O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

Orientador: Erick Leite Bastos / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2012.

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-25T13:58:14Z No. of bitstreams: 2 Corandin, Eduardo Mazon.pdf: 1586087 bytes, checksum: a88d04d645e03b0daee5a9fb5d261156 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-26T11:16:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Corandin, Eduardo Mazon.pdf: 1586087 bytes, checksum: a88d04d645e03b0daee5a9fb5d261156 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-26T11:16:12Z (GMT). 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For each of these groups were added cysteine in different concentrations 0, 2.5, 5.0 and 7.5 mM, so were made the respective experimental groups Control, Cys2.5, Cys5.0 and Cys7.5. The fresh semen was stored in room temperature during two hours, the cooled semen was stored among four to eight hours in 16ºC and the frozen semen was stored into liquid nitrogen. The analyzed variables to the fresh and cooled semen were motility, vigor, viability and mitochondrial potential of the spermatozoids. To the frozen semen, the parameters evaluated were the plasmatic and acrossomal membranes integrity, kinect by the computer system (CASA) and the mitochondrial potential. The group Cys7.5 showed the highest values of motility in the fresh semen (73.50%), however there was not different (p>0.05) than the group Cys5.0 in the cooled semen after four (68.00 vs 66.50%) and eight hours (57.00 vs 55.00%). For the frozen semen, the addition of 7.5 mM cysteine promoted the highest percentage of spermatozoids with integrate plasmatic membrane (23.2%), followed by the Cys5.0 group (20.0%), however there was not statistic different (p<0.05) among the group in the acrosomal integrity. The addition of cysteine in the frozen extender promoted increased in the capacity of mobility to the spermatozoa. There was not difference (p>0.05) among the groups Cys5.0 and Cys7.5 mM for the variables average-path (VAP), straight-line (VSL) and curvilinear velocity (VCL), however the concentration of 7.5 mM cysteine was more efficient in the protection of plasmatic membrane and increased the beat/cross frequency (BCF). / O uso de sêmen conservado é uma prática pouco difundida na ovinocultura nacional, e ainda apresenta resultados insatisfatórios de prenhez. Por isso, a adição de antioxidantes aos diluidores para preservar a qualidade seminal após sua manipulação tem sido alvo de muitas pesquisas. Sendo assim, objetivou-se avaliar o efeito in vitro da adição de diferentes concentrações do antioxidante cisteína ao meio diluente no sêmen ovino mantido fresco, refrigerado e congelado. Após a colheita e análise individual, o sêmen de seis carneiros formaram um pool, iguais alíquotas deste foram diluídas em PBS (sêmen fresco), Equimix® (sêmen refrigerado) ou Bovimix® (sêmen congelado), e adicionado 0, 2.5, 5.0 e 7.5 mM de cisteína para formar os respectivos grupos experimentais: Controle, Cys2.5, Cys5.0 e Cys7.5. O sêmen fresco foi mantido em temperatura ambiente durante duas horas, o sêmen refrigerado permaneceu durante quatro e oito horas à 16°C e o sêmen congelado foi armazenado em nitrogênio líquido. As variáveis analisadas do sêmen fresco e refrigerado foram motilidade, vigor, viabilidade e potencial mitocondrial dos espermatozoides. Avaliaram-se no sêmen congelado a integridade de membrana plasmática e acrossomal, cinética espermática computadorizada e potencial mitocondrial. O grupo Cys7.5 apresentou os maiores valores de motilidade no sêmen fresco (73,50%), porém não diferiu (p>0,05) com o grupo Cys5.0 no sêmen refrigerado após quatro (68,00 vs 66,50%) e oito horas (57,00 vs 55,00%). No sêmen congelado, a adição de 7.5 mM de cisteína promoveu maior porcentagem de espermatozoides com a membrana plasmática íntegra (23,2%), seguido pelo grupo Cys5.0 (20,0%), más não houve diferença estatística (p>0,05) entre os grupos na integridade acrossomal. A adição de cisteína ao diluente de congelação promoveu aumento na capacidade de deslocamento dos espermatozoides. Não houve diferença (p>0,05) entre os grupos Cys5.0 e Cys7.5 para as variáveis velocidade de trajeto (VAP), velocidade retilínea (VSL) e velocidade curvilínea (VCL), porém a concentração de 7.5 mM de cisteína foi mais eficiente na proteção da membrana plasmática e promoveu maior frequência de batimento flagelar (BCF).

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 701042 bytes, checksum: b85885438fd65389b8e2f78343e8a481 (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Ex situ conservation strategies aim to assist in maintaining a genetically viable population through strategies of assisted reproduction and cryopreservation of genetic resources. We aimed to validate the combination of fluorescents probes and the egg-sperm binding assay using cryopreserved oocytes in the qualification of fresh and frozen-thawed ocelot semen. Were used three captive ocelots for semen collection by electroejaculation. The semen was evaluated by conventional tests routine. Through those tests (motility and sperm progressive motility, hypoosmotic sweling test and morphology) a decrease (p <0.05) of the quality standards of the frozen-thawed semen compared to fresh semen was observed. The combination of the probes propidium iodide, Hoechst 33342 and Pisum sativum Agglutinin lectin conjugated to fluorescent (FITC-PSA) allowed the identification of sperm subpopulations according to the specific location of cell damage and at the same time allowed a more accurate detection of the deleterious effect of semen cryopreservation in ocelots. The use of cryopreserved oocytes of domestic cats allowed the observation of a decreasing on the binding capacity (p <0.05) of frozen-thawed sperm compared to fresh ocelot spermatozoa, and there was a correlation between total binding in fresh semen with the quality standards in frozen-thawed semen. The combination of fluorescent probes used and the use of sperm-egg binding assay were more specific and reliable in detecting the decrease in ocelot s sperm quality after thawing. The ocelot sperm were also able to bind the perivitelline membrane, in both treatments. Although there is no difference in the amount of bound sperm in treatments (p>0.05), there was a positive correlation (r=0.91; p<0.05) between they. Correlation was also observed between bound sperm to periviteline membrane, in fresh and frozen=thawed semen, and bent tail spermatozoa in frozen-thawed semen (r=0.81; p<0.05 and r=-0.86; p<0.05, respectively). There was correlation (r=-0.71; p<0.05) between the proportion of tightly bent tail (major defect) and the bound sperm to periviteline membrane, both in frozen-thawed semen. Although ocelots spermatozoa have bound satisfactorily to periviteline membrane, the small number of sample could not demonstrate correlation with the sperm fertility. However, the device developed for the membrane allowed the upkeep of its stretch during processing and defined an evaluation area. Thus, futures studies, with a larger sample are needed for effective validation of this technique. / Estratégias de conservação ex situ objetivam auxiliar na manutenção de populações geneticamente viáveis, por meio de estratégias de reprodução assistida e criopreservação de materiais genéticos. Objetivou-se a validação do uso de combinação de sondas fluorescentes e do teste de ligação à zona pelúcida de ovócitos heterólogos criopreservados na qualificação de sêmen fresco e descongelados de jaguatiricas. Foram usadas três jaguatiricas mantidas em cativeiro, sendo obtidos ejaculados por meio de eletroejaculação e avaliados por testes clássicos de rotina. Através destes testes (vigor e motilidade espermáticos, hiposmótico e morfologia) observou-se queda (p<0,05) dos padrões qualitativos do sêmen descongelado em relação ao sêmen fresco. A associação das sondas Iodeto de Propídeo, Hoechst 33342 e Pisum Sativum Agglutinin conjugada com Lectina Fluorescente (FITC-PSA), permitiu a identificação de subpopulações espermáticas de acordo com a localização específica de lesões celulares e detectou de forma mais acurada o efeito deletério da criopreservação no sêmen. O uso de ovócitos criopreservados de gatas domésticas permitiu a observação da queda da capacidade ligante (p<0,05) dos espermatozoides descongelados em relação aos espermatozoides a fresco de jaguatiricas, havendo ainda correlação entre o total de ligantes nas amostras de espermatozoides a fresco com padrões qualitativos no sêmen após o descongelamento. A combinação de sondas fluorescentes utilizadas e o uso de ensaio de ligação a ovócitos heterólogos criopreservados de gatas domésticas foram mais específicos e confiáveis na detecção da queda na qualidade espermática de jaguatiricas após o descongelamento. Os espermatozóides de jaguatiricas também foram capazes de se ligar à membrana perivitelínica em ambos os tratamentos. Apesar de não observada diferença na quantidade de espermatozóides ligados nos tratamentos (p>0,05), houve correlação positiva (r= 0,91; p<0,05) entre eles. Foi observada ainda correlação negativa entre a taxa de espermatozoides ligados na membrana perivitelínica no sêmen a fresco e no descongelado com a população de espermatozóides com cauda dobrada no sêmen descongelado (r= -0,81; p<0,05 e r= -0,86; p<0,05, respectivamente) e correlação negativa (r= -0,71; p< 0,05) entre a população de espermatozóides com cauda fortemente dobrada (defeito maior) com a quantidade de espermatozóides ligados na membrana perivitelínica, ambos no sêmen descongelado. Apesar dos espermatozoides de jaguatirica terem se ligado de forma satisfatória à membrana perivitelínica, o reduzido número de amostras avaliadas não permitiu demonstrar correlação com a fertilidade do espermatozoide. No entanto, o mecanismo suporte desenvolvido para a membrana permitiu a manutenção do seu estiramento durante o processamento e a definição de uma área de avaliação. Sendo assim, estudos futuros, com uma maior amostragem, são necessários para a efetiva validação desta técnica.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 769007 bytes, checksum: 123ccd2617d8acc65ce78c0ab0679b66 (MD5) Previous issue date: 2012-05-09 / Several populations of wild carnivores are threatened with extinction, mainly due to fragmentation of habitats and low genetic variability of geographically isolated populations. Ex situ conservation strategies, like assisted reproduction and cryopreservation of gametes intended to assist the maintenance of viable populations. Cryopreservation process of male gametes, however, causes damages to cells, which are measured in order to evaluate methodologies and handling techniques to, therefore, increase the viability of reproduction with endangered species in captivity, using assisted reproduction. The study aimed to assess qualitatively the fresh and thawed semen of oncilla (Leopradus tigrinus) using a combination of fluorescent probes and tests of sperm binding to heterologous oocytes of domestic cats and the perivitelline layer of chicken egg. It was used a single individual of oncilla which was anesthetized by anesthesic of ketamine (10 mg / kg) and xylazine (1.2 mg / kg). The semen was collected by electroejaculation and evaluated to the physical aspects (color, appearance and volume) and were also carried out routine tests as follows: sperm motility, spermatic vigor, concentration of spermatozoa in the ejaculate, morphology and hypoosmotic test. Subsequently, the semen was cryopreserved in French straws at a concentration of 20 x 106 motile sperm / ml in TRIS medium based on citrate, 20% of egg yolk and final concentration of 6% glycerol and 0.5% Equex. To asses the integrity of the plasma and acrosomal membrane it was used a combination of three fluorescent probes, propidium iodide, Hoechst 33342 and agglutinin Pisium sativum isoticionato conjugated (FITC-PSA). For binding tests of sperm it was used oocytes of domestic cat and perivitelline layer of chicken eggs, semen was co-incubated at 0.5 x 106 mobile spermatozoa / ml in maintenance medium TCM 199 modified and incubated at 38 ° C at atmospheric pressure of 5% CO 2 for one hour. The ejaculates obtained presented satisfactory medial values for vigor and motility (4.33% and 80.0%, respectively), however, decreased this values in frozen-thawed semen (p <0.05). The fresh ejaculate was presented with values of sperm pathologies below in relation of values observed in other studies with fresh semen of oncilla (19%), the thawed semen increased values of defective cells (p <0.05), due exclusively to the increase in larger defects. The percentage of cells reactive to the hypoosmotic test was lower (p <0.05) in frozen-thawed semen compared to fresh semen (13.0% and 71.66%, respectively). The probes association of propidium iodide, Hoescht 33342 and FITC-PSA was effective to distinguish different subpopulations of sperm in one ejaculation, but there was a difficulty in identifying the staining by FITC-PSA in combination with H342. The population with the intact plasmatic and acrosomal layers decreased (p <0.05) in frozen-thawed semen compared to fresh semen and increased the population with damaged plasmatic layer and intact acrosome layer, which was inversely proportional to motility between these two treatments. For binding tests of oncilla sperm to heterologous oocyte and periviteline layer, both fresh and thawed semen showed adhesion to the substrates and decrease (p <0.05) in number of sperm adhered to the oocyte membrane of the thawed semen. The qualitative methods of sperm evaluation using fluorescent probes associations and binding assays of sperm with heterologous oocytes and perivitelline layers of chicken´s egg proved useful in the evaluation of fresh and thawed semen of oncilla. / Diversas populações de carnívoros silvestres encontram-se ameaçados de extinção, principalmente devido à descaracterização de habitats e a baixa variabilidade genética de populações geograficamente isoladas. Estratégias de conservação ex situ, dentre as quais se encontram a reprodução assistida e criopreservação de gametas visam auxiliar a manutenção de populações viáveis. O processo de criopreservação de gametas masculinos, porém, gera danos às células, os quais devem ser mensurados a fim de se avaliar metodologias e técnicas de manipulação e consequentemente aumentar a viabilidade de reprodução de espécies ameaçadas mantidas em cativeiro, a partir da utilização de reprodução assistida. O estudo teve por objetivo avaliar de forma qualitativa o ejaculado a fresco e descongelado de gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus) utilizando-se a combinação de sondas fluorescentes e testes de ligação de espermatozoides a ovócitos heterólogos de gatas domésticas e à membrana perivitelina do ovo de galinha. Foi utilizado um gato-do-mato-pequeno, que foi anestesiado por meio de protocolo anestésico de cloridrato de quetamina (10 mg/kg) e cloridrato de xilazina (1,2 mg/kg). O sêmen foi coletado pelo uso de eletroejaculação e foi avaliado quanto aos aspectos físicos (cor, aspecto e volume) e também foram realizados os testes de rotina a seguir: motilidade espermática, vigor espermático, concentração de espermatozoides no ejaculado, morfologia e teste hiposmótico. Posteriormente o sêmen foi criopreservado em palhetas francesas na concentração de 20 x 106 espermatozoides móveis/mL, em meio à base de TRIS citrato, 20% de gema de ovo e concentração final de 6% de glicerol e 0,5% de Equex. Para a avaliação da integridade das membranas plasmática e acrossomal foi usada a combinação de três sondas fluorescentes, iodeto de propídio (IP), Hoescht 33342 (H342) e a aglutinina Pisium sativum conjugada com isoticionato de fluoresceína (FITC-PSA). Para os testes de ligação de espermatozoides à zona pelúcida de ovócito de gata doméstica e à membrana perivitelina de ovos de galinha, o sêmen foi coincubado na concentração de 0,5 x 106 espermatozoides móveis/mL, em meio de manutenção TCM 199 modificado e mantido em estufa a 38ºC com pressão atmosférica de 5% de CO2 durante uma hora. Os ejaculados obtidos apresentaram valores médios satisfatórios para vigor e motilidade (4,33% e 80,0%, respectivamente), porém, diminuíram no sêmen descongelado (p<0,05). O ejaculado a fresco apresentou-se com valores de patologias espermáticas abaixo do observado em outros estudos com sêmen a fresco de gato-do-mato (19%), no sêmen descongelado houve aumento de espermatozoides defeituosos (p<0,05), devido exclusivamente ao aumento nos defeitos maiores. O percentual de células reativas ao teste hiposmótico foi menor (p<0,05) no sêmen descongelado em relação ao sêmen a fresco (13,0% e 71,66%, respectivamente). A associação das sondas IP, H342 e FITC-PSA mostrou-se eficaz para a distinção de diferentes subpopulações de espermatozoides em um mesmo ejaculado, porém houve dificuldade em se identificar a coloração pelo FITC-PSA em associação com o H342. Houve redução (p<0,05) da população com membrana plasmática e acrossomal íntegras no sêmen descongelado em relação ao sêmen a fresco e aumento na população com membrana plasmática lesionada e acrossomal íntegra, que foi inversamente proporcional à motilidade entre estes dois tratamentos. Em relação aos testes de ligação de espermatozoides a ovócitos heterólogos e a membranas perivitelina, tanto o sêmen a fresco quanto o descongelado de gato-do-mato-pequeno apresentaram adesão aos substratos testados e ocorreu redução (p<0,05) na quantidade de espermatozoides aderidos nos ovócitos e nas membranas no sêmen descongelado. As metodologias de avaliação qualitativa de associação de sondas fluorescentes e testes de ligação de espermatozoides a ovócitos e membrana perivitelina de ovo de galinha se mostraram úteis na avaliação de sêmen a fresco e descongelado de gato-do-mato-pequeno.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-22Bitstream added on 2014-06-13T20:19:17Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_lz_me_jabo.pdf: 560786 bytes, checksum: c8f1ff167a93ccb809fee9a007e2147b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Algumas avaliações da capacidade de fecundação como a produção in vitro de embriões (PIV) e a coloração vital indicam que a sexagem de espermatozóides por centrifugação em gradiente de densidade pode causar diminuição nas taxas de desenvolvimento embrionário, entretanto, não são conclusivas quanto à avaliação da integridade das membranas espermáticas. Com o intuito de obter dados mais precisos em relação à viabilidade espermática pós-sexagem, foram descongeladas doses de sêmen de 6 touros diferentes, e avaliadas quanto aos danos espermáticos causados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll (com densidade variando de 1,111g/mL a 1,123g/mL). Antes e após a centrifugação dos espermatozóides, além das avaliações de concentração, motilidade e morfologia, o sêmen foi ainda avaliado quanto à integridade das membranas plasmáticas, acrossomal e mitocondrial pela associação das sondas fluorescentes: Iodeto de Propídio (PI), aglutinina de Pisum Sativum conjugado a Isotiocianato de flurosceína (FITC-PSA) e Iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro- 1,1,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1). Os resultados demonstraram que o processo de separação de espermatozóides X e Y por centrifugação em gradiente de densidade promoveu uma melhora nas características associadas à motilidade progressiva, além de uma significativa diminuição na incidência de defeitos maiores. Ainda nas amostras pós-centrifugação, foi observado um aumento no percentual de células com Membrana Plasmática Intacta e com Alto Potencial Mitocondrial. No entanto, o percentual de células com Membrana Acrossomal Intacta foi sensivelmente diminuída provavelmente devido ao fenômeno de reação acrossomal desencadeado pela centrifugação. / Some fecundity evaluations as the in vitro embryo production (IVP) and the vital stains have indicating that the density gradients centrifugation techniques can reduce the embryo development rates. However they are not conclusive for the integrity of spermatic membranes. Wit the purpose of obtain more precise sperm viability data after the sexing procedure, frozen semen samples from six different bulls were thawed and assessed for spermatic damage caused by centrifugation in discontinuous Percoll gradient (with density varying from 1,111g/mL to 1,123g/mL). Before and after the separation of X-bearing bovine sperm, were evaluated the sperm concentration, motility and morphology. Moreover the semen samples were assessed for integrity of plasma, acrosome and mitochondrial membranes by fluorescent probes association: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate–Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). The results demonstrated that the X-bearing sperm separation process by density gradient centrifugation caused an increase in the progressive motility parameters and a decrease in the major defects incidence. In addition, it was observed an increase in the cells categories with Intact Plasma Membrane and High Mitochondrial Membrane potential in the post-centrifugation samples. Nevertheless, the percentage of cells with Intact Acrossome Membrane was reduced probably due to the acrosome reaction phenomenon induced by centrifugation.

A malária é uma das principais causas de morte em muitos países de clima tropical, matando mais de 438 mil pessoas anualmente em todo o mundo. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi sintetizar compostos fluorescentes 2,5- diarilfuranos através da reação de acoplamento cruzado tipo Suzuki-Miyaura e acoplar ao fármaco Primaquina para utilizá-los laboratorialmente como biomarcadores específicos, carreadores de substâncias, parasiticidas, além do desenvolvimento de novo método diagnóstico. Através deste tipo de reação, foram sintetizados 3 compostos fluorescentes: a sonda 3-AFA, 3-AFA ala e a 4-AFAPQ. Inicialmente foram utilizadas células primárias, células da linhagem RAW 264.7 e células eritrocíticas, estas provenientes de camundongos Balb/c inoculados pela via intraperitoneal com 106 EI/mL de P. berghei ANKA GFP. Os compostos fluorescentes sintetizados 3-AFA e 3-AFA ala foram incubados com as células acima citadas e verificou-se a capacidade de as sondas penetrarem e marcarem células sadias e/ou infectadas. A aquisição dos resultados foi realizada por meio de citometria de fluxo e microscopia confocal. A partir daí, utilizou-se também sangue humano proveniente de doação que foi infectado com P. falciparum 3D7. A análise dos resultados realizada com microscopia de fluorescência e testes de EC50 com estes eritrócitos, além de células HepG2. As sondas 3-AFA e 4-AFAPQ foram incubadas com estas células para avaliar a ação parasiticida, bem como a citotoxicidade destes compostos. Nossos resultados mostraram que as sondas 3-AFA e 3-AFA ala não foram capazes de penetrar os macrófagos. Entretanto, foram capazes de atravessar a membrana dos eritrócitos infectados marcando o parasita. Quando os compostos 3- AFA e a 4-AFAPQ foram inseridos em eritrócitos humanos infectados pelo P. falciparum 3D7, foi possível observar que ambos marcaram o parasita em suas 3 fases. Mas resultados de EC50 mostraram que os compostos não possuem efeito parasiticida. E podemos concluir que estes compostos não são citotóxicos ás células possuindo então, um potencial em serem estudados mais a fundo, com algumas modificações em suas estruturas para melhorar assim, sua eficiência quanto a seletividade. Diante destes compostos potencialmente fluorescentes, foi possível também desenvolver um novo método de diagnóstico rápido simples e barato que pode possibilitar o alcance em locais aonde os métodos convencionais de microscopia não chegam. / Malaria is a major cause of death in many tropical countries, killing over 438 thousand people annually worldwide. Thus, the objective of this study was to synthesize fluorescent compounds 2,5-diarylfuranes through cross-coupling reaction like Suzuki-Miyaura and engage the drug Primaquine to use them as laboratory specific biomarkers, carriers of substances, parasiticide, and the development new diagnostic method. Through this type of reaction, three fluorescent compounds were synthesized: probe 3-AFA, 3-AFA ala and 4-AFAPQ. Initially were used primary cells, strain RAW 264.7 cells line and erythrocytic cells, those derived from Balb/c mice inoculated intraperitoneally with 106 IE/mL of P. berghei ANKA GFP. The synthesized fluorescent compounds 3-AFA and 3-AFA ala were incubated with the above said cells and found the ability of penetrating probes and mark healthy cells and/or infected. The acquisition of the results was performed by flow cytometry and confocal microscopy. From there, it was also used human blood from that donation was infected with P. falciparum 3D7. The analysis performed with fluorescence microscopy and EC50 these tests with erythrocytes, and HepG2 cells. The probes 3-AFA and 4-AFAPQ were incubated with these cells to evaluate the parasiticidal activity and cytotoxicity of these compounds. Our results showed that the probes 3-AFA and 3-AFA ala were not able to penetrate macrophages. However, they were able to pass the membrane of the parasite infected erythrocytes marking. When the fluorescents probes 3-AFA and 4- AFAPQ (coupled Primaquine) were inserted into human erythrocytes infected with P. falciparum 3D7, it was observed that both marked the parasite in her 3 phases. But EC50 results showed that the compounds do not have parasiticidal effect. And we can conclude that these compounds are not cytotoxic to the cells having then a potential be studied further, with some modifications in their structures to improve thus efficiency and selectivity. Given these potentially fluorescent compounds, it was possible to develop a new method of simple and inexpensive rapid diagnosis that can enable the range in places where conventional methods of microscopy not arrive.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.