La listeriosis murina experimental se caracteriza por la rápida llegada de leucocitos, especialmente neutrófilos (PMNNs) y macrófagos a los órganos diana de la infección, hígado y bazo. El rápido reclutamiento de estas células a los focos de infección es vital para el control inicial de la infección. Las lesiones nerviosas en la listeriosis murina experimental se caracterizan por la afluencia masiva de PMNNs hacia las meninges y al sistema ventricular. Sin embargo, de la misma manera que el rápido reclutamiento de estas células a los focos de infección es vital para el control inicial de la infección, no se puede excluir la posibilidad de que el reclutamiento de PMNNs en el sistema nervioso central contribuya al desarrollo de las lesiones nerviosas mediante la liberación de mediadores inflamatorios y/o participando a la vehiculación y diseminación de la listerias. Uno de los objetivos principales de este trabajo doctoral fue el estudio de la expresión de las moléculas de adhesión endotelial E-selectina, P-selectina e ICAM-1 en el transcurso de la listeriosis murina experimental y determinar la correlación entre la expresión de dichas moléculas y las lesiones inflamatorias observadas. Asimismo, se intentó elucidar la importancia de los PMNNs en la patogenia de las lesiones nerviosas mediante la utilización del anticuerpo monoclonal RB6-8C5, el cual depleciona específicamente la población de PMNNs in vivo .La estandarización de las técnicas inmunohistoquímicas para la detección de las moléculas de adhesión endotelial E-selectina, P-selectina e ICAM-1 en tejidos de ratón fijados en formol e incluidos en parafina fue llevada a cabo mediante la caracterización de su expresión en ratones normales y en un modelo de activación endotelial por lipopolisacárido bacteriano. E-selectina fue únicamente detectada tras activación endotelial en la mayoría de los órganos. ICAM-1fue detectada de forma constitutiva en células endoteliales de todos los órganos estudiados y su expresión fue sobre-regulada tras activación con lipopolisacárido. Estos resultados están en concordancia con los resultados obtenidos previamente por otros autores en tejidos congelados.En el modelo murino de listeriosis, tanto P-selectina como ICAM-1 fueron inducidas y/o sobre-expresadas rápidamente tras la infección. E-selectina fue detectada únicamente de forma espóradica en este modelo. Tras esta primera fase de activación endotelial inespecífica, la sobre-expresión de estas moléculas estuvo asociada a la presencia de lesiones inflamatorias en los órganos diana de la infección, especialmente hígado, órganos linfoides secundarios y SNC. En el hígado, la aparición de las lesiones inflamatorias está correlacionada con la expresión de ICAM-1 en los sinusoides hepáticos y de P-selectina e ICAM-1 en las venas centrolobulillares y en los vasos situados en el espacio porta. La lesiones esplénicas estuvieron asociadas a la expresión de ICAM-1 en la zona marginal de la pulpa blanca. En los linfonodos inflamados, P-selectina e ICAM-1 fueron detectadas en las venas de endotelio alto. En el SNC, las lesiones iniciales consistieron en una leptomeningitis purulenta asociada a una fuerte expresión endotelial de P-selectina e ICAM-1 en vénulas del espacio subaracnoideo, especialmente en aquellas situadas en la fisura del hipocampo. La aparición de ventriculitis y/o coroiditis purulentas en nuestro modelo fue un fenómeno posterior a la presencia de meningitis y está asociado a una intensa expresión de ICAM-1 las células epiteliales coroideas y en las células ventriculares así como en el endotelio de vasos periventriculares. La depleción de PMNNs mediante la administración del anticuerpo monoclonal RB6-8C5 durante la listeriosis murina experimental facilitó la multiplicación de Listeria monocytogenes en el SNC pero aparentemente no previno o interfirió su acceso al encéfalo. Estas observaciones sugieren que los PMNN tienen una función esencial en la prevención del acceso y/o la multiplicación de L. monocytogenes en el SNC. / Systemic murine listeriosis is characterized by the rapid influx of leukocytes, especially neutrophils but also macrophages, into the site of initial bacterial replication, especially the liver and spleen. Neutrophils play a critical role in reducing the bacterial burden in these organs. Neutrophils are also the main inflammatory cell present in meningitis, ventriculitis/choroiditis and rombencephalitis that develop during the course of human and experimental murine listeriosis. Recruited neutrophils are thought to contribute to the elimination of L. monocytogenes, although they could also be involved in the development of progressive brain injury via the release of harmful mediators and/or participating in the dissemination of Listeria . The aim of this study was to detect by immunohistochemistry the expression of the endothelial adhesion molecules E-selectin, P-selectin and ICAM-1 during the course of experimental murine listeriosis and to determine if correlation existed between the expression of these adhesion molecules and the inflammatory infiltrate in the target organs. In addition, the role of neutrophils in the development of the lesions in the central nervous system (CNS) was studied by the in vivo administration of the neutrophil-depleting antibody RB6-8C5. Immunohistochemical techniques to detect ICAM-1, P-selectin and E-selectin in formalin-fixed, paraffin embedded tissues were developed using standard antigen unmasking protocols. The distribution and pattern of expression of E-selectin and ICAM-1 in normal and lipopolysaccharide-stimulated mice was described. No constitutive expression of E-selectin was found in any of the normal tissues investigated. In stimulated animals, E-selectin expression was detected on endothelial cells in most evaluated organs. ICAM-1 was constitutively expressed, and was upregulated in all the organs after LPS inoculation. The results paralleled previous studies where immunohistochemistry on frozen sections was used. During the course of experimental murine listeriosis, a strong up-regulation of P-selectin and ICAM-1 occurred rapidly after the infection. E-selectin was faint and inconstantly detected in all the studied organs. The expression of these adhesion molecules was correlated with the recruitment of leukocytes, especially to the liver, lymphoid organs and CNS. In the liver, typical lesions of murine listeriosis were related to the expression of ICAM-1 on sinusoidal endothelial cells, and to the de novo expression of P-selectin in hepatic portal vessels. Inflammation in the spleen was related to the expression of ICAM-1 on red pulp sinusoidal cells, especially in the marginal sinus. High endothelial venules of inflamed lymph nodes also expressed P-selectin and ICAM-1. In the CNS, the expression of P-selectin and up-regulation of ICAM-1 in meningeal vessels, especially in those located in the hippocampal sulcus, was associated with the initial meningeal inflammation and suggest that neutrophils probably reach the CNS through these vessels during experimental murine listeriosis. Leptomeningitis was followed by the presence of ventriculitis, which was related to the up-regulation of ICAM-1 on choroid plexus epithelial cells, periventricular vessels and ependimal cells.Administration of the neutrophil-depleting antibody RB6-8C5 during experimental murine listeriosis enhanced or facilitated multiplication of L. monocytogenes as well as lesion formation in the CNS of infected mice. Thus, neutrophils not only play a key role in host defense against L. monocytogenes infection in the limiting early bacterial multiplication in the liver and the spleen, but they are also crucial in eliminating bacteria that gain access to the CNS compartment.

La guanilil ciclasa sensible a NO (GCNO) cataliza la formación de GMPc y es la principal diana del NO en el SNC. La GCNO es un heterodímero compuesto por una subunidad α y una β. Dos isoformas de cada subunidad han sido clonadas. En esta tesis estudiamos la distribución anatómica de los mRNAs de las subunidades en cerebro de rata y mono. Nuestros resultados revelan que en ambas especies el mRNA de la β1 es más abundante y ubicuo en cerebro. El mRNA de la subunidad β2 no pudo ser detectado en ninguna de las dos especies. La distribución de las subunidades α presentó similitudes en el sistema límbico y en caudado-putamen de ambas especies y diferencias en la distribución laminar en corteza. Mientras que en rata la subunidad α1 es elevada en capas externas corticales, en mono lo es en las capas internas. Además, el mRNA de α1 es más ubicuo en el mono y el mRNA de la α2 en la rata.Una elevada expresión de las tres subunidades se observó en ganglios basales, sistema olfatorio, hipocampo y corteza. También encontramos regiones donde la expresión de la subunidad β1 era alta y pero la expresión de ambas α era baja o indetectable. En la rata, esto ocurre en las islas de Calleja, la mayoría de los núcleos talámicos y el colículo superior, y en mono ocurre en los núcleos talámicos y en el claustrum. El sistema NO-GMPc ha sido implicado en plasticidad sináptica, procesamiento sensorial y comportamiento en la rata, los niveles elevados de las tres subunidades en regiones como los ganglios basales, hipocampo y cerebelo en mono sugieren que en primates también estaría involucrado en estos procesos.Estudios previos demostraban que agentes inflamatorios disminuían la actividad GCNO como consecuencia de la disminución de la subunidad β1 en astrocitos en cultivo y en cerebro de ratas adultas. En este trabajo estudiamos si la actividad GCNO también estaba alterada en cerebro de pacientes con enfermedades neurodegenerativas con un componente inflamatorio como Alzheimer (AD), Creytzfeldt-Jakob (CJ) y esclerosis múltiple (MS). Los resultados demuestran que no existen diferencias significativas entre los individuos control y los enfermos AD con distinto grado de afectación en la actividad basal GCNO o estimulada con donadores de NO, ni en los niveles de expresión de las subunidades β1 y α1. Mediante inmunocitoquímica demostramos que las neuronas y en astrocitos de sustancia blanca presentan un nivel de expresión elevado para la β1. En pacientes AD, los niveles de expresión no estan alterados en neuronas y astrocitos fibrilares mientras que se detectó disminución de β1 en astrocitos reactivos alrededor de las placas amiloides. El marcaje se ve también disminuido en astrocitos reactivos de sustancia blanca de pacientes con CJ y MS. Así, la inducción de la reactividad glial está asociada a una disminución en la capacidad de generar GMPc en respuesta a NO. Estudios previos demostraban que la disminución de la subunidad β1 inducida por LPS era dependiente de transcripción y síntesis de proteínas, pero independiente de NO. En esta tesis estudiamos el mecanismo involucrado en la degradación de esta subunidad, siendo la vía que involucra al proteosoma y la ubiquitina responsable de la disminución. También, demostramos que el tratamiento con LPS produce la formación de agregados de β1 en el núcleo, en estructuras ricas en proteosoma 20S y ubiquitina con características de clastosomas. La formación de estos agregados es inhibida por inhibidores específicos del proteosoma y de la síntesis de proteínas. Durante estos estudios observamos la presencia de β1 en células con actividad GCNO (neuronas y astrocitos), así como en células sin actividad GCNO (microglía). En ambos casos la localización era mayoritariamente citosólica pero también aparecía en el núcleo. La intensidad de marcaje aumentaba en células en división. A mayor aumento observamos que β1 se encontraba asociada periféricamente a los cromosomas durante todas las fases de la mitosis. Debido a la localización pericromosomal, nos propusimos estudiar si la β1 ejercía alguna función sobre la condensación de la cromatina. Mediante un ensayo de condensación in vitro demostramos que la inmunodepleción de la proteína nuclear y citoplasmática provocaba aumento en la condensación. También demostramos que el silenciamiento de β1 por siRNA producía un aumento del número de células que ingresaban en el ciclo celular y un aumento de la proliferación. Todos estos efectos fueron independientes de la actividad enzimática ya que un inhibidor especifico de la GCNO no mimetizaba los efectos del siRNA ni de la inmunodepleción. Estos resultados nos llevan a proponer que la subunidad β1 de la GCNO podría tener una función independiente de su actividad enzimática. / Nitric oxide (NO) exerts most of its physiological effects through activation of a predominantly soluble guanylyl cyclase (sGC). In mammalian cells sGC exists as a heterodimer of α and β subunits. Currently, four subunits (α1-2 and β1-2) have been characterized. We used in situ hybridization with subunit-specific 33P-labeled oligonucleotide probes to compare the anatomical distribution of sGC subunit mRNAs in rat and monkey brains. Message for all subunits except β2 was detected in both species. The sGC subunit showing the highest expression and widest distribution was β1. High expression for all subunits was found in basal ganglia, olfactory system, hippocampus, cortex, and cerebellum. Minor species differencesin the relative distribution of α subunits were observed. In general, the α1 message was more prominent in monkey brain and the α2 message in rat brain. This was more evident in limbic areas and cerebellar cortex. Some differences were also observed in subunit laminar distribution in cerebral cortex. The limited species differences in sGC subunit distribution suggest that in primates, as occurs in rodents, the NO-cGMP signaling pathway will be involved in important brain functions such as memory formation, sensory processing, and behavior.In Alzheimer's disease (AD) brains increased NO synthase (NOS) expression is found in reactive astrocytes surrounding amyloid plaques. We have recently shown that treatment with β-amyloid peptides or IL-1B down-regulates GCNO in cultured astrocytes and in adult rat brain. In this work, we have examined GCNO activity and expression in postmortem brain tissue of AD patients and matched controls. No significant alteration was observed in basal or NO-stimulated GCNO activity, nor in GCNO β1 and α1 subunit levels in cortical extracts of AD brains. Immunohistochemistry showed intense and widespread labeling of GCNO β1 in cortical and hippocampal neurons and white matter fibrillar astrocytes, while grey matter astrocytes were faintly stained. In AD, expression of GCNO in neurons and fibrillar astrocytes is not altered but is markedly reduced in reactive astrocytes surrounding amyloid plaques. Immunostaining for GCNO β1 was also lacking in reactive astrocytes in cortex and subcortical white matter in Creutzfeldt-Jakob disease brains and in subacute and chronic plaques in multiple sclerosis (MS) brains. Thus, induction of astrocytes reactivity is associated with decreased capacity to generate cGMP in response to NO both in vitro and in vivo. This effect may be related to the development of the astroglial inflammatory responseWe previously showed that treatment with bacterial cell wall lipopolysaccharide (LPS) or proinflammatory cytokines decreases GCNO activity in astrocytes by decreasing the half-life of the obligate GCNO β1 subunit in a NO-independent but transcription- and translation-dependent process. Here we show that LPS-induced β1 degradation requires proteasome activity and is independent of NFκB activation or inhibition of β1 interaction with HSP90. Immunocytochemistry and confocal microscopy revealed that LPS promotes co-localization of the predominantly soluble β1 protein with ubiquitin and the 20S proteasome in nuclear aggregates that present characteristics of clastosomes, nucleoplasmic substructures involved in ubiquitin-proteasome-dependent nuclear proteolysis. Proteasome and protein synthesis inhibitors prevented LPS-induced clastosome assembly and nuclear colocalization of β1 with ubiquitin and 20S proteasome strongly supporting a role for these transient nuclear structures in GCNO down-regulation during neuroinflammation.Functional GCNO exists as α1/β1 and α2/β1 heterodimers and is predominantly cytosolic, although recent studies indicate that it can associate to membranes and other intracellular structures including nuclei. In the CNS, in situ hybridization studies evidenced that β1 is more widespread than α subunits and that in some areas is almost the only GCNO subunit expressed, suggesting that it may have functions other than GCNO activity. In the course of our studies on the cellular and sub-cellular distribution of GCNO in rat CNS glial cells we found that the β1 subunit is localized in the cytoplasm and the nucleus of cells expressing α subunits and GCNO activity (astrocytes, C6 glioma), as well as in cells devoid of α subunits and GCNO activity (microglia). In both cell types β1 associates peripherally to chromosomes during all phases of mitosis. In C6 cells, immunodepletion of β1 enhances chromatin condensation in an in vitro assay. Moreover, silencing β1 by siRNA increases the percentage of cells that enter the cell cycle and the proliferation rate. These actions are not mimicked by treatment with a specific GCNO inhibitor (ODQ). We postulate that the β1 subunit is a multifunctional protein that, in addition to its role as an obligate monomer in active GCNO, associates to chromosomes during mitosis and regulates chromatin condensation and cell cycle progression.

En la presente Tesis Doctoral estudiamos los circuitos neuronales que median los efectos de la ghrelina sobre las neuronas CRF hipofisiotrópicas del NPV y el eje HHA. Esperamos que el esclarecimiento de estos circuitos pueda ayudar a entender cómo funcionan y cómo se integran la homeostasis energética y el estrés. Así como también, contribuir al desarrollo de futuras terapias que intenten manipular las acciones de la ghrelina.

Introducción: nuestro conocimiento actual de la anatomía de la sustancia blanca cerebral es muy limitado. Material y Métodos: se estudiaron 15 especímenes de autopsias frescas. Se realizó disección de fibras con preservación cortical. Se estudiaron 4 voluntarios sanos mediante tractografía por tensor de difusión (DTI) con un escáner de RM de 3.0 Teslas. Resultados: en este trabajo se evidenció que el fascículo uncinado atraviesa el tercio anterior del istmo temporal, mientras que el fascículo fronto-occipital inferior (FFOI) atraviesa los dos tercios posteriores del istmo temporal. Se identificaron dos componentes del FFOI: (i) porción superficial y dorsal, y (ii) porción profunda y ventral. Por último, se aislaron tres segmentos del componente perisilviano del fascículo longitudinal superior (FLS): (A) porción horizontal, (B) porción vertical, y (C) el fascículo arcuato. Conclusiones: en este trabajo se presenta una nueva técnica de disección de fibras, esta técnica permite aislar los tractos de sustancia blanca, respetando al mismo tiempo la estructura cerebral durante todas las etapas de la disección.

Han sido propuestos numerosos métodos para identificar y cuantificar anomalías precoces en la enfermedad de Parkinson idiopática de reciente comienzo. Estos test motores mayormente examinan velocidad, tiempo de reacción y precisión entre otras funciones. Además, son analizadas la ejecución de planes complejos tanto automáticos como aprendidos, por ejemplo de habla o escritura. La mayoría de estas intervenciones, que revelaron diferencias significativas entre pacientes con enfermedad de Parkinson idiopática y los controles, se basan en mediciones estandarizadas de los signos y síntomas durante la evaluación clínica. El U.P.D.R.S. (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale), la más ampliamente difundida, se desarrolló en 1987 sobre la base de las escalas disponibles en la época, incluyendo la de Webster y la de Columbia. Consiste en tres secciones principales: estado cognitivo y del humor, actividades de la vida diaria al interrogatorio, y función motora al exámen clínico. Una cuarta sección se ocupa de pacientes con complicaciones derivadas de la levodopa, y se desprenden subescalas para signos parkinsonianos específicos (temblor, rigidez, bradicinesia e inestabilidad postural). Representa el instrumento de monitoreo más utilizado en la evaluación de la severidad de los síntomas parkinsonianos por parte del especialista tanto en investigación como en la práctica clínica, con un grado de fiabilidad y eficacia ampliamente estudiada. Efectivamente, se ha argumentado que todo trastorno del movimiento debe ser inicialmente derivado al especialista abocado a los mismos. Esto puede ser una aspiración idealista, pero las largas esperas para la atención ambulatoria hospitalaria en el sector público de salud torna difícil su cumplimiento. Una alternativa pragmática consistiría en que los pacientes que presentase una enfermedad de Parkinson clásica con buena respuesta medicamentosa a la levodopa pueden ser inicialmente asistidos por el clínico en el primer nivel de atención, pero aquellos comienzos en la juventud o con alguna característica atípica deberán siempre ser derivados al especialista.

La presente tesis doctoral se sustenta en la metodología enfermera atendiendo a los lenguajes estandarizados NANDA Internacional, Clasificación de Intervenciones de Enfermería (NIC) y Clasificación de Resultados de Enfermería (NOC). OBJETIVOS Objetivo general: evaluar las intervenciones de enfermería en los cuidados a mujeres con diagnóstico enfermero ansiedad, de modo que nos permita generar conocimiento enfermero útil en la práctica clínica en salud mental. Objetivos específicos: 1) identificar cambios en el autocontrol de la ansiedad y de la sintomatología ansiosa antes y después de recibir las intervenciones de enfermería en el plan de cuidados grupal a mujeres con ansiedad, 2) conocer el perfil sociodemográfico de las mujeres que reciben los cuidados de enfermería centrados en el diagnóstico ansiedad y 3) dotar a las pacientes de recursos para un mejor manejo de la ansiedad, a través de la intervención enfermera en educación sanitaria, impartida en las intervenciones enfermeras grupales. METODOLOGÍA Se trata de un estudio de corte cuantitativo pre-experimental pre-test-post-test, con la pretensión de evaluar un plan de cuidados de ansiedad desde un contexto grupal en mujeres con diagnóstico enfermero ansiedad. La muestra de estudio está compuesta por las pacientes que tras la valoración de enfermería por Patrones Funcionales de Salud (FPS) de Gordon, adaptados por Fornés para la práctica clínica en salud mental, en consulta individual de enfermería, presenten el diagnóstico enfermero ansiedad. Se emplea como instrumentos de evaluación, la valoración enfermera por PFS y los criterios de resultado enfermero (NOC) nivel de ansiedad (1211), autocontrol de la ansiedad (1402) y conocimiento: conducta sanitaria (1805) antes y después del citado plan. La evaluación consiste en el estudio del estado de ansiedad medido con los indicadores de los criterios de resultado mencionados, los parámetros físicos estudiados y los PFS. Se utiliza la prueba no paramétrica de los rangos con signo de Wilcoxon y estadísticos descriptivos. RESULTADOS Los resultados de la investigación muestran que el patrón adaptación-tolerancia al estrés mejora en todas las pacientes tras las intervenciones enfermeras, presentando mejoría o funcionalidad en los datos de valoración del patrón. Así también, atendiendo al carácter interdependiente de los PFS se muestran hallazgos de mejoría basados en los datos de valoración en otros FPS. Tal y como arrojan los datos estadísticos, la respuesta humana de las pacientes medida con los tres criterios de resultado enfermero, mejora tras recibir las intervenciones enfermeras propuestas, obteniéndose resultados estadísticamente significativos. Así, podemos reconocer respuestas con un menor estado de ansiedad y mejor autocontrol mediante la adquisición de estrategias de adaptación saludables. CONCLUSION Podemos decir que la implementación de las intervenciones de enfermería en un grupo de mujeres con diagnóstico ansiedad ha mejorado la sintomatología previa. La herramienta enfermera NOC nos ha permitido medir el estado de las pacientes a lo largo del proceso de cuidados y nos ha facilitado conocer la utilidad de las intervenciones enfermeras en el marco de la salud mental. Los resultados de enfermería nos orientan no solamente para cuantificar el estado, conducta o percepción del paciente como centro de nuestros cuidados, sino también aporta beneficios para aumentar el corpus de conocimientos de la enfermería desde la especialidad de salud mental basada en evidencias clínicas. La relación enfermera-paciente es un aspecto esencial del proceso de cuidados terapéutico, que ayuda a las mujeres en el manejo de la respuesta de ansiedad. Las intervenciones enfermeras han propiciado un cambio en la capacidad de afrontamiento, que les ha llevado a tomar conciencia de los síntomas fisiológicos y de la necesidad de aprender a manejar su respuesta de ansiedad de manera más funcional. / ABSTRACT This dissertation is based on NANDA international, nursing intervention classification (NIC) and nursing outcome classification (NOC) standardized nursing languages. OBJECTIVES The purpose of this study is to evaluate nursing interventions in the care of women with anxiety nursing diagnosis, so that allows us to generate useful nursing knowledge in our clinical practice from specialty mental health. Specific objectives: 1) to identify changes in the anxiety self-control and anxious symptomatology before and after receiving nursing interventions in the care plan group for women with anxiety, 2) to determine sociodemographic profile of women receiving nursing care focused on anxiety nursing diagnosis, 3) to provide patients a better resource for anxiety management through the nurse education intervention given during nursing interventions group. METHODOLOGY This investigation used a quantitative design pre-experimental, pre-test-post-test, in order to assess the usefulness of a plan of care anxiety in a group setting for women with anxiety nursing diagnosis. The study sample consisted of the patients with anxiety nursing diagnosis according to Gordon’s functional health patterns adapted by Fornés for clinical practice in mental health nursing in nursing consultation. Nursing tools Gordon's functional health patterns, anxiety level (1211), anxiety self-control (1402) and knowledge: health behavior (1805) nursing outcomes are used before and after performing the anxiety care planning. The nursing interventions are evaluated using nursing outcome indicators, physical parameters and functional health patterns. Wilcoxon signed rank test and descriptive statistics were used. RESULTS The research results show that the coping-stress tolerance pattern improves or becomes functional in all patients after nursing interventions. Likewise, in response to the independent nature of the FHP, improvements in other patterns are found. The study has identified a statistically significant improvement in all three nursing outcomes studied. Consequently, we can recognize responses with lower anxiety state and better anxiety self-control by acquiring healthy coping strategies. CONCLUSIONS We can assert that the implementation of nursing interventions in a women group with anxiety nursing diagnosis has improved their previous symptoms. Nurse NOC tool allowed us to measure patient status during the nursing process. NOC help us to understand the usefulness of nursing interventions in mental health setting. Palabras Clave: Patient Care Planning, Anxiety Nursing Diagnosis, Nursing Assessment, Nursing Process, Psychiatric Nursing, Nursing Research. Materia: 6. Ciencias aplicadas. 616. Patología general, terapéutica. 616.8. Psiquiatría 614. Sanitad Pública, enfermería y enfermería de salud mental. Área de conocimiento: Enfermería y Enfermería especialista de Salud Mental. Derechos: ADVERTENCIA. El acceso a los contenidos de esta tesis doctoral y su utilización debe respetar los derechos de la persona autora. Puede ser utilizada para consulta o estudio personal, así como en acción y docencia en los términos establecidos en el art. 32 del Texto Refundido de la Ley de Propiedad Intelectual (RDL 1/1996). Para otros usos se requiere la autorización previa y expresa de la persona autora. En cualquier caso, en la utilización de sus contenidos se deberá indicar de forma clara el nombre y apellidos de la persona autora y el título de la tesis doctoral. No se autoriza su reproducción u otras formas de explotación efectuadas con fines lucrativos ni su comunicación pública desde un sitio ajeno al servicio TDR. Tampoco se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al contenido de la tesis como a sus resúmenes e índices.

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las propiedades reforzantes del etanol en el sistema nervioso central (SNC), que se postula son responsables de la auto-administración repetida de alcohol, se deben al aumento de la liberación de dopamina, inducido por el etanol, en el núcleo accumbens, área del sistema mesolímbico inervada por neuronas del área tegmental ventral. Esta acción parece estar mediada por su metabolito primario, el acetaldehído, producido en el cerebro por la oxidación del etanol a través de dos sistemas enzimáticos alternativos: la catalasa cerebral y el citocromo p450 2E1 (CYP2E1). Las ratas se autoadministran tanto etanol como acetaldehído directamente en el área tegmental ventral. La concentración necesaria para producir efectos reforzantes es menor para el acetaldehído que para el etanol, indicando que este metabolito del alcohol es un agente reforzante más potente que el etanol. El acetaldehído se puede condensar con la dopamina formando una mezcla de salsolinol e isosalsolinol. Las ratas se autoadministran salsolinol comercial (que contiene entre un 8 % y un 15 % de isosalsolinol) directamente en el área tegmental ventral. Las concentraciones autoadministradas son aún menores que las de acetaldehído, indicando una mayor potencia del salsolinol (y/o del isosalsolinol) como agente reforzante. Tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los enantiómeros R y S. En el cerebro, el salsolinol sería producido por al menos tres vías: 1) condensación no enzimática del acetaldehído con dopamina, que produce la mezcla racémica de (R,S)-salsolinol y, posiblemente en menor proporción, una mezcla racémica de (R,S)- isosalsolinol; 2) condensación enzimática del acetaldehído con la dopamina, que produciría preferencialmente (R)-salsolinol y 3) condensación enzimática del ácido pirúvico con dopamina seguido de descarboxilación del producto, lo cual produciría preferencialmente (R)-salsolinol. No existe claridad acerca de cuál de los isómeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, específicamente, cuál de los enantiómeros - R o S - de estos compuestos es el que tiene una mayor actividad biológica. Para poder determinar cuál de los isómeros presentes en el salsolinol comercial -(R)- salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol o (S)-isosalsolinol- es el que tiene una mayor actividad biológica y para poder profundizar en los efectos que tiene el consumo de etanol sobre la producción de ellos in vivo, es necesario poder contar con metodologías que permitan la producción de estos isómeros en forma separada y a su vez que permitan cuantificarlos en muestras de origen biológico. En este sentido, los principales resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron los siguientes: (i) Se desarrolló una metodología de HPLC de apareamiento iónico en columna de gel de sílice-C18 acoplada a detector electroquímico capaz de separar y cuantificar dopamina, salsolinol e isosalsolinol en aproximadamente 30 min. En este sistema, la dopamina eluye primero (13,0 min. aprox.) seguida del salsolinol y el isosalsolinol (14,4 min. aprox y 26,1 min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de estos analitos en concentraciones desde 10-8 M. (ii) Se estableció que las sustancias separadas mediante HPLC de apareamiento iónico a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol (tiempo de retención 14,4 min. aprox.) e isosalsolinol (tiempo de retención 26,1 min. aprox) sobre la base de que: a) El tiempo de retención de SC1 (14,4 min. aprox.) es menor que el tiempo de retención de SC2 (26,1 min. aprox.) y, teóricamente, cabe esperar que el salsolinol eluya antes que el isosalsolinol por tener sus grupos hidroxilo más disponibles para interactuar con la fase móvil. b) La razón entre las áreas de los picos del salsolinol comercial SC1 (tiempo de retención 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retención 26,1 min. aprox.) se corresponde con los porcentajes de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) en el salsolinol comercial determinados por 1H-RMN. c) El peso molecular de las sustancias separadas a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, se corresponde con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol (179 g/mol). (iii) Se determinó que la dopamina se degrada (posiblemente por autoxidación) en solución a pH 7,4 de acuerdo a una cinética de orden cero, mientras que el salsolinol y el isosalsolinol lo hacen de acuerdo a una cinética de orden uno, siendo la velocidad de oxidación del isosalsolinol 10 veces mayor que la del salsolinol. (iv) Se desarrolló una metodología de HPLC de fase inversa en columna de gel de sílice modificado con β-ciclodextrina capaz de separar y cuantificar dopamina, (R)- salsolinol y (S)-salsolinol en aproximadamente 40 minutos. En este sistema, la dopamina eluye primero (22,9 min. aprox) seguida de (S)-salsolinol (26,9 min. aprox.), (R)-salsolinol (29,9 min. aprox.) y el (R) y (S)-isosalsolinol (31,3 y 32,9 min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de dopamina, (S)- salsolinol y (R)-salsolinol en concentraciones desde 10-8 M. Si bien el isosalsolinol pudo ser separado de dopamina y de los enantiómeros R y S del salsolinol, no se logró separar completamente los enantiómeros R y S del isosalsolinol entre sí. A futuro, estas metodologías permitirán la detección y cuantificación de los enantiómeros en muestras de origen biológico y la administración selectiva de un enantiómero específico directamente en el cerebro de las ratas, ampliando así los conocimientos que se tienen sobre las propiedades reforzantes del etanol como una prodroga y cómo éstas pueden ser mediadas por el salsolinol / The reinforcing properties of ethanol in the central nervous system (CNS), believed to be responsible for the repeated self-administration of ethanol, are due to the increase of dopamine release -induced by ethanol- in the nucleus accumbens, a part of the mesolimbic system innerved by neurons from the ventral tegmental area. This action of ethanol seems to be mediated by its primary metabolite, acetaldehyde, which is produced in the brain from ethanol oxidation by two alternative enzymatic systems: brain catalase and cytochrome p450 2E1 (CYP2E1). Rats selfadminister both ethanol and acetaldehyde directly into the ventral tegmental area. The concentration needed to produce the reinforcing effects is lower for acetaldehyde than for ethanol, suggesting that this metabolite is a more powerful reinforcing agent than ethanol. Acetaldehyde can condense with dopamine to form salsolinol and isosalsolinol. Rats selfadminister commercially available salsolinol (which contains between 8% to 15% of isosalsolinol) directly in the ventral tegmental area. The concentrations of salsolinol selfadministered are even lower than acetaldehyde concentrations, suggesting that salsolinol (and/or isosalsolinol) is an even more powerful reinforcing agent. Both salsolinol and isosalsolinol have a chiral center and exist as the R and S enantiomers. In brain, salsolinol could be produced by at least three pathways. 1) non-enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine, which produces a racemic mixture of R and S salsolinol and possibly, to a lesser extent, a racemic mixture of R and S isosalsolinol; 2) enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine which would produce, preferentially, (R)-salsolinol and 3) enzymatic condensation of pyruvic acid with dopamine followed by decarboxylation of the condensation product wich would produce, preferentially, (R)-salsolinol. There is no clarity about which of the isomers, salsolinol or isosalsolinol (or both), is primarily responsible for the observed reinforcing properties, nor, specifically, about which of the enantiomers –R or S- of these compounds has a greater biological activity. In order to determine which of the isomers present in comercially available salsolinol –(R)- salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol and (S)-isosalsolinol- has stronger biological activity and in order to better understand the effects of ethanol consumption on the in vivo synthesis of these isomers, methodologies that allow us to produce these substances independently and methodologies that allow us to quantify them in biological samples are needed. In relation to this, the main results obtained in this thesis were the following: (i) An ion pairing HPLC methodology using a silicagel-C18 column coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, salsolinol and isosalsolinol in approximately 30 min., was developed. By this methodology, dopamine elutes first (13.0 min. approx.) followed by salsolinol and isosalsolinol (14.4 min. approx. and 26.1 min. approx.), allowing a good separation and quantification of these analytes in concentrations above 10-8 M. (ii) The substances separated by ion pairing HPLC from commercially available salsolinol correspond to salsolinol (retention time of 14.4 min. approx.) and isosalsolinol (retention time of 26.1 min. approx.). This was established on the basis that: a) The retention time of SC1 (14.4 min. approx.) is lower than the retention time of SC2 (26.1 min. approx.) and, theoretically, it is expected that salsolinol elutes before than isosalsolinol because salsolinol has its hydroxyl groups more available to interact with the mobil phase than isosalsolinol. b) The ratio between the areas of the peaks observed for commercially available salsolinol SC1 (retention time of 14.4 min. approx.) and SC2 (retention time of 26.1 min. approx.) is in agreement with the expected percentages of salsolinol (92%) and isosalsolinol (8%) in the commercially available salsolinol as determined by 1H-NMR. c) The molecular weight of the substances separated from commercially available salsolinol, SC1 and SC2, is the same as the molecular weight of salsolinol and isosalsolinol (179 g/mol). (iii) It was determined that dopamine degradation (possibly by autoxidation) at pH 7.4 follows zero order kinetics, while salsolinol and isosalsolinol oxidations follow first order kinetics. The rate of oxidation of isosalsolinol is about 10 times higher than the rate of oxidation of salsolinol. (iv) A reversed phase HPLC methodology using a silicagel-β-cyclodextrin coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, (R)-salsolinol and (S)-salsolinol in about 40 minutes, was developed. In this methodology, dopamine elutes first (22.9 min. approx.), followed by (S)-salsolinol (26.9 min. approx.), (R)- salsolinol (29.9 min. approx.) and (R) and (S)-isosalsolinol (31.3 and 32.9 min. approx.), allowing a good separation and quantification of dopamine, (S)-salsolinol and (R)-salsolinol in concentrations above 10-8 M. Although this methodology succeeded in separating isosalsolinol from dopamine and from the R and S enantiomers of salsolinol, it was unable to completely resolve (R)-isosalsolinol from (S)-isosalsolinol. In the future, these methodologies will allow the detection and quantification of these regioisomers and enantiomers in biological samples and will allow the selective administration of a specific enantiomer directly into rat brain, extending our knowlegde on the reinforcing properties of ethanol as a prodrug and on how these properties may be mediated by salsolinol

Este libro es el primer tratado en español sobre neuropéptidos, campo de las neurociencias que se viene desarrollando considerablemente y que seguirá haciéndolo en el futuro. En ese sentido, investigadores de diversas disciplinas se dedican al estudio de los neuropéptidos aplicando métodos cada vez más sofisticados, ya que se trata de moléculas del sistema nervioso involucradas en la fisiología normal y en un gran número de patologías. Avances en Neurociencia. Neuropéptidos: investigación básica y clínica transmite y organiza muchos de los conocimientos generales y especializados que se disponen actualmente sobre los neuropéptidos. Así, constituye una herramienta de fácil uso para el apoyo interdisciplinario en temas neurocientíficos. La presente obra está dirigida no solo a especialistas en neurociencia, sino también a estudiantes de últimos años de licenciatura en diversas especialidades de ciencias de la salud y afines, así como a estudiantes de postgrado que deseen introducirse en esta especialidad. De esta manera, resulta una referencia bibliográfica útil para docentes e investigadores dedicados a temas del sistema nervioso, dado que presenta una recopilación ordenada de numerosos trabajos de investigación publicados en revistas y libros especializados. Se trata, en suma, de un texto que va de la mano con los últimos avances en el campo del sistema nervioso y que contribuye para seguir desarrollando y generando conocimiento en esta disciplina.

El sistema nervioso está formado por una compleja red de billones de neuronas que utilizan señales específicas para comunicarse entre sí. La sinapsis química es una unión funcional entre neuronas en la que el neurotransmisor liberado por una de ellas interactúa específicamente con proteínas de membrana de la otra, los receptores postsinápticos. Los receptores de la familia cys-loop, que incluye al receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR, nicotinic acetylcholine receptor), son miembros de la superfamilia de los canales pentaméricos activados por ligando (pLGICs, pentameric ligand-gated ion channels). Están formados por cinco subunidades iguales - receptores homoméricos - o diferentes - receptores heteroméricos -. Los receptores poseen un dominio extracelular, que contiene los sitios de unión al agonista localizados entre dos subunidades adyacentes; un dominio transmembrana, que forma el canal y contiene sitios alostéricos para la acción de moduladores; y un dominio intracelular, de importancia en la conductancia del canal y en su modulación intracelular. El receptor α7 es el prototipo de receptor homopentamérico de la familia de los nAChRs. Es uno de los nAChRs más abundantes en el sistema nervioso, aunque también se encuentra presente en otros tejidos. En neuronas modula la liberación de neurotransmisores e induce respuestas estimulatorias, contribuyendo a la cognición, el procesamiento de la información sensorial y la memoria. En tejidos no neuronales está involucrado en inmunidad, inflamación y neuroprotección. Debido a sus múltiples funciones, emerge actualmente como nuevo blanco terapéutico para desórdenes neurológicos e inflamatorios. En el primer capítulo de este trabajo de tesis exploramos el rol funcional de una subunidad truncada del receptor α7 específica de humanos, dupα7. Dicha subunidad, que carece de una región del dominio N-terminal extracelular que comprende parte del sitio de unión al ligando, se encuentra asociada con desórdenes neurológicos e inmunomodulación. Utilizando expresión heteróloga en células de mamífero en conjunto con microscopía de fluorescencia y registros de electrofisiología mediante la técnica de patch clamp, determinamos que: i) dupα7 no es capaz de formar homopentámeros funcionales activables por acetilcolina o por un agonista alostérico; ii) La subunidad dupα7 puede combinarse con la subunidad α7 para formar heteropentámeros de diferentes estequiometrías, con características cinéticas similares a las del receptor α7; iii) Es necesaria la presencia de al menos dos subunidades α7 ubicadas en forma consecutiva en el heteropentámero para que los receptores sean funcionales; iv) La expresión conjunta de dupα7 y α7 disminuye la disponibilidad de sitios de unión al agonista, reduciendo la sensibilidad de los receptores. En forma global, nuestros resultados muestran que la subunidad dupα7 posee un rol modulador negativo sobre la actividad del receptor α7. En el segundo capítulo, se evaluó la modulación de los péptidos β-Amiloide 1-40 y 1-42 sobre el receptor α7. Dichos péptidos poseen un rol fundamental en la enfermedad de Alzheimer, dado que su acumulación excesiva en el cerebro provoca la formación de placas seniles, a partir de las cuales se desarrolla un proceso de neurodegeneración e inflamación. Sin embargo, evidencias más recientes sugieren que son las formas oligoméricas de β-Amiloide las especies más neurotóxicas. Empleando estudios espectrofluorimétricos y la técnica de patch clamp demostramos que: i) Los oligómeros β-Amiloide provocan cambios conformacionales en el receptor α7 que pueden ser detectados por la sonda conformacional cristal violeta; ii) Los oligómeros de péptidos β-Amiloide son capaces de activar al receptor α7 en concentraciones del orden picomolar o nanomolar bajo; iii) Los oligómeros β-Amiloide reducen la potenciación de α7 por moduladores alostéricos positivos (PAMs, positive allosteric modulators) a concentraciones del orden nanomolar o micromolar bajo; iv) La reducción de la potenciación causada por los péptidos β-Amiloide no es específica del tipo de modulador alostérico positivo. Estos resultados demuestran un rol dual, dependiente de la concentración, de los oligómeros de β-Amiloide como agonistas y como moduladores negativos de α7. El efecto inhibitorio podría contribuir al deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer. Por último, en el tercer capítulo se evaluó la acción del ion Ca2+ como modulador alostérico positivo de α7. Existen reportes sobre cationes divalentes que actúan como moduladores de los pLGICs, variando su efecto según el tipo de receptor. Sobre α7, el ion Ca2+ actúa como un PAM, pero la base mecanística de esta acción no ha sido explorada. Combinando registros de corrientes macroscópicas y de canal único en las configuraciones cell-attached e inside-out de la técnica de patch clamp demostramos que: i) La presencia del ion Ca2+ extracelular potencia la respuesta macroscópica a acetilcolina y a colina dependiendo de la concentración de agonista; ii) La ausencia de Ca2+ en la solución extracelular disminuye la frecuencia de apertura del canal y aumenta levemente la corriente unitaria; iii) El mecanismo por el cual el ion Ca2+ potencia la respuesta al agonista es compatible con el aumento de la probabilidad de apertura del canal. De este modo, identificamos el mecanismo asociado a la acción moduladora de calcio sobre el receptor α7. Nuestros resultados contribuyen al entendimiento de la modulación del receptor α7 por una subunidad proteica asociada con enfermedades neurológicas, por péptidos amiloides producidos en patologías neurodegenerativas y por el catión Ca2+, todos procesos de relevancia en la señalización colinérgica en el sistema nervioso central. / The nervous system is formed by a complex net of billions of individual neurons that use specific signals to communicate with each other. The chemical synapse is a functional union between neurons in which the neurotransmitter released by one neuron interacts specifically with integral membrane proteins of the other neuron: the postsynaptic receptors. The receptors of the cys-loop family, that includes the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), are members of the superfamily of the pentameric ligand-gated ion channels family (pLGICs). They are formed by five identical - homopentameric receptors - or different subunits – heteropentameric receptors -. The receptors have an extracellular domain, which contains the agonist binding sites that are located between two adjacent subunits; a transmembrane domain that forms the channel and contains allosteric sites for the action of modulators; and an intracellular domain, important for the conductance of the channel and modulation. The α7 receptor is a homopentamer of the nAChRs family. It is one of the most abundant nAChRs in the nervous system and is also present in cells of other tissues. In neurons, it modulates the neurotransmitters release and induces stimulatory responses, thus contributing to cognition, sensory information processing and memory. In non-neuronal tissues, it is involved in immunity, inflammation and neuroprotection. Because of its multiple functions, it is emerging as a new therapeutic target for neurologic and inflammatory disorders. In the first chapter of this thesis we evaluated the functional role of a human-specific truncated subunit of the α7 receptor, dupα7. This subunit, which lacks part of the N-terminal extracellular ligand-binding domain, is associated with neurological disorders and immunomodulation. Using heterologous expression of heteropentamers in mammalian cells combined with fluorescence microscopy and patch clamp recordings, we determined that: i) dupα7 is not able to form functional receptors activated by acetylcholine or an allosteric agonist; ii) dupα7 subunits can combine with α7 subunits to form heteropentamers of different stoichiometries, with similar kinetic properties to those of α7; iii) the presence of at least two α7 subunits located consecutively in the heteropentamer forming an agonist binding site is necessary for functional heteropentamers; iv) the co-expression of dupα7 and α7 decreases the availability of agonist binding sites, reducing the sensibility of the receptors. Overall, our results show that dupα7 has a negative modulatory role on the activity of the α7 receptor. In the second chapter, we evaluated the modulation of α7 receptor by Amyloid- β 1-40 and 1-42 peptides. These peptides play a fundamental role in Alzheimers’ disease since their excessive accumulation in the brain causes the formation of senile plaques, from which a process of neurodegeneration and inflammation develops. More recent evidence suggests that the oligomeric forms of amyloid- β are the most neurotoxic species. Using spectrofluorimetric and electrophysiological studies we demonstrated that: i) The amyloid-β peptides cause conformational changes on the α7 receptor that can be sensed by the crystal violet conformational probe; ii) The oligomers of the amyloid-β peptide are capable of activating the α7 receptor at picomolar or low nanomolar concentrations; iii) The oligomers of the amyloid-β peptide reduce α7 potentiation by positive allosteric modulators (PAMs) at nanomolar or low-micromolar concentrations; iv) The reduction in the potentiation caused by the amyloid-β peptides is not specific of the PAM type. Our results demonstrate a dual role of the amyloid- β oligomers as agonists and negative modulators of α7, depending on the concentration. The inhibitory effect could contribute to the cognitive impair associated to Alzheimer’s disease. Last, in the third chapter we evaluated the action of the Ca2+ cation as a PAM of α7. Divalent cations have been reported to modulate different pLGICs, varying their effects with the receptor type. On α7, Ca2+ acts as a PAM, but the mechanistic basis of this action has not been explored yet. Combining macroscopic and single-channel current recordings in the cell-attached and inside-out patch clamp configurations, we demonstrated that: i) Extracellular Ca2+ potentiates the macroscopic responses to ACh and choline and the level of potentiation is dependent on the agonist concentration; ii) The absence of extracellular calcium diminishes the frequency of channel opening and slightly increases the unitary current; iii) The mechanism by which Ca2+ enhances the response to the agonist is compatible with an increase of the channel opening probability. Our results contribute to the understanding of the molecular actions at α7 of a truncated protein subunit associated with neurological diseases, of amyloid peptides produced in neurodegenerative pathologies and of the Ca2+ cation, which are all relevant modulatory processes of the cholinergic pathway at the central nervous system.

El sistema endocannabinoide es un sistema de comunicación celular que regula diversas funciones fisiológicas en una amplia variedad de células del organismo. Los principales endocannabinoides son el 2-araquidonoilglicerol (2-AG) y la anandamida (AEA). Los endocannabinoides en el sistema nervioso central (SNC) funcionan como mensajeros retrógrados. Se sintetizan en los terminales postsinápticos a partir de diferentes vías, son liberados al espacio sináptico y ejercen su efecto por unión a receptores ubicados en los terminales presinápticos, principalmente inhibiendo la liberación de neurotransmisores. Entre las numerosas funciones que tienen los endocannabinoides en el SNC, se destaca su rol neuroprotector frente a enfermedades neurodegenerativas. La Enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las mayores causas de demencias, cuya etiología se atribuye al péptido beta amiloide (βA) que se agrega formando primeramente oligómeros y luego fibrillas que se depositan en forma de placas amiloides. Las enfermedades neurodegenerativas tienen en común que se presentan generalmente en individuos de edad avanzada por lo que se las relaciona íntimamente con el envejecimiento. Se sabe que los endocannabinoides regulan numerosos procesos celulares y moleculares relacionados con el envejecimiento. En base a esto, los principales objetivos de esta Tesis Doctoral fueron: determinar el metabolismo de los endocannabinoides en el proceso de envejecimiento fisiológico y patológico, y estudiar la modulación de este metabolismo por agonistas y antagonistas de receptores cannabinoides. Los estudios fueron realizados en fracciones de membrana y soluble, y en sinaptosomas de la corteza cerebral (CC) de rata, una de las regiones del cerebro en la que el sistema endocannabinoide ejerce su rol neuroprotector. Los resultados del metabolismo del 2-AG y de la AEA en el envejecimiento mostraron que existe una desregulación del mismo tanto en los terminales sinápticos como en las membranas de las células de la CC. Con respecto al 2-AG, se observó que su síntesis en la CC de rata se produce por la acción de las enzimas lisofosfatidato fosfohidrolasa (LPAasa) y diacilglicerol lipasa (DAGL). A su vez, la hidrólisis de este endocannabinoide en los terminales sinápticos de la CC de ratas adultas y seniles así como en membranas de ratas adultas, se produce principalmente por la acción de la enzima monoacilglicerol lipasa (MAGL). Sin embargo, en membranas de la CC de ratas seniles la enzima serina hidrolasa con dominios α/β (ABHD) sería la principal involucrada. En la CC, la desregulación del metabolismo del 2-AG observada en ratas seniles se inclina hacia una disminución de este endocannabinoide, lo cual comprometería su función neuroprotectora. En cuanto a la AEA, se determinó que su hidrólisis tanto en los terminales sinápticos como en las membranas de la CC, es a través de la enzima ácido graso amidohidrolasa (FAAH). A su vez, se observó que el envejecimiento ejerce un efecto diferente en la degradación de la AEA ya sea que se tratara de las membranas celulares o de los terminales sinápticos. En las membranas de ratas seniles, se observó que la hidrólisis de este endocannabinoide aumenta, lo cual podría comprometer la función antiinflamatoria de la AEA en la CC. Por otra parte, en los terminales sinápticos se observó que la hidrólisis de la AEA disminuye en el envejecimiento, lo cual podría proteger al cerebro frente a los daños neurodegenerativos propios de la edad. Al analizar los niveles de los receptores CB1 y CB2, se observó que ambos disminuyen en los terminales sinápticos durante el envejecimiento. Teniendo en cuenta estos resultados además de la alteración observada en el metabolismo de los endocannabinoides, se propuso evaluar la regulación de la síntesis y/o de la degradación de los endocannabinoides mediante el uso de agonistas y antagonistas de los receptores cannabinoides. Estos estudios mostraron que los antagonistas de receptores CB1 y CB2 aumentarían la disponibilidad del 2-AG y de la AEA en los terminales sinápticos de la CC de ratas seniles. Por otra parte, los agonistas de estos receptores, especialmente del CB2, aumentarían la disponibilidad de la AEA tanto en terminales sinápticos como en membranas de células de la CC de ratas seniles. Para estudiar la hidrólisis de los endocannabinoides en estadios tempranos y tardíos de la EA, se preincubaron los sinaptosomas de la CC con el péptido βA1-40 en sus conformaciones de oligómeros (etapas tempranas de la EA) y fibrillas (etapas tardías de la EA). Estos estudios mostraron que la hidrólisis del 2-AG y de la AEA disminuye en el modelo de EA temprana, por lo que los niveles de ambos endocannabinoides se verían aumentados protegiendo a la célula frente a procesos neurodegenerativos. Sin embargo, en el modelo de EA tardía, se observó que la hidrólisis de la AEA disminuye mientras que la degradación del 2-AG aumenta drásticamente comprometiendo los efectos neuroprotectores atribuidos a este endocannabinoide. En conclusión, los resultados de esta Tesis Doctoral indican que el metabolismo de los endocannabinoides se encuentra desregulado tanto en el envejecimiento fisiológico como en el patológico, lo cual pone en peligro sus funciones neuroprotectoras, y que la modulación de este metabolismo en la senescencia puede darse a través de agonistas y/o antagonistas de los receptores CB1 y/o CB2. / The endocannabinoid system is a cell communication mechanism which regulates several physiological functions in a variety of cells. 2-arachidonoylglycerol (2-AG) and anandamide (AEA) are the main endocannabinoids known to date. In the central nervous system (CNS) endocannabinoids behave as retrograde messengers. They are synthesized by different pathways in postsynaptic endings, released to the synaptic clef, and they finally exert their functions by coupling to cannabinoid receptors located in presynaptic endings, thus inhibiting neurotransmitter release. Among the several functions assigned to endocannabinoids in the CNS, is their role as neuroprotective agents against several neurodegenerative diseases. Alzheimer Disease (AD) is one of the major causes of dementia and its etiology is thought to be due to the aggregation of β-amyloid peptide (βA) which firstly generates oligomers and subsequently fibril deposits known as amyloid plaques. One of the most common factors of neurodegenerative diseases is aging due to the fact that they usually occur in old people. Several studies have in fact shown that endocannabinoids participate in the modulation of numerous cellular and molecular processes related to aging. In view of this, the main purposes of this Ph. D. Thesis were to: analyze endocannabinoid metabolism in the physiological and pathological aging process, and to study the modulation of this metabolism by cannabinoid receptor agonists and antagonists. These studies were carried out in rat cerebral cortex (CC) membrane and soluble fractions and synaptosomes, a brain area in which endocannabinoids exert their neuroprotective role. 2-AG and AEA hydrolysis and/or synthesis assays in synaptic endings and also in membranes from CC cells during aging showed a deregulation of their metabolism. As to 2-AG, it could be observed that its synthesis in rat CC was carried out by the enzymes lysophosphatidate phosphohydrolase (LPAase) and diacylglycerol lipase (DAGL). Furthermore, its hydrolysis in CC synaptic endings of adult and aged rats and in CC membranes of adult rats was exerted mainly by the enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL). However, in CC membranes of aged rats the main enzyme involved was α/β serine hydrolase domain (ABHD). Deregulation of 2-AG metabolism in CC was observed to favor the decrease of these endocannabinoid levels, though compromising its neuroprotective role. As to AEA, these studies demonstrated that its hydrolysis either in CC synaptic endings or in CC membranes was carried out by the enzyme fatty acid amide hydrolase (FAAH). In addition, a different effect in AEA breakdown between cell membranes and synaptic endings was observed as a result of aging. In aged CC membranes, its hydrolysis was observed to increase. This could, in turn, compromise AEA antiinflamatory role in CC. On the other hand, AEA hydrolysis in synaptic endings during aging was observed to decrease, possibly protecting the brain against neurodegenerative damages inflicted by aging. Assays of CB1 and CB2 receptors levels in aged synaptic endings showed they were lower than in adults. Based on these results and on the disarrangement observed in endocannabinoid metabolism, regulation of endocannabinoid hydrolysis and/or synthesis by cannabinoid receptor agonists and antagonists were then assayed. These studies showed an increased 2-AG and AEA availability in CC synaptic endings of aged rats as a result of the presence of CB1 and CB2 receptor antagonists. On the other hand, cannabinoid receptor agonists, particularly through CB2, increased AEA availability either in synaptic endings or cell membranes from CC of aged rats. Endocannabinoid hydrolysis in early and late AD stages was assayed by preincubating CC synaptosomes with βA1-40 peptide in different conformations: oligomers (mimicking early AD stages) and fibrils (mimicking late AD stages). These studies showed that 2-AG and AEA hydrolysis in the early AD model diminished, thus indicating that both endocannabinoid levels could be increased and therefore protect the cell against neurodegenerative processes. Moreover, in the late AD model AEA hydrolysis decreased while 2-AG breakdown highly increased, thus compromising the neuroprotective role assigned to 2-AG. Summing up, results from this Ph. D. Thesis show a deregulation in endocannabinoid metabolism either in physiological or pathological aging, which could, in turn, lead to a failure of their neuroprotective functions, and a modulation of this metabolism as a result of aging, which could be exerted by CB1 and/or CB2 receptor agonists and/or antagonists.