signaling molecule, leading to acclimation or programmed cell death (PCD). Cognizant of the properties of 1O2, it is most unlikely to travel directly from the chloroplast to the nucleus to signal changes in nuclear gene expression. One possibility is that 1O2 carries out this signaling function with the help of mediators. We identify a β-carotene oxidation product, dihydroactinidiolide (dhA) as a 1O2 signaling intermediate, which function similarly to the β-carotene oxidation product β-cyclocitral, previously identified to be a mediator of 1O2 plastid-nuclear retrograde signaling in Arabidopsis. We reveal a dependence of the β-cyclocitral-mediated signaling pathway on the MBS1 (METHYLENE BLUE SENSITIVITY 1) protein, and show that Programmed cell death induced by 1O2 is mediated by the serine-threonine kinase, OXI1(OXIDATIVE SIGNAL INDUCIBLE 1).

Mitocôndrias desempenham um papel central na homeostase celular. Estas organelas se diferem das demais não só por suas múltiplas funções, mas por terem seu próprio genoma, distinto do genoma nuclear. Estas organelas também participam de mecanismos de morte celular de forma central nos três mecanismos mais conhecidos: apoptose, necrose e autofagia. O mtDNA está localizado na face interna da membrana mitocondrial, onde são geradas grandes quantidades de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Em consequência, o mtDNA acumula modificações oxidativas, mesmo em condições normais de metabolismo. Entretanto as respostas celulares ao acúmulo de lesões no mtDNA ainda não são claras. Para investigarmos se lesões oxidativas no mtDNA causam morte celular, propomos um modelo no qual oxigênio singlete é gerado especificamente na mitocôndria, pela ação de fotossensibilizadores com diferentes localizações celulares (azul de metileno, AM, e cristal violeta, CV, citosólicos; Ro 19-8022, Ro, citosólico e nuclear). Mostramos, por microscopia confocal, que os corantes tem a localização esperada em células HeLa. Além disso, observamos que o AM gera oxigênio singlete proporcionalmente a concentração do corante e dose de fotoativação. Mostramos que células tratadas com os corantes diminuem a velocidade de duplicação 24 h após o tratamento, que resulta em morte celular. Para AM e Ro, estes efeitos foram proporcionais à concentração de corante e da dose de fotoativação. Por outro lado, CV apresentou uma alta toxicidade mesmo no escuro. Mostramos que as células tratadas com AM não apresentam fragmentação internucleossômica de DNA, típica de apoptose após 24 h e não apresentam quebras de fita e formação de sítios abásicos logo após o tratamento. Finalmente mostramos que células com depleção do número de cópias de mtDNA são menos sensíveis ao tratamento com AM e igualmente sensíveis ao tratamento com Ro que células HeLa normais, indicando que lesões oxidativas ao mtDNA determinam a sensibilidade celular ao AM. / Mitochondria play a central role in cell homeostasis. They differ from other subcellular structures not only due to their many functions but also because they have their own genome. Moreover, mitochondria also play a central role in cell death, in apoptosis, necrosis as well as autophagy. The mitochondrial DNA sits at the inner side of the inner mitochondrial membrane, where most of reactive oxygen species are generated, and in fact, mtDNA accumulates oxidative damage under normal physiological conditions. However, cellular responses to mtDNA damage are not clearly understood. In order to ascertain whether mtDNA damage induces cell death, we established a cellular model in which oxidative stress is induced exclusively in mitochondria, by using two photosensitizers that localize in the cytosol (methylene blue, MB and crystal violet, CV) and comparing to another one with diffuse distribution (Ro 19-8022, Ro). These molecules generate singlet oxygen locally upon photoactivation. Using confocal fluorescence microscopy we confirmed the cellular localization of the dyes, and found that. MB generates singlet oxygen in cells in a dose- and light-dependent fashion. Treatment with the dyes induced dose-dependent cell proliferation inhibition and cell death. The cytotoxic effects of MB and Ro were completely dependent on light-activation whereas CV induced cell death in the dark. We found that under these conditions, MB treatment did not induce internucleosomal DNA fragmentation or non-nucleosomic fragmentation, as we did not observe comet formation. These results indicate absence of nuclear DNA damage. On the other hand, cells depleted of mtDNA showed decreased sensitivity to MB but not to RO, indicating that mtDNA damage plays a key role in inducing cell death under these experimental conditions.

As proteínas são consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido à abundância em sistemas biológicos e às altas constantes de reações com estas espécies. Adicionalmente, têmse demonstrado que o triptofano (W) é um aminoácido extremamente susceptível a oxidação, inclusive pelo oxigênio singlete (1O2). A reação do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reação tem atraído mais atenção, uma vez que produtos de oxidação do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) têm sido associados com algumas condições patológicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formação de agregados covalentes da superóxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrófica. Entretanto, há poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reações, com estudos de estabilidade, identificação de subprodutos e propostas mecanísticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidação do triptofano pelo 1O2, através da análise e caracterização de produtos de oxidação gerados. Com este intuito, dois hidroperóxidos de triptofano isômeros (WOOH cis e trans, em relação ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por análises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidação do W pelo 1O2. Estes hidroperóxidos demonstraram ser relativamente estáveis às temperaturas ambiente e fisiológica, decompondo lentamente para os alcoóis correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das soluções contendo os WOOH leva a decomposição quimiluminescente dos WOOH à FMK. Utilizando hidroperóxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possível confirmar que a FMK formada durante esta decomposição era marcada com dois átomos de oxigênio. Este resultado demonstra que os dois átomos da FMK são derivados do grupamento hidroperóxido. Em adição, estas reações são quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermediário dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescência da decomposição dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescência da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espécie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisoméricas também foram caracterizadas como produtos de oxidação do triptofano pelo 102; uma possível via radicalar foi excluída. Em suma, este estudo contribuiu na elucidação das bases químicas envolvidas na oxidação do triptofano por 102, através da caracterização dos produtos formados e da investigação detalhada dos mecanismos de decomposição destes produtos. / Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydroperoxides (W18O18OH), it was possible to confirm the formation of a two-oxygen-labeled FMK molecule derived from W18O18OH decomposition. This result shows that both oxygen atoms in FMK are derived from the hydroperoxide group. In addition, these reactions are chemiluminescent (CL), indicating a dioxetane cleavage pathway. This mechanism was confirmed since the CL spectrum of the WOOH decomposition matched the FMK fluorescence spectrum, unequivocally identifying FMK as the emitting species. Diastereoisomeric dioxindoyalanine were also characterized as oxidation products derived from the reaction of W with 1O2. The involvement of radicals in this reaction was excluded. In summary, this work offers further insights into the chemistry involved in W-oxidation, through the characterization of photoproducts and the detailed investigation about the decomposition mechanism of these products.

No presente trabalho são apresentadas a síntese e a caracterização estrutural, fotofísica, fotoquímica e fotobiológica de nanopartículas contendo os fotossensibilizadores (FS) Azul de Metileno (AM) e Tionina. AM e Tionina foram incorporados nas nanopartículas sil-AM e sil-Tio pelo processo sol-gel. Nas nanopartículas Cab-Tio, Tionina foi ligada à superfície de sílica CabOsil® através de ligação covalente com reagentes bifuncionais. Todas as nanopartículas mostraram-se esféricas e com de diâmetro médio na faixa de 30 a 60nm. A imobilização dos FS induziu a agregação destes em extensões diferentes para cada tipo de nanopartícula. Foi observado que a maior presença de dímeros de FS leva à menor eficiência de geração de 1O2. Constatou-se que as nanopartículas sofrem pouca influência do meio, uma vez que os FS a elas ligadas não sofreram redução química por NADPH, nem supressão do estado tripleto por íons ascorbato e a supressão de fluorescência por íon brometo foi diminuída. Foi testado também o efeito do recobrimento destas nanopartículas com lipídios dioleilfosfatidil colina (DOPC) e fosfatidilglicerol (PG) e com Polietileno glicol (PEG). A adsorção das nanopartículas sobre membranas miméticas foi reduzida após os recobrimentos, resultado que foi explicado pelas interações de carga superficial (potencial zeta) e pela força de hidratação. As nanopartículas sil-AM e Cab-Tio apresentaram fototoxicidades in vitro, 38% e 20% maiores que os respectivos FS livres. A modificação das nanopartículas de sil-AM com lipídios e com PEG diminuiu a fototoxicidade das mesmas e no caso do recobrimento com lipídios levou ao aumento da toxicidade no escuro. Imagens de microscopia confocal mostraram que as nanopartículas com e sem recobrimento de lipídios entram em células B16. No caso das nanopartículas recobertas, observou-se um perfil de distribuição difuso por todo o citoplasma e no caso de nanopartículas sem recobrimento, estas encontraram-se em poucas regiões vacuolares do citoplasma. O perfil de distribuição homogênea por todo o citoplasma no caso de nanopartículas recobertas com lipídios pode ser o responsável pelo aumento de toxicidade no escuro. Concluiu-se que a ligação dos FS em nanopartículas com diferentes graus de agregação pode ser uma estratégia para obtenção de sistemas com capacidade modulada de geração de 1O2 e com reduzida susceptibilidade às composições do meio. As atividades fototóxicas das nanopartículas contra células B16 mostraram que estas podem ser úteis em Terapia Fotodinâmica de Câncer / In this work we present the synthesis and the characterization (structural, photophysical, photochemical and photobiological) of nanoparticles with incorporated photosensitizers (PS) Methylene Blue (MB) and Thionin. MB and Thionin were incorporated in sil-MB and sil-Th nanoparticles through sol-gel process. In the case of Cab-Th nanoparticles Thionin was linked to the surface of CabOsil® nanoparticles through cross-linking reactions. All nanoparticles were spherical and presented average diameter in the range of 30 to 60nm. Different extension of PS aggregation was observed in each nanoparticle. It was characterized that the higher the proportion of dimers to monomers the smaller the efficiency of singlet oxygen (1O2) generation. It was shown that nanoparticles can protect PS from external interferences, since NADPH did not reduce them, neither were their triplet state quenched by ascorbate ions. Besides, fluorescence quenching by bromide ions was reduced compared to free PS. The effect of covering the nanoparticles with lipids, i.e., di-oleil phosphatidylcholine (DOPC) and phosphatidylglycerol (PG), and with Polyethylene glycol was also tested. The nanoparticle adsorption over membrane mimics was reduced, which was explained by the interaction among surface charges (zeta potential) and by hydration forces. Sil-MB and Cab-Th nanoparticles presented in vitro phototoxicity 38% and 20% higher than the respective free PS. It was observed that the nanoparticle coating with lipids and with PEG reduced their photoxicity. Nanoparticles coated with lipids showed higher toxicity in the dark. Confocal fluorescence images of B16 cells showed that nanoparticles with or without lipid coating enter the cells. In the case of lipid-coated nanoparticles a diffuse distribution profile was observed and in the case of nanoparticles without coating, they concentrated in specific vacuolar regions of the cytoplasm. The homogeneous cytoplasmic distribution profile of lipid-coated nanoparticles can explain the increased toxicity in the dark. It has been concluded that immobilization of PS with different aggregation degrees is a strategy to obtain systems in which the modulated efficiency of 1O2 generation is not affected by the external medium. Finally, based on the observed in vitro phototoxicity activity against B16 cells, these systems can be useful in Photodynamic Therapy of Cancer

Très répandues dans le monde vivant, les protéines à doigt de zinc constituent une super-famille dont les membres possèdent un site à zinc de formule générale [ZnII(Cys)4-X(His)X] (x=0, 1 or 2). Tandis que la majorité de ces sites joue un rôle purement structural, certains présentent une fonction réactive, comme la détection de stress oxydant par exemple. En effet, les sites doigt de zinc de Hsp33 et de RsrA ont été décrits comme des interrupteurs rédox[1,2] : transmettant l'information « stress oxydant » sous forme d'un signal structural, via l'oxydation/réduction des cystéines coordonnées au zinc, détruisant/reformant le domaine doigt de zinc. Cependant, certains aspects de l'étape d'oxydation restent mal compris.Étant donné le grand nombre des protéines à doigt de zinc et leurs rôles clés, il est de tout intérêt d'identifier les facteurs contrôlant leur réactivité afin de comprendre pourquoi certaines espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont capable d'oxyder des doigts de zinc in vivo, contrairement à H2O2. Durant ce projet, nous avons décidé de nous focaliser sur deux ERO très puissantes et jouant un rôle important en biologie : l'acide hypochloreux (HOCl) et l'oxygène singulet (1O2). Nous étudierons la réactivité des doigts de zinc vis-à-vis de ces deux oxydant en utilisant des modèles peptidiques, reproduisant parfaitement la structure de doigts de zinc courants. / Widely spread in the living world, zinc finger proteins constitute a large superfamily, with a zinc site of general formula [ZnII(Cys)4-X(His)X] (x=0, 1 or 2) as a common feature. Whereas the majority of such sites plays a purely structural role, a few of them exhibit a reactive function (e.g. oxidative stress detection). Indeed, zinc finger sites of Hsp33 and RsrA have been shown to act as redox switches[1,2]: transmitting the information “oxidative stress” as a structural signal, by means of oxidation/reduction of its ZnII-coordinating cysteines. However, the precise mechanism of the oxidation step remains poorly understood.Given the occurrence of zinc finger proteins and their key roles, it is of high biological interest to identify factors controlling their reactivity and to understand why some ROS are able to oxidize them in vivo, on the contrary to H2O2. In this project, we decided to focus on two major ROS: hypochlorous acid (HOCl), a key player of the immune response, and singlet oxygen (1O2), produced in significant amount by photosynthetic organisms. By use of peptide model complexes, reproducing perfectly the structure of some archetypal zinc fingers, we investigated the reactivity of zinc fingers toward those ROS.

Photodynamic therapy (PDT) is a multimodality cancer treatment available for the palliation or eradication of systemic and cutaneous malignancies. In this thesis, the application of PDT is for the treatment of non-melanoma skin cancer (NMSC). While PDT has a well-documented track record, there are, at this time no significant indicators to suggest the superiority of one treatment regime over the next. The motivation for this work is to provide additional evidence pertaining to PDT treatment variables, and to assist in optimising PDT treatment regimes. One such variable is the treatment light dose. Determining the light dose more accurately would assist in optimising treatment schedules. Furthermore, choice of photosensitiser pro-drug type and application times still lack an evidence base. To address issues concerning treatment parameters, fluorescence spectroscopy – a valuable optical diagnostic technique – was used. Monitoring the in vivo PpIX fluorescence and photobleaching during PDT was employed to provide information pertaining to the progression of treatment. This was demonstrated by performing a clinical study at the Photobiology Unit, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee. Two different photosensitiser pro-drugs – either 5-aminolaevulinic acid (ALA) or its methyl ester (MAL) – were investigated and based on the fluorescence and pain data recorded both may be equally suitable for topical PDT. During PDT, surface fluorescence is observed to diminish with time – due to photobleaching – although cancerous cells may continue to be destroyed deep down in the tissue. Therefore, it is difficult to ascertain what is happening at depth in the tumour. This raised the questions; How long after surface PpIX fluorescence has diminished is the PDT treatment still effective and to what depths below the surface is effective treatment provided? In order to address these important questions, a three-dimensional (3D) Monte Carlo radiation transfer (MCRT) model was used to compute the light dose and the ¹O₂ production within a tumour, and the PpIX fluorescence emission from the tumour. An implicit dosimetry approach based on a single parameter – fluorescence photobleaching – was used in order to determine the ¹O₂ generation, which is assumed to be related to tissue damage. Findings from our model recommended administering a larger treatment light dose, advocating an increase in the treatment time after surface PpIX fluorescence has diminished. This increase may ultimately assist in optimising PDT treatment regimes, particularly at depth within tumours.

Neste trabalho são apresentados estudos do efeito de interfaces nas propriedades fotofísicas e fotoquímicas do azul de metileno (AM) e de derivados fenotiazínicos com o intuito de avaliar o potencial destes compostos como fotossensibilizadores (FS) em terapia fotodinâmica. As propriedades físico-químicas do AM foram estudadas em soluções de SOS e observou-se que a presença do AM em solução altera o equilíbrio entre as micelas de SOS, diminuindo o valor da concentração micelar crítica de 7mmolL-1 para 70µmoIL-1. A presença das micelas em solução também interfere nas propriedades do AM. Em baixas concentrações de SOS há formação de dímeros de AM, constatados pelo aumento da absorbância em 580nm e diminuição da emissão de fluorescência. A caracterização das espécies transientes mostrou a existência de moléculas de azul de metileno no estado triplete (3AM) e de oxigênio singlete em soluções com altas concentrações de SOS e a formação de espécies radicalares do AM em baixas concentrações do tensoativo. Esta observação sugere que o mecanismo fotoquímico do AM é dependente da sua concentração local próxima de interfaces carregadas. As interações do AM e de alguns de seus derivados fenotiazínicos (tionina, azure A e azure B) com vesículas e com células HeLa foram estudadas e em ambos os casos observou-se que as moléculas com estruturas assimétricas são incorporadas em maior extensão. Em estudos de fototoxicidade, os compostos assimétricos apresentaram maior nível de morte celular do que o verificado para os compostos simétricos. Entretanto, ao se considerar a incorporação em células, os compostos simétricos se mostraram mais eficientes por molécula. Foi desenvolvido um método para determinação do 10gP dos fotossensibilizadores (FS) por voltametria com microeletrodos que se mostrou reprodutível. Novos FSs assimétricos derivados do Azure A com duas caudas hidrofóbicas de 4, 6 e 8 carbonos (AzC4, AzC6 e AzC8) foram sintetizados. Esses novos compostos possuem eficiências de fluorescência semelhantes ao AM. O composto AzC4 apresenta eficiência de geração de oxigênio singlete bem próxima à do AM (0,56), enquanto os outros dois compostos têm uma eficiência de geração de oxigênio singlete cerca de duas vezes menor. Este comportamento se deve ao fato dos FSs com cadeias carbônicas maiores interagirem mais fortemente entre si, apresentando maior grau de agregação. Os compostos sintetizados apresentam maior incorporação em vesículas que os compostos anteriormente estudados, indicando que a assimetria da molécula favorece a incorporação, assim como, o comprimento da cadeia hidrofóbica. Resultados de incorporação em células HeLa, mostraram que o composto AzC4 interage mais facilmente com a membrana celulare apresenta maior nível de morte celular devido à sua maior incorporação. / The effect of interfaces on photophysical and photochemical properties of methylene blue (MB) and its derivatives was studied in this work, aiming to emploit their potencial as photosensitizers (PS) in photodynamic therapy.The presence of MB in SDS solutions affect the micelle equilibrium decreasing the apparent critical micelle concentration of SDS from 7mmolL-1 to 70µmoIL-1. The properties of MB were also affected. At low SDS concentrations the formation of MB dimers was detected by the increase in the absorption in 580 nm and decrease of fluorescence emission. The characterization of transient species of MB showed the existence of MB molecules in the triplet state and emission of singlete oxygen at large SDS concentration and the formation of MB radicals in small surfactant concentration. These observations suggest that the photochemical mechanism of MB depends on its local concentration close to charged interfaces.The interactions of MB as well as other phenotiazine derivatives with synthetic vesicles and HeLa cells were studied. In both cases, the PS with asymmetrical structure presented higher degrees of incorporation. Studies of phototoxicity showed that the PS with asymmetrical structures present higher degree of cell death than the symmetrical compounds. However, if one consider the degree of incorporation the symmetrical compounds are more efficient per molecule. A method to determinate logP by voltammetry with microelectrodes was developed, showing good repeatability. New asymmetric photosensitizers derived from Azure A with two hydrophobic chains of 4, 6 or 8 carbons (AZC4, AZC6 e AzC8) were synthesized in order to study structure/activity relationship. These new compounds presented similar fluorescence efficiency to MB. The oxygen singlet generation efficiency of AZC4 is similar to MB, while the efficiency of the other PSs was twice smaller. This behavior was explained in terms PS aggregation, due to their longer hydrophobic chains. The synthesized PSs presented larger degree of incorporation than the commercial PSs, showing the role of asymmetry and hydrophobicity in incorporation yields. Incorporation in HeLa cells showed that AZC4 interacts more strongly with cells than the other synthesized PSs due to the rigidity of plasmatic membrane. Under the same illumination conditions, AzC4 was the PS that presented higher degree of cell death as a result of its larger incorporation in cells.

Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas (\"estresse carbonílico\"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de \"fotoquímica sem luz\" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono, formado pela abstração de hidrogênio do IBAL. Resultados de espectrometria de massas demonstraram a formação de três diferentes adutos entre o radical terciário de IBAL, com L-Trp. Aventou-se que um dos produtos era resultante de alteração no nitrogênio e os outros no carbono 3, ambos no anel indólico. Observou-se também a formação de produto correspondente ao radical hidroxipropionil com L-Trp. Também se observaram dois produtos de L-Trp típicos de sua oxidação por oxigênio singlete, a formilquinurenina, e um aduto de função álcool. A formação de base de Schiff entre o L-Trp estudado e o IBAL também é apresentada. A formação de oxigênio singlete foi evidenciada indiretamente via EPR utilizando o spin trap TEMP e através de um captador de adição-9,10 (tipo Diels-Alder) em derivado de antraceno. Foram realizados, também, experimentos com precursores de melanina e demonstrou-se a formação de espécies excitadas do ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) que poderiam explicar a formação de produtos de DNA tipicamente resultantes de reação fotoquímica, mas na ausência de luz. Tais resultados corroboram a reação de espécies tripletes com biomoléculas, possibilitando a compreensão de número significativo de eventos biológicos conhecidos, mas teoricamente \"proibidos\" de ocorrer no estado fundamental, em tecidos não expostos à luz / Electronically excited triplet carbonyl species formed as products of some biochemical reactions, such as lipid peroxidation, behave similarly as alcoxyl radicals. It has long been hypothesized that such excited species could have a role in some diseases (\"carbonyl stress\"). Research of chemical lesions of triplet carbonyls over biomolecules and their biological response took place principally from 1970 to 1990 (the \"photochemistry without light\" hypothesis proposed by Profs. G. Cilento, IQUSP, and Emil H. White, Johns Hopkins University), but it suffered from the lack of required instrumentation, and just few cases of photo(bio)chemistry without light were confirmed. The aim of this work, using high resolution techniques (EPR, HPLC, and MS), is to analyze the reaction products of excited triplet acetone with aminoacid and protein targets. Triplet acetone was produced from the thermal decomposition of 3,3,4,4-tetramethyldioxetane (TMD) or from the aerobic oxidation of isobutanal (IBAL) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). We revealed the generation of acetyl radical, putatively originated from α-cleavage of triplet acetone, and a carbon-centered tertiary radical, proposed as an IBAL radical formed by hydrogen abstraction from IBAL. Mass spectrometry showed production of three adducts from the reaction of IBAL radical with L-Trp, one of them at the nitrogen 1 and the other two at carbon 3 from the amino acid indole ring. Two adducts with m/z correspondent to the reaction between L-Trp (at carbon 3) and a hydroxypropionyl radical, and two products typically formed from singlet oxygen (formylkynurenine and an alcohol L-Trp adduct) were also observed. A Schiff base between L-Trp and IBAL was also observed. Singlet oxygen production from triplet-triplet energy transfer from excited acetone to ground state molecular oxygen was indirectly showed by EPR spin trapping with TEMP, and by MS using the anthracene derivative EAS to trap (9,10-cycloaddition) of 18O2 (1Δg). Other data reported here include the demonstration of excited species formed when DHICA, a melanin precursor, was oxidized. These results might explain the generation of DNA photochemical products (thymine dimers) in the absence of light. Altogether, we collect strong and significant evidence in this thesis that corroborate the reactivity of triplet excited species with a couple of biomolecules, providing insights over some reportedly known molecular events that are theoretically forbidden to occur in the ground state but happen in tissues non-exposed to light

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des cancers prometteuse, mettant en jeu une action combinée de l’oxygène moléculaire, de la lumière et d’un photosensibilisateur (PS). Néanmoins, les PSs utilisés souffrent d’une faible solubilité dans les milieux aqueux ainsi que d’un tumorotropisme limité qui sont des barrières à la réussite du traitement. Ainsi, actuellement, une attention particulière est portée au développement de nanoparticules (NPs) capables de pallier les défauts des PSs. Notre travail a consisté à étudier des dendrimères poly(amidoamine) (PAMAM), macromolécules polymériques tridimensionnelles, conjugués via une liaison covalente au PS, la Chlorine e6 (Ce6). Cette construction nous a permis de vectoriser 32 molécules de Ce6 par dendrimère. La production d’oxygène singulet et l’émission de fluorescence ont été modérément affectées par le greffage covalent de la Ce6 aux NPs. In vitro, les dendrimères PAMAM ont permis d’accroitre l’efficacité PDT de la Ce6 en potentialisant son internalisation cellulaire via un mécanisme actif d’endocytose. Néanmoins, l’efficacité PDT des NPs est limitée par la concentration locale élevée en Ce6 en périphérie des dendrimères qui réduit son rendement quantique en oxygène singulet moléculaire, espèce cytotoxique. Une libération de la Ce6 permettrait ainsi de potentialiser l’efficacité PDT des NPs en restaurant notamment les propriétés photophysiques de la Ce6. La suite de ce travail a été de concevoir une NP capable de libérer la Ce6 sous l’action d’estérases retrouvées dans les cellules. Leur caractérisation a permis de démontrer en solution que les propriétés photophysiques de la Ce6 étaient rétablies à la suite de son relargage des NPs. Cette dernière construction clivable est prometteuse pour de futures applications en PDT / Photodynamic therapy (PDT) is a modality of cancer treatment, involving a combined action of molecular oxygen, light and photosensitizers (PS). However, the PSs suffer from a low solubility in aqueous media and limited tumor accumulation, diminishing the treatment success. Presently, particular attention is paied to the development of dendrimer-based nanoparticles (NP) that are able to overcome the shortcomings of the PSs. The present study investigates the poly(amidoamine) dendrimer (PAMAM), a tridimensional polymeric macromolecule, covalently functionalized with the PS Chlorin e6 (Ce6). The singlet oxygen generation efficiency and fluorescence emission were moderately affected by the covalent binding of the Ce6 to the dendrimer. This construction allows the vectorization of 32 Ce6 molecules per dendrimer. In vitro, PAMAM dendrimers improve the PDT efficiency of Ce6 by promoting their cellular internalization via an active endocytosis mechanism. However, the PDT efficiency of NPs is limited by the high local concentration of Ce6 at the periphery of dendrimers decreasing production of singlet oxygen. Ce6 release could restore Ce6 photophysical properties and as such improve the PDT efficiency of NP. Thus, the next step of this work was to design a cleavable NP able to release the Ce6 under esterase activity. In solution the NP characterization demonstrated that the photophysical properties of Ce6 were recovered after their release from the NP. This cleavable construction displays promising perspectives for future PDT applications

A oxidação de membranas lipídicas pode ser benéfica (p.ex. sinalização celular) ou prejudicial, sendo a permeabilização de membranas uma de suas consequências citotóxicas. A permeabilização fotoinduzida de membranas é parte essencial do mecanismo da terapia fotodinâmica (PDT), uma modalidade clínica em que fotossensibilizadores, luz e oxigênio são combinados para oxidar biomoléculas e consequentemente danificar células indesejadas. Neste trabalho, buscamos entender molecularmente quais fatores levam à permeabilização fotoinduzida de membranas. Enfatizamos os papéis do oxigênio, do status da membrana e de reações específicas do fotossensibilizador em contato com a membrana. Simulações de dinâmica molecular foram usadas para obter a distribuição de oxigênio em membranas em função da temperatura nas fases fluida ou gel. Procedimentos específicos de análise de cinéticas de luminescência de oxigênio singlete foram desenvolvidos para calcular tempos de vida de estado excitado triplete compatíveis com as variações da distribuição de oxigênio em membranas. Caracterizamos um derivado fluorogênico do α-tocoferol como uma sonda para oxigênio singlete em experimentos com lipossomos, possibilitando comparar qualitativamente os níveis de oxigênio singlete atingindo a membrana quando produzido por fotossensibilizadores hidrossolúveis ou lipossolúveis. Experimentos em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) nos permitiram comparar a ativação da sonda com o aumento de área superficial da membrana, e estimar a constante de velocidade da reação do oxigênio singlete com lipídeos insaturados como 6 x 104 M-1 s-1. Estreitando nosso foco para a permeabilização fotoinduzida de membranas, inicialmente caracterizamos quatro fotossensibilizadores fenotiazínicos em relação a suas interações com membranas e suas capacidades de promover o vazamento de uma sonda fluorescente. Fotossensibilizadores que se particionaram mais em membranas (e não os geradores de oxigênio singlete mais eficientes) danificaram a membrana de lipossomos mais eficientemente. A ligação à membrana também afetou as vias de decaimento dos estados excitados triplete. Com esse estudo, selecionamos o fotossensibilizador hidrofílico azul de metileno (MB) e o fotossensibilizador mais hidrofóbico DO15 para as investigações subsequentes. Os efeitos de ambos os fotossensibilizadores em GUVs foram caracterizados e observamos que as cinéticas de permeabilização indicaram diferentes taxas de produção de lipídeos formadores de poros para MB e DO15, o que deve depender de interações específicas com a membrana. Para melhor compreender o papel de interações fotossensibilizador/membrana, caracterizamos a oxidação de lipídeos por ambos os fotossensibilizadores, em uma condição em que DO15 permeabilizava membranas 70 vezes mais eficientemente que MB. Observamos principalmente a formação de hidroperóxidos lipídicos para MB, enquanto que para DO15, além desses mesmos produtos, observamos a formação de álcoois, cetonas e aldeídos fosfolipídicos de cadeia truncada, esses últimos tendo sido relacionados a condições em que se observou a permeabilização de membranas. Embora já fosse sabido que aldeídos fosfolipídicos aumentam a permeabilidade da membrana, esse fenômeno nunca havia sido demonstrado para a formação de aldeídos in situ. A fotooxidação lipídica foi acompanhada por aumento do fotobranqueamento de DO15 e pela formação de radicais lipídicos oxigenados, indicando a ocorrência de reações diretas entre lipídeos e fotossensibilizadores. O mapeamento dos fatores que levam à permeabilização fotoinduzida em membranas, focando em reações e interações moleculares, é o maior produto desse trabalho / Oxidation of lipid membranes can be beneficial (e.g., cell signaling) or detrimental, with membrane permeabilization representing one of its cytotoxic outcomes. Photoinduced membrane permeabilization is key to the mechanism of photodynamic therapy (PDT), a clinical modality in which photosensitizers, light and oxygen are combined to oxidize biomolecules and consequently damage diseased cells. In this work, we aimed to understand at the molecular level which factors lead to photoinduced membrane permeabilization. We emphasized the roles of oxygen, membrane status and specific reactions of the photosensitizer in contact with the membrane. Molecular dynamics simulations were used to assess oxygen distribution in membranes as a function of temperature within membranes in gel or liquid phases. Special fitting procedures of singlet oxygen luminescence kinetics were devised to allow the calculation of triplet excited state lifetimes compatible with variable oxygen distributions in membranes. We characterized a fluorogenic α-tocopherol probe as a singlet oxygen trapping molecule in experiments with liposomes, and were able to qualitatively compare the amount of singlet oxygen molecules reaching the membrane after being generated by water soluble or membrane bound photosensitizers. Experiments performed in giant unilamellar vesicles (GUVs) allowed us to compare the activation of the probe with the observed membrane surface area increase and estimate the reaction rate of singlet oxygen with unsaturated lipids to be 6 x 104 M-1 s-1. We then narrowed our focus to photoinduced membrane permeabilization, initially characterizing four phenothiazinium photosensitizers with respect to their interactions with membranes and their capability to promote leakage of a fluorescent probe. Photosensitizers that bound to membranes to a larger extent (and not the most efficient singlet oxygen generators) were the most efficient ones to damage liposomal membranes. Membrane binding also affected triplet excited state deactivation pathways. From this study, we selected the hydrophilic photosensitizer methylene blue (MB) and the more hydrophobic photosensitizer DO15 for subsequent investigations. We characterized the effects of both photosensitizers in GUVs and observed that the kinetics of membrane permeabilization implied different rates of generation of pore-forming lipids for MB and DO15, which should depend on specific interactions with membranes. To further understand the role of photosensitizer/membrane interactions, we characterized the oxidized lipids formed by both photosensitizers in a condition in which the membrane permeabilization efficiency of DO15 was 70 times higher than that of MB. We observed mainly formation of lipid hydroperoxides by MB, while DO15 not only led to these same products, but also to alcohols, ketones and phospholipid truncated aldehydes, the latter being related to conditions in which membrane permeabilization was observed. Although aldehydes were already known to increase membrane permeability, this phenomenon had never before been demonstrated for aldehyde formation in situ. Lipid photooxidation was accompanied by increased photobleaching of DO15 and by formation of lipid oxygenated radicals, indicating the occurrence of direct reactions between lipids and photosensitizers. A roadmap of the factors leading to photoinduced membrane permeabilization focusing on molecular interactions and reactions is the major achievement of this work.