Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:10Z : No. of bitstreams: 1 000868807_20170803.pdf: 1048307 bytes, checksum: 0dffab6c7285f2f758c8340bfb3f7e3b (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-07T14:09:10Z: 000868807_20170803.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-07T14:10:14Z : No. of bitstreams: 1 000868807.pdf: 3365386 bytes, checksum: ea272827c7ffe9fa7ea3385d0c22cf85 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Salmonella Enteritidis é um patógeno pertencente à Família Enterobacteriaceae que frequentemente está relacionada a infecções alimentares em humanos, principalmente em crianças, idosos e pacientes imunossuprimidos. A importância deste micro-organismo se dá pela sua prevalência significativa, com distribuição mundial, nos lotes de frangos de corte e de postura de ovos, levando a sérias implicações na saúde pública e ao mercado avícola. O controle eficaz da salmonelose é um desafio, pois envolve um complexo manejo dos animais e tratamento com uso de antibióticos que não garantem a eliminação da infecção. O uso de bacteriófagos líticos contra infecções bacterianas (fagoterapia) vem atender uma demanda crescente por alternativas ao tratamento antimicrobiano convencional. Todavia, a literatura tem relatado o surgimento de certa resistência bacteriana a alguns bacteriófagos líticos, como por exemplo, em Salmonella sp. Diversos são os mecanismos bacterianos de resistência aos fagos, tais como a prevenção de adsorção, o bloqueio da injeção do DNA do fago, restrição-modificação, infecção abortiva e o sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) /Cas (CRISPR associated proteins) de imunidade adquirida. Assim sendo, o presente trabalho objetivou a caracterização molecular da resistência bacteriana de fagos líticos isolados contra cepas de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE). Para tal, os mecanismos-alvos escolhidos foram o sistema CRISPR/Cas e o bloqueio da adsorção de fagos, via lipopolissacarídeo (LPS). Nas 22 cepas de estudo, um total de 72 CRISPRs foi identificado, com 14 diferentes domínios repetitivos (DR), apresentando um total de 551 sequências de espaçadores e os genes associados cas1, cas2 e cas3. Cas 9 e cas 10 não foram identificados. Foi observado que as cepas resistentes aos fagos líticos possuíam um maior número total... / Salmonella Enteritidis is a pathogen that belongs to the Enterobacteriaceae family and is often related to infections transmitted by food in humans, especially in children, elderly and immunosuppressed patients. The importance of this microorganism is because it's significant prevalence with worldwide distribution in lots of poultry, leading to serious implications for public health and poultry industry. Effective control of salmonellosis is a challenging because involves a complex animal handling and treatment with antibiotics that do not guarantee the elimination of infection. The use of lytic bacteriophages against bacterial infections (phage therapy) meets a demand for alternatives to the conventional antimicrobial treatment. However, the literature has reported the emergence of bacterial resistance to some lytic bacteriophages, such as in Salmonella sp. There are several mechanisms of bacterial resistance to phages, such as prevention of adsorption, blocking the injection of phage DNA, restriction-modification, abortive infection and the CRISPR/Cas System acquired immunity. Thus, this research aims to study in a molecular level the bacterial resistance of lytic phages isolated from pathogenic strains of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (SE). Two mechanisms have been chosen: the CRISPR/Cas system and blocking of phage adsorption via LPS. From 22 SE strains, a total of 72 CRISPRs was identified with 14 different repetitive domains (DR), presenting a total of 551 spacers' sequences and cas1, cas2 and cas3 CRISPR associated genes. Cas 9 and cas 10 genes weren't identified. It was observed that phage lytic resistant strains have a higher total number of spacers in the CRISPR locus in relation to sensitive strains, and this difference was statistically significant. Phylogenetic analysis of cas genes from CRISPR/Cas system, of rfaC, rfaH, cpsG, manB, manc, lpxA, lpxB and lpxC genes (related to LPS) and of... / FAPESP: 2011/11761-7

Orientadora: Cristiane Duque / Banca: Sandra Maria Herondina Coelho Ávila de Aguiar / Banca: Ana Cláudia Okamoto / Banca: Thais Marchini de Oliveira / Banca: Thais de Cássia Negrini / Resumo: A cárie precoce da infância (CPI) é ainda um grave problema de saúde pública no mundo, principalmente em países em desenvolvimento. Estudos têm sugerido a associação da ingestão frequente de carboidratos fermentáveis como a sacarose, altas contagens de microrganismos cariogênicos e maior vulnerabilidade imunológica da criança na etiologia da CPI. O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos microbiológicos e imunológicos associados ao desenvolvimento da cárie precoce da infância. Crianças com idade entre 36 e 60 meses foram selecionadas e divididas em três grupos: LC - livres de cárie, CPI e CPI-S (CPI-severa). Questionário sobre os aspectos socioeconômico-culturais, hábitos de higiene bucal e diários de dieta foram respondidos pelos responsáveis. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dental das crianças e processadas para subsequentes avaliações laboratoriais. Em seguida, os níveis de IgA salivar total e contra GbpB de S. mutans foram determinados por ELISA e Western blot, respectivamente, as concentrações salivares dos peptídeos catiônicos antimicrobianos (PCAM): defensinas hBD-2 e hBD-3, catelicidina LL-37 e histatina 5 (HTN-5) por ELISA e a presença e os níveis salivares de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. e Scardovia wiggsiae por qRT-PCR, sendo que estes dados foram correlacionados com os níveis salivares e no biofilme dental de estreptococos mutans (SM) e Lactobacillus spp. por meio de cultivo em meios específicos. Os resultados mostraram que as crianças com CPI-S apresentaram menor renda familiar quando comparadas às crianças LC ou CPI. Contudo, a ingestão de açúcar não diferiu entre os grupos. O grupo CPI-S apresentou maior contagem de SM na saliva/biofilme em relação aos grupos LC e CPI. Houve uma correlação positiva... / Abstract: Early childhood caries (ECC) is still a serious public health problem worldwide, especially in developing countries. Studies have been suggested the association among frequent intake of fermentable carbohydrates such as sucrose, high cariogenic microorganism's counts and child's immune vulnerability in the etiology of ECC. The objective of this study was to evaluate the microbiological and immunological factors for the development of early childhood caries. 36 to 60 monthold children were selected and distributed into three groups: caries free (CF), ECC and S-ECC (severe-ECC). Questionnaires about socio-economic-cultural data, oral hygiene habits and food-frequency diary were completed by the parents. Saliva and dental biofilm were collected from children and processed for subsequent laboratorial tests. The following analyses were determined: total IgA and IgA response against S. mutans GbpB by ELISA and Western blot, respectively; salivary concentrations of antimicrobial peptides (AMPs): defensins hBD-2 and hBD-3, cathelicidin LL-37 and histatin 5 (HTN-5) by ELISA; salivary detection and quantification of Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. and Scardovia wiggsiae by qRT-PCR, and these data were correlated with mutans streptococci (MS) and Lactobacillus spp. levels by culture in specific medium. Results showed that S-ECC children had reduced family income compared to ECC and CF. However, sugar intake did not differ among the groups. S-ECC group had higher MS count than CF/ECC groups. Positive correlations between salivary IgA response against GbpB and MS counts were found when the entire population was evaluated. When children with high mutans streptococci counts were compared, S-ECC group showed a significant decrease in IgA antibody levels against GbpB compared... / Doutor

Orientador: Elisabeth Criscuolo Urbinati / Banca: Flávio Ruas de Moraes / Banca: Marco Antônio de Andrade Belo / Banca: Eduardo Gianini Abimorad / Banca: Leonardo Susumu Takahashi / Resumo: A saponina de quilaia (SQ) está presente na casca de árvores chilenas e brasileiras da mesma família, Rosaceae e, de acordo com relatos, melhora o desempenho zootécnico e atua no sistema imune de aves, ratos, camarões e peixes. Assim sendo, este estudo objetivou avaliar os efeitos da inclusão de níveis crescentes de extrato purificado de SQ (0,0; 100,0; 200,0; 300,0; 400,0 mg kg-1) para juvenis de pacu. O estudo teve três etapas experimentais distintas, compostas por períodos de consumo da dieta por sete, 15 e 30 dias. Em cada etapa, foram utilizados 350 peixes, totalizando 1050 peixes. Esses foram distribuídos em 25 aquários (200L), num delineamento inteiramente casualizado. No segundo capítulo, os peixes foram anestesiados para a coleta de sangue e órgãos (fígado e intestino). Os parâmetros avaliados foram desempenho (ganho de peso, conversão alimentar e consumo de ração), sobrevivência, parâmetros fisiológicos e histológicos [glicose, cortisol, proteína total, colesterol, triglicerídeos, índice hepatossomático (IHS) e histologia de intestino]. Houve alteração no perfil de lipídios circulantes, com redução do IHS aos 30 dias e das concentrações séricas de triglicerídeos aos sete dias de consumo de SQ, respectivamente. Com 15 dias, foram observados sinais de inflamação no intestino do pacu. Não houve mortalidade durante o período de alimentação dos peixes. No terceiro capítulo, após o período de alimentação, cerca de 325 peixes foram inoculados com a bactéria Aeromonas hydrophila e transferidos para outro sistema experimental, sendo distribuídos em 25 aquários (160L), onde foram observados durante seis dias, quanto aos sinais clínicos da doença e ocorrência de mortalidade. Os peixes foram anestesiados para a coleta de sangue antes e após o desafio bacteriano. As análises fisiológicas foram de glicose, proteína total, albumina e globulina ... / Abstract: The quillaja saponin (QS) is present in the bark of Chilean and Brazilian trees of the same family, Rosaceae and, it's able to promote performance and the immune system of animals. Thus, this study evaluated the effect of consuming diets containing increasing levels of QS (0,0; 100,0; 200,0; 300,0; 400,0 mg kg-1) by pacu. Three distinct steps in different consumption diets periods compound by seven, 15, and 30 days. At each step, was used a total of 350 fish, totaling 1050 fishes. These fishes were distributed into 25 cages (200L), in a completely randomized design. In the second chapter, after the feeding period (seven, 15 and 30 days), fish were anesthetized to blood collect and organs for physiological, histological and performance evaluation. The parameters evaluated were the performance (weight gain, apparent feed conversion and feed intake), survival, physiological and histological parameters [hepatosomatic index (HSI), blood cortisol, glucose, cholesterol, triglycerides and intestine histology]. The addition of all levels of QS in the diets of juvenile pacu reduced the triglycerides levels at seven days and HSI at 30 days of feeding. At 15 days of feeding QS diets were observed signals intestinal inflammation in pacu. There was no mortality during the experimental period. In the third chapter, after the feeding period (seven, 15 and 30 days), about 325 fishes were inoculated with the Aeromonas hydrophila and transferred to another experimental system, divided into 25 cages (160L) and during six days were observed clinical signs of disease and occurrence of mortality. The fishes were anesthetized for blood collection before and after bacterial challenge. The physiological analyzes were glucose, total protein and albumin. The immunological variables measured were activity serum lysozyme, leukocytes respiratory activity (LRA), differential and leukocyte count and globulin and ... / Doutor

Orientador: João Batista Kockenborger Fernandes / Banca: Elisabeth Criscuolo Urbinati / Banca: Marco Antônio de Andrade Belo / Resumo: Neste estudo objetivou-se avaliar o efeito da unha de gato, Uncaria tomentosa, sobre a toxicidade em Hyphessobrycon eques e o efeito sobre o crescimento e a atividade imune em tilápias. Pela técnica da cromatografia líquida verificou-se a autenticidade da planta e quantificaram-se os principais componentes químicos. O extrato aquoso mostrou ser praticamente não tóxico para o H. eques, com CL50 de 18,16 mg/L. Na determinação do melhor tempo de suplementação pela análise do componente celular e dos parâmetros hematológicos na aerocistite em tilápias, verificou-se que o máximo do acúmulo celular ocorreu após três semanas. Para a análise do desempenho zootécnico e da resposta inflamatória aguda, tilápias foram alimentadas durante três semanas com dietas contendo: 0; 75; 150; 300 e 450 mg de extrato de unha de gato/kg da ração. Após o final do período experimental, os peixes foram desafiados com Streptococcus agalactiae inativado e as 6; 24 e 48 horas após o desafío foram coletadas as amostras. Às 6 horas observou-se incremento, dependente de dose, no número de leucócitos no sangue e às 24 horas incremento de leucócitos no local da inflamação. Além disso, os centros melanomacrófagos foram maiores em tamanho e número nos grupos tratados. Observou-se também aumento da expressão de Imunoglobulina M no baço após 24 horas do desafio nos grupos que receberam 300 e 450 mg/Kg. Não houve alterações histopatológicas em brânquias, intestino, baço e fígado. Verificou-se aumento no ganho de peso, que pode ter sido atribuído ao incremento do tamanho dos vilos intestinais. Finalmente, estes resultados são a primeira evidência do efeito da U. tomentosa sobre o ganho de peso e ativação do sistema imune inato e específico em tilápias. Os resultados histopatológicos sugerem que a planta pode... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to evaluate the effect of the toxicity of U. tomentosa on H. eques and its effect on growth performance and innate immunity in tilapia. It was found, by the technique of chromatography, verified the authenticity of the plant and quantified the main chemical components. The aqueous extract was nontoxic to matogrosso, with LC50;48h of 18,16 mg/L. To determinate the best period of feeding, It was analyzed the cellular component and haematological parameters in aerocistite in tilapia and It was found that the maximum accumulation of cellular and best hematologic results occurred after three weeks. To evaluate the effect of this plant on immune activity and growth performance of Nile tilapia, we used 450 fish (81,3 ± 4,5g) randomly distributed at 25 fish per 1500-L tank and fed a diet containing 0.0, 75, 150, 300 and 450 mg ―uña de gato‖/kg diet for 3 weeks. It was used three replicates per treatment and control groups. After the 3-week experimental period, fish of each treatment were challenged by inactivated Streptococcus agalactiae. Samples were taken at 6, 24 and 48 hours after the inflammatory stimulus. We found a dose-dependent increase in blood leukocytes after 6 hours post-inoculation and a large dose-dependent increased of leukocytes at site of inflammation at 24 hours post-inoculation. Further, splenic melano-macrophage centers were significant higher in size and number in treated groups. Furthermore, a significant increase of IgM expression in spleen was detected at 24 hours post-bacterial challenge in supplemented fish with 300 and 450 mg U. tomentosa/Kg diet. There were no histopathological changes in any treatment in gills, intestine, spleen and liver. We found an unexpected increase of weight gain and feed conversion that would be explained, partially, due to increase of intestinal villus... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408802-Texto+Completo-0.pdf: 1288333 bytes, checksum: fed9a5577936cc05fba85f19708101ee (MD5) Previous issue date: 2008 / According to the immunological surveillance hypothesis, the immune system is relevant against tumor growth. However, the immune response is not completely able to block all tumors. A possible explanation is that immune cells tolerization induced by the tumor immunosuppressive environment enables tumor development and decreases immune efficiency against the tumor. The aim of the present investigation was to better understand the in vivo antitumoral immune response as well as to identify mechanisms that play a role in modulating a reversion of tumor induced tolerance. To that end we used three experimental models: (1) Subcutaneous B16F10 tumor injection to analyze a polyclonal immune response, (2) subcutaneous B16OVA (OVA257-264 SIINFEKL) tumor injection with OT-1 cell adoptive transfer to study a T CD8+ anti-tumoral immune response and (3) construction and subcutaneous injection of a B16F10 expressing MHC class II restricted antigen (B16F10EaRed) with TEa cells adoptive transfer to study TCD4+ anti-tumoral immune response generation. The results using these models showed a reduced number of infiltrating cells in the peritumoral area as well as a decreasing cell number in tumor draining lymph nodes as tumor grew. These findings suggested cell traffic interruption between lymph nodes and primary tumor site. Likewise, CD86 expression in dendritic cells (DCs) was decreased with tumor growth. An increased precursor frequency of anti-tumoral T CD8+ cell in the B16OVA system arrested tumor growth, but did not completely prevent it. A stronger tumor immune response was achieved with injection of intra-tumoral TLR-4 ligand, the E. coli lipopolysacharide (LPS), however only during a specific window of time after tumor injection. The B16EaRed system showed that antigen accessibility by DCs is crucial to stimulate a T CD4+ anti-tumoral immune response; as a result, there was a higher TEa cell proliferation against tumor lisates than whole tumor cells. When tumor cells were induced to undergo necrosis or apoptosis and injected subcutaneously, the result was higher percentage of CD11c+ YAe+ CD86+ cells. There was more TEa cells proliferation in draining lymph nodes from mice injected with apoptotic or necrotic cells, showing a proliferation peak at day nine after tumor injection. However, it was observed a cell contraction three days after. TEa cell division decreased gradually throughout time, suggesting there was limited antigen cell presentation in all experimental models studied. TEa cell memory differentiation was also observed in the three treatments, with emphasis in the animals that received necrotic or apoptotic tumor cells. However, the TEa cells were not able arrest tumor growth when B16EaRED was injected live. Together, these results suggest that the decrease in antigen presentation and co-stimulation throughout time, negatively affects T cell memory differentiation. The results point out that whole tumor does not deliver enough signals to generate anti-tumoral T cells with memory phenotype capable of blocking tumor growth. Contrarily, the tumor seems to create an environment that does not allow immune response, avoiding cell traffic between the draining lymph node (DLN) and the tumor site, decreasing CD86 expression on DCs cells in DLN. In addition, signals delivered by death cells simulating apoptosis or necrosis increased tumor antigen presentation and co-stimulation, but did not replace LPS delivered signals that were efficient to revert immunossupression. / De acordo com a hipótese da vigilância imunológica, o sistema imune é relevante no controle do crescimento tumoral. Entretanto, a resposta imune não é capaz de barrar a progressão de todos os tumores. Uma possível explicação para isso é a tolerização das células imunes proporcionada pelo ambiente imunossupressor gerado por tumores, favorecendo seu desenvolvimento e diminuindo a eficácia da resposta imune contra o tumor. O presente estudo visou analisar a formação de respostas imunes anti-tumorais in vivo, bem como identificar mecanismos capazes de reverter a tolerância induzida pelo tumor à resposta imune. Para realizar este trabalho foram usados três sistemas experimentais: (1) injeção subcutânea de tumor B16F10 para análise da resposta imune policlonal, (2) injeção subcutânea de B16OVA (OVA257-264 SIINFEKL) com transferência adotiva de células OT-I para o estudo da geração de resposta de células T CD8+ e (3) construção e injeção subcutânea de uma linhagem de B16F10 expressando um antígeno restrito ao MHC classe II (B16EaRFP) com transferência adotiva de células TEa para o estudo da geração de resposta anti-tumoral de células T CD4+. Com estes modelos experimentais foi observada diminuição de células no infiltrado peritumoral e da celularidade nos linfonodos drenantes (LND) à medida que o tumor B16F10 cresce, sugerindo uma interrupção do trânsito de células imunes do sítio tumoral para o LND. A expressão de CD86 nas células dendríticas (DCs) nos linfonodos diminui com o crescimento tumoral. Com a elevação da freqüência precursora de células T CD8+ anti-tumorais no sistema B16OVA, o crescimento tumoral foi retardado mas não barrado por completo. A melhora significante da resposta contra o tumor foi obtida com a injeção intratumoral de um ligante de TLR-4, o lipopolissacarideo de E. coli (LPS), mas apenas quando foi injetado via intratumoral, após o estabelecimento do tumor in vivo. O sistema B16EaRFP revelou que a acessibilidade do antígeno às células dendríticas é importante na estimulação da resposta T CD4+ anti-tumoral, resultando em maior proliferação de células TEa em resposta ao tumor lisado versus o tumor vivo. Quando as células tumorais foram induzidas a necrose e apoptose e injetadas subcutaneamente, houve maior porcentagem de células CD11c +YAe+ CD86+. Observou-se maior proliferação de células TEa nos linfonodos drenantes no grupo de camundongos injetados com células tumorais mortas por necrose, com um pico nove dias após a injeção tumoral, mas já apresentando contração após três dias. A divisão das células TEa também diminui gradualmente ao longo do tempo, sugerindo que nos três casos há apresentação limitada de antígeno. A diferenciação das células TEa em fenótipo de memória foi observada nos três tratamentos, com mais ênfase nos animais que receberam tumor induzido a necrose e apoptose. Contudo, as células TEa não foram capazes de fornecer ajuda para interromper o crescimento tumoral quando o B16EaRED foi injetado vivo. Em conjunto, os resultados sugerem que a diminuição da apresentação de antígeno e de co-estimulação ao longo do tempo impedem a diferenciação das células T em células de memória eficazes. Os resultados indicam que o tumor intacto não fornece sinais suficientes para a geração de células T de memória anti-tumoral para impedir o crescimento tumoral. Ao contrário, o tumor parece gerar um ambiente que não favorece a resposta imune, impedindo o trânsito de células imunes entre o LND e o sitio tumoral, diminuindo a expressão de CD86 em DCs no LND. Ainda, sinais fornecidos por células induzidas a apoptose ou necrose aumentam a apresentação de antígenos tumorais e os níveis de co-estimulação, embora não substituam os sinais fornecidos pelo LPS, capazes de reverter o quadro imunossupressor.

O sistema imunológico é formado por um conjunto de células e moléculas envolvidas primariamente na defesa do organismo contra agentes infecciosos. Neste sentido, destaca-se a ação das proteínas codificadas pela região do MHC-I, as quais são responsáveis pela apresentação de pequenos peptídeos (normalmente entre 8 e 12 aminoácidos), gerados a partir da via de processamento endógeno, para Receptores de Células T (TCRs) citotóxicas. As bases moleculares subjacentes à apresentação de peptídeos no contexto das moléculas de MHC-I ainda não foram totalmente esclarecidas, principalmente em função da complexidade inerente a esse processo biológico. Sabe-se, no entanto, que padrões moleculares presentes na área de interação do pMHC-I com o TCR, bem como a estabilidade dos complexos pMHC-I na superfície celular, são fatores determinantes para a imunogenicidade de diferentes complexos. Com o nascimento e desenvolvimento da bioinformática, uma grande evolução foi observada na área, especialmente no que tange ao estudo de sequências lineares de genes e proteínas. Entretanto, o estudo a nível estrutural ainda é lento, especialmente devido ao limitado número de estruturas tridimensionais resolvidas experimentalmente e à falta de modelos acurados. Assim sendo, esta tese se propôs a automatizar e otimizar uma ferramenta de modelagem de complexos pMHC-I (técnica D1-EM-D2) e, posteriormente, criar uma protocolo para avaliar a estabilidade in silico de complexos pMHC-I, com foco na interação entre epitopo e MHC-I. Como resultado, criamos uma nova ferramenta, a qual chamamos DockTope, validada sobre um conjunto mais amplo de dados experimentais (135 estruturas em relação às 46 estruturas do estudo anterior). Esta ferramenta permite que qualquer usuário modele seu próprio pMHC-I, através de uma interface web acessível. Ainda, um estudo via dinâmica molecular realizado com base nos complexos pMHC-I modelados a partir do DockTope nos permitiu inferir algumas das variáveis envolvidas na estabilização dos complexos. Os resultados apresentados aqui contemplam várias áreas de conhecimento da área biológica, favorecendo o desenvolvimento de vacinas mais racionalizadas e alavancando o conhecimento e a compreensão de eventos imunológicos. / The immunologic system is constituted by a group of cells and molecules involved mainly in the organism defense against infectious agents. In this way, the action of proteins encoded by the MHC-I region should be highlighted, since they are responsible for the presentation to T Cell Receptors (TCRs) of small peptides (normally 8 to 12 amino acids in length) generated by the endogenous processing pathway. The molecular bases underlying the presentation of peptides in the context of MHC-I molecules are not fully understood, especially because the complexity inherent to this process. However, it is known that molecular patterns presented in the TCR-interaction surface of each pMHC-I, as well as complex stability on cellular surface, are pivotal factors to determine immunogenicity. The bioinformatics development brings together a great evolution in the field, especially in respect to the analysis of genes and proteins sequences. Yet, the structural study is still delayed, mainly because we have a limited number of threedimensional structures experimentally resolved and there is a lack of accurate models. In this way, we aimed to automatize and optimize a bioinformatics tool to pMHC-I modeling (D1-EM-D2 approach) and, posteriorly, to create an in silico protocol to evaluate the pMHC-I complex stability, focusing on the interaction between epitope and MHC-I. As a result, we created a new tool, which we called DockTope, validated over a wider group of experimental data (135 structures in respect to the 46 structures previously published). This tool allows any user to model its own pMHC-I complex trough a user-friendly web interface. Also, a molecular dynamics study performed using modeled pMHC-I complexes through DockTope allowed us to infer important variables involved on complex stabilization. The results presented here encompass several knowledge areas, favoring the vaccine development and propelling the knowledge and understanding of immunologic events.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glucocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo nas células e a uma estimulação crônica do sistema imune. Células natural killer (NK) possuem um papel importante na resposta imune e sua atividade é alterada na DG. Os receptores KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptors) regulam a atividade das células NK através da interação com moléculas de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I das célulasalvo. Objetivo: Analisar a variabilidade dos genes KIR em uma coorte de pacientes com DG do Sul do Brasil, compará-las a um grupo controle e buscar associações com manifestações clínicas. Metodologia: Trinta e um pacientes com DG tipo I (24 com forma leve, 4 com forma moderada e 3 com forma grave) foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis quanto a frequência dos genes HLA e KIR. Resultados/Discussão: Não houve diferença significativa nas frequências de variantes dos genes KIR entre os grupos. O alelo HLA B37 é mais frequente nos pacientes com DG do que no grupo controle (p=0,011). A idade de início dos sintomas mostrou associação com a combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O alelo DR11 parece estar associado a comprometimento neurológico, enquanto o alelo DR13 ao desenvolvimento de osteonecrose. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a DG. Devem ser estudadas em outras coortes de pacientes já que parecem ser um fator modificador de fenótipo. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of a lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the cells and a chronic stimulation of the immune system. Natural Killer (NK) cells play an important role in the immune response, and their activity is impaired in GD. Killer immunoglobulin-like receptors (KIR) regulate the activity of NK cells through an interaction with specific human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on target cells. Objectives: To analyze the variability of KIR genes in a Southern Brazilian sample of GD patients, to compare it with controls, and to look for associations with clinical manifestations. Methodology: Thirty one GD type I patients (24 mild, 4 moderate, and 3 severe) were analyzed and compared to 250 healthy controls regarding the frequency of HLA and KIR genes. Results/Discussion: There was no significative difference in the frequencies of KIR gene variants between the groups. The HLA B37 allele is more frequent in patients with GD than in control group (p=0.011). The age of onset of symptoms was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with the ligand HLA-C1 (p=0.038). Patients who have the HLA-C2 variant appear to have more mono/polyclonal bands in protein electrophoresis (p=0.007, OR=21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. The DR11 allele appears to be associated with neurological impairment, while the DR13 allele to the development of osteonecrosis. Conclusion: Our data suggest a possible association between KIR genes and HLA genes and GD. They should be studied in other cohorts of GD patients as they seem to be a phenotype modifying factor.

O sistema imunológico é formado por um conjunto de células e moléculas envolvidas primariamente na defesa do organismo contra agentes infecciosos. Neste sentido, destaca-se a ação das proteínas codificadas pela região do MHC-I, as quais são responsáveis pela apresentação de pequenos peptídeos (normalmente entre 8 e 12 aminoácidos), gerados a partir da via de processamento endógeno, para Receptores de Células T (TCRs) citotóxicas. As bases moleculares subjacentes à apresentação de peptídeos no contexto das moléculas de MHC-I ainda não foram totalmente esclarecidas, principalmente em função da complexidade inerente a esse processo biológico. Sabe-se, no entanto, que padrões moleculares presentes na área de interação do pMHC-I com o TCR, bem como a estabilidade dos complexos pMHC-I na superfície celular, são fatores determinantes para a imunogenicidade de diferentes complexos. Com o nascimento e desenvolvimento da bioinformática, uma grande evolução foi observada na área, especialmente no que tange ao estudo de sequências lineares de genes e proteínas. Entretanto, o estudo a nível estrutural ainda é lento, especialmente devido ao limitado número de estruturas tridimensionais resolvidas experimentalmente e à falta de modelos acurados. Assim sendo, esta tese se propôs a automatizar e otimizar uma ferramenta de modelagem de complexos pMHC-I (técnica D1-EM-D2) e, posteriormente, criar uma protocolo para avaliar a estabilidade in silico de complexos pMHC-I, com foco na interação entre epitopo e MHC-I. Como resultado, criamos uma nova ferramenta, a qual chamamos DockTope, validada sobre um conjunto mais amplo de dados experimentais (135 estruturas em relação às 46 estruturas do estudo anterior). Esta ferramenta permite que qualquer usuário modele seu próprio pMHC-I, através de uma interface web acessível. Ainda, um estudo via dinâmica molecular realizado com base nos complexos pMHC-I modelados a partir do DockTope nos permitiu inferir algumas das variáveis envolvidas na estabilização dos complexos. Os resultados apresentados aqui contemplam várias áreas de conhecimento da área biológica, favorecendo o desenvolvimento de vacinas mais racionalizadas e alavancando o conhecimento e a compreensão de eventos imunológicos. / The immunologic system is constituted by a group of cells and molecules involved mainly in the organism defense against infectious agents. In this way, the action of proteins encoded by the MHC-I region should be highlighted, since they are responsible for the presentation to T Cell Receptors (TCRs) of small peptides (normally 8 to 12 amino acids in length) generated by the endogenous processing pathway. The molecular bases underlying the presentation of peptides in the context of MHC-I molecules are not fully understood, especially because the complexity inherent to this process. However, it is known that molecular patterns presented in the TCR-interaction surface of each pMHC-I, as well as complex stability on cellular surface, are pivotal factors to determine immunogenicity. The bioinformatics development brings together a great evolution in the field, especially in respect to the analysis of genes and proteins sequences. Yet, the structural study is still delayed, mainly because we have a limited number of threedimensional structures experimentally resolved and there is a lack of accurate models. In this way, we aimed to automatize and optimize a bioinformatics tool to pMHC-I modeling (D1-EM-D2 approach) and, posteriorly, to create an in silico protocol to evaluate the pMHC-I complex stability, focusing on the interaction between epitope and MHC-I. As a result, we created a new tool, which we called DockTope, validated over a wider group of experimental data (135 structures in respect to the 46 structures previously published). This tool allows any user to model its own pMHC-I complex trough a user-friendly web interface. Also, a molecular dynamics study performed using modeled pMHC-I complexes through DockTope allowed us to infer important variables involved on complex stabilization. The results presented here encompass several knowledge areas, favoring the vaccine development and propelling the knowledge and understanding of immunologic events.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glucocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo nas células e a uma estimulação crônica do sistema imune. Células natural killer (NK) possuem um papel importante na resposta imune e sua atividade é alterada na DG. Os receptores KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptors) regulam a atividade das células NK através da interação com moléculas de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I das célulasalvo. Objetivo: Analisar a variabilidade dos genes KIR em uma coorte de pacientes com DG do Sul do Brasil, compará-las a um grupo controle e buscar associações com manifestações clínicas. Metodologia: Trinta e um pacientes com DG tipo I (24 com forma leve, 4 com forma moderada e 3 com forma grave) foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis quanto a frequência dos genes HLA e KIR. Resultados/Discussão: Não houve diferença significativa nas frequências de variantes dos genes KIR entre os grupos. O alelo HLA B37 é mais frequente nos pacientes com DG do que no grupo controle (p=0,011). A idade de início dos sintomas mostrou associação com a combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O alelo DR11 parece estar associado a comprometimento neurológico, enquanto o alelo DR13 ao desenvolvimento de osteonecrose. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a DG. Devem ser estudadas em outras coortes de pacientes já que parecem ser um fator modificador de fenótipo. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of a lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the cells and a chronic stimulation of the immune system. Natural Killer (NK) cells play an important role in the immune response, and their activity is impaired in GD. Killer immunoglobulin-like receptors (KIR) regulate the activity of NK cells through an interaction with specific human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on target cells. Objectives: To analyze the variability of KIR genes in a Southern Brazilian sample of GD patients, to compare it with controls, and to look for associations with clinical manifestations. Methodology: Thirty one GD type I patients (24 mild, 4 moderate, and 3 severe) were analyzed and compared to 250 healthy controls regarding the frequency of HLA and KIR genes. Results/Discussion: There was no significative difference in the frequencies of KIR gene variants between the groups. The HLA B37 allele is more frequent in patients with GD than in control group (p=0.011). The age of onset of symptoms was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with the ligand HLA-C1 (p=0.038). Patients who have the HLA-C2 variant appear to have more mono/polyclonal bands in protein electrophoresis (p=0.007, OR=21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. The DR11 allele appears to be associated with neurological impairment, while the DR13 allele to the development of osteonecrosis. Conclusion: Our data suggest a possible association between KIR genes and HLA genes and GD. They should be studied in other cohorts of GD patients as they seem to be a phenotype modifying factor.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-08T18:51:33Z No. of bitstreams: 2 TESE Karla Melo Ferreira da Silva.pdf: 1666106 bytes, checksum: 97af293d3c921dfa31c9ea61b5104700 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T18:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Karla Melo Ferreira da Silva.pdf: 1666106 bytes, checksum: 97af293d3c921dfa31c9ea61b5104700 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Facepe / A obesidade é uma epidemia mundial com alta prevalência e patologias associadas. Nas mulheres têm sido encontrados os mais altos índices, além da possível influência da estrutura corporal e dos hormônios nas comorbidades. O excesso de tecido adiposo está relacionado a vários distúrbios da saúde, como a imunodeficiência e alteração nas células sanguíneas. A promoção de obesidade em roedores a partir de dietas hiperlipídicas almeja reproduzir o comportamento nutricional humano. Este tem sido considerado o modelo de indução da obesidade que mais se assemelha a realidade em humanos. O objetivo do estudo foi analisar em ratas o modelo de indução de obesidade através de consumo de dieta hipercalórica e hiperlipídica por diferentes períodos e seu efeito em parâmetros antropométricos, imunológicos e hematológicos. 64 ratas da linhagem Wistar recém desmamadas foram divididas nos grupos: controle (dieta padrão) e obeso (dieta hiperlipídica). Cada dieta foi consumida por quatro, oito, doze e dezesseis semanas. Foram avaliados: consumo alimentar e calórico; peso corporal; antropometria; gordura abdominal; análises bioquímicas; taxa de fagocitose; contagem de células do lavado broncoalvolar e hemograma. Os obesos consumiram menos alimento, mas o consumo energético manteve-se maior que os controles. A obesidade imposta em todos os períodos de consumo aumentou o peso corporal, gordura abdominal, triglicerídeos e glicose. A avaliação antropométrica mais relacionada à obesidade foi a circunferência abdominal. O grupo obeso apresentou mais leucócitos totais alveolares, com menor percentual de macrófagos e menor taxa de fagocitose. A obesidade alterou a quantidade de hemácias em todos os tempos estudados. As plaquetas só foram afetadas com oito semanas de dieta hiperlipídica e a quantidade dos leucócitos totais do sangue não foi alterada pela obesidade. Diante dos resultados, conclui-se que a dieta hipercalórica e hiperlipídica consumida entre quatro e dezesseis semanas é útil em induzir obesidade em ratas fêmeas Wistar. A escolha do tempo de consumo da dieta deve depender do objetivo do estudo, pois as análises bioquímicas são dependentes desse tempo. Nem todas as análises murinométricas são fidedignas à obesidade imposta por dieta, destaca-se a circunferência abdominal como medida mais relacionada. A obesidade prejudica a função imune e altera o perfil das células hematológicas de ratas, mas o grau destas alteração também é dependente do tempo de consumo da dieta obesogênica.