Ce travail de thèse a pour but l’étude de l’influence du nanoconfinement sur le comportement du radical phénoxyle. Une nouvelle méthodologie de génération des radicaux phénoxyle à l’état solide a été mise au point. Elle fait intervenir la fragmentation de motifs diazène et ne nécessite ni solvant ni co-réactif. Une étude de spin-trapping a permis de valider cette approche. Ainsi a été synthétisée une grande variété de matériaux hybrides organique-inorganiques, de type silice mésoporeuse (SBA 15, MCM-41) et de type polysilsesquioxane lamellaire ou poreux, fonctionnalisés par différents précurseurs de radicaux phénoxyle. Les propriétés spectroscopiques du radical phénoxyle confiné dans ces matériaux ont été étudiées par RPE en onde continue ou pulsée. Ces matériaux permettent d’augmenter de manière remarquable la durée de vie des radicaux phénoxyle. Dans ces conditions, ces derniers peuvent être qualifiés de persistants et dans certains cas de stables. L’influence du confinement a également pu être mis en évidence sur les propriétés de relaxation du radical. Enfin, une application de ces matériaux en tant que photo-initiateurs de polymérisation radicalaire a été développée. / Abstract : The aim of this study is to explore the influence of nanoconfinement on the phenoxyl radical behavior. A new methodology allowing the traceless solid state generation of phenoxyl radical was developed. It relies on the fragmentation of a diazene moieties and no solvent nor co-reagent are needed. A spin-trapping study was used to validate this approach. A wide variety of organic-inorganic hybrid materials, like mesoporous silica (SBA-15, MCM-41) and lamellar or porous polysilsesquioxane, functionalized with various phenoxyl radical precursors was synthesized. The spectroscopic properties of the phenoxyl radical contained in these materials were studied by EPR. These materials enable an amazing increase of the phenoxyl radical lifetime, they transform transient phenoxyl radical into persistent and even stable ones. The influence of the confinement has also been observed on the radical relaxation properties. Finally, an application of these materials as polymerization photo-initiator was successfully developed.

Dans la recherche de nouveaux pièges pour identifier par RPE les radicaux libres présents dans les milieux biologiques, particulièrement le superoxyde et le radical hydroxyle, le laboratoire a récemment mis au point une nouvelle nitrone, le 2-diéthoxyphosphoryl-2-méthyl-3,4-dihydro-2H- pyrrole-1-oxyde (DEPMPO), qui présente les avantages suivants par rapport au 2,2- diméthyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxyde (DMPO) couramment utilisé : meilleure persistance de l'adduit du superoxyde DEPMPO-OOH, absence de décomposition spontanée de cet adduit en l'adduit DEPMPO-OH, moindre sensibilité à l'addition nucléophile de l'eau. Ces caractéristiques sont liées à l'introduction du groupement -P(O)(OEt)2 en position 2 du cycle. L'objectif de notre étude a été de synthétiser et tester plusieurs nitrones pour mieux cerner les effets électroniques et stériques du groupement phosphoré. Nous avons préparé et testé trois nouvelles nitrones, le 2-diéthoxyphosphorylméthyl-2-méthyl-3,4- dihydro-2H-pyrrole-1-oxyde (ESP), le 2,2-bisdiéthoxyphosphoryl-3,4-dihydro-2H-pyrrole- 1-oxyde (DPBO) et le 2-éthoxycarbonyl-2-méthyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxyde (EMPO). Dans ESP le groupement -P(O)(OEt)2 est éloigné du cycle par un méthylène et ses performances dans le piégeage du superoxyde sont proches de celles de la DMPO. Dans la DPBO, l'introduction d'un second groupement -P(O)(OEt)2 ne semble pas stabiliser l'adduit DPBO-OOH. L'EMPO, où le groupement phosphoré est remplacé par un groupement -CO 2 Et, moins fortement électroattracteur, présente un comportement global plus proche de celui de la DEPMPO. La principale différence observée dans les propriétés de piégeage de toutes ces nitrones concerne la persistance des adduits du superoxyde. D'autres nitrones s'inscrivant dans cette étude sont en cours d'évaluation au laboratoire.

Dans la recherche de nouveaux pièges pour identifier par RPE les radicaux libres présents dans les milieux biologiques, particulièrement le superoxyde et le radical hydroxyle, le laboratoire a récemment mis au point une nouvelle nitrone, le 2-diéthoxyphosphoryl-2-méthyl-3,4-dihydro-2H- pyrrole-1-oxyde (DEPMPO), qui présente les avantages suivants par rapport au 2,2- diméthyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxyde (DMPO) couramment utilisé : meilleure persistance de l'adduit du superoxyde DEPMPO-OOH, absence de décomposition spontanée de cet adduit en l'adduit DEPMPO-OH, moindre sensibilité à l'addition nucléophile de l'eau. Ces caractéristiques sont liées à l'introduction du groupement -P(O)(OEt)2 en position 2 du cycle. L'objectif de notre étude a été de synthétiser et tester plusieurs nitrones pour mieux cerner les effets électroniques et stériques du groupement phosphoré. Nous avons préparé et testé trois nouvelles nitrones, le 2-diéthoxyphosphorylméthyl-2-méthyl-3,4- dihydro-2H-pyrrole-1-oxyde (ESP), le 2,2-bisdiéthoxyphosphoryl-3,4-dihydro-2H-pyrrole- 1-oxyde (DPBO) et le 2-éthoxycarbonyl-2-méthyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxyde (EMPO). Dans ESP le groupement -P(O)(OEt)2 est éloigné du cycle par un méthylène et ses performances dans le piégeage du superoxyde sont proches de celles de la DMPO. Dans la DPBO, l'introduction d'un second groupement -P(O)(OEt)2 ne semble pas stabiliser l'adduit DPBO-OOH. L'EMPO, où le groupement phosphoré est remplacé par un groupement -CO 2 Et, moins fortement électroattracteur, présente un comportement global plus proche de celui de la DEPMPO. La principale différence observée dans les propriétés de piégeage de toutes ces nitrones concerne la persistance des adduits du superoxyde. D'autres nitrones s'inscrivant dans cette étude sont en cours d'évaluation au laboratoire.

The products of the decomposition of selected types of peroxo compounds in the presence of redox agents (Pb and Co compounds) were investigated by EPR method. Besides some commercial peroxides the study was performed with peroxo compounds of Luperoxide group (Luperox 101, Luperox 256, Luperox 531). For the detection of the decomposition products the technique of spin-trapping using nitrosobenzene was applied. EPR spectra of radical adducts formed by the reaction of the reactive oxygenous radicals with nitrosobenzen having the character of stable nitroxyl radicals were analyzed. Their EPR parameters were obtained by simulation method. Besides the addition to nitrosobenzene the generated oxygen centered radicals were proved also on the basis of their reaction with model compounds (Santonox R; 2,6–ditercbutyl–4–methylphenol; diphenylamine).

Heute kennt man weit über 100 klinische Erkrankungen, bei denen Sauerstoffradikale am pathogenetischen Mechanismus beteiligt sind. Sauerstoffradikalbildung wird als Initiator oder Promotor des Alterungsprozesses, der Arteriosklerose, der postischemischen Organschäden, des Diabetes mellitus oder verschiedener neurologischer sowie dermatologischer Erkrankungen diskutiert. Besonderes Interesse gilt hierbei den Superoxidradikalen (O2-.), da ihre Bildung den Initialschritt des oxidativen Stresses, nämlich die Übertragung eines Elektrons auf das Sauerstoffmolekül, darstellt. Obwohl für den Nachweis der Superoxidradikalbildung eine Vielzahl verschiedener Methoden angewendet wird, gibt es zunehmend quantitative und qualitative Widersprüche bezüglich O2-. -Radikale in biologischen Systemen. Dies ist auf die mangelnde Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Nachweismethoden zurückzuführen. Die vorliegende Untersuchung wurde zur Überprüfung der Eignung in der Praxis angewandter Superoxid-Nachweismethoden wie Photometrie (Cytochrom c , Epinephrin, Nitrotetrazolium blau), Chemilumineszenz (Luminol, Lucigenin) und ESR-Spintrapping (DMPO, DEPMPO) für biologische Fragestellungen unternommen. Als biologische O2-.-Quellen wurden submitochondriale Partikeln, Mitochondrien und polymorphkernige Neutrophile untersucht. Es wurde gezeigt, daß bei Anwendung eines standardisierten O2-. -generierenden Enzymsystems (Xanthin/Xantinoxidase) je nach Methode Wiederfidungsraten erhalten werden, die weniger bis sehr stark von den realen O2-. -Bildungsraten abweichen. Der Nachweis der Superoxidbildung über die Chemilumineszenz des Luminols und des Lucigenins hat gezeigt, daß die Intensität des ausgestrahlten Lichtes nicht nur durch die Bildungsrate der O2-.-Radikale bestimmt wird, sondern auch durch unspezifische Wechselwirkungen der Nachweissysteme mit den zu untersuchenden Objekten. Da vielen Nachweismethoden die Oxidation oder Reduktion der jeweiligen Nachweissubstanz durch Superoxidradikale zugrundeliegt, können die Nachweisreaktionen auch durch andere reduzierende oder oxidierende biologische Komponenten in Gang gesetzt werden. Eine Überprüfung der Selektivität einer Nachweismethode durch die Zugabe des O2-.-eliminierenden Enzyms SOD ist nicht immer möglich, da Superoxidradikale oft auch als Zwischenprodukte der Nachweisreaktionen auftreten und/oder SOD nicht immer den Zugang zur O2-.-Bildungsquelle hat. Spintrapping der Superoxidradikale mit DEPMPO kann hingegen als sicherer Beweis der Superoxidbildung betrachtet werden. Für einen quantitativen Nachweis der Superoxidradikale mittels Spintrapping sind jedoch Kenntnisse über die Stabilität des Spinadduktes in jedem konkreten System erforderlich. Ein mathematisches Modell für die Berechnung der Superoxidbildung in verschiedenen Nachweisystemen wurde erarbeitet. / Imbalanced production of oxygen-centered radicals is generally considered to play a major role in the pathogenesis of a great number of clinical diseases. Metabolic disorders and other derangements of homeostasis affect O2-salvage in a way which may trigger O2- radical formation. Inversely, if O2- radicals are formed in excess, a great variety of functional and structural alterations are expected to occur. It follows that an evaluation of the ranking of O2- radicals in the pathophysiological cascade of the various diseases requires reliable methods allowing identification of the respective reactive oxygen species (ROS), localization of the generation site and the analysis of the conditions required for O2- radical formation. Superoxide radicals (O2-.) are of major interest in this respect as this univalent reduction product is the starting molecule of all ROS possibly occurring in biological systems. Controversial reports on the existence, the sites and formation conditions of O2-.-radicals in the tissue may be due to the application of inadequate methods. The aim of this study was therefore to critically evaluate current O2-.-detection methods for their suitability and comparability. O2-.-radical release from xanthine/xanthine oxidase was assessed and used as a standardized O2-.-source. Spectrophotometric (cytochrom c, epinephrin, nitroblue tetrazolium), chemiluminescence (luminol, lucigenin) and ESR-spin trapping (DMPO, DEPMPO) detection methods were exposed to this O2-.-radical generating system and analyzed with respect to their selectivity and quantitative yield. In a second step the influence of the biological O2-.-generating systems such as submitochondrial particles, mitochondria and polymorphnuclear neutrophils on the available detection methods was tested. The results revealed great variations between the detection methods used both with respect to their selectivity for O2-.-registration and the quantitative analysis of the rates formed. All conventional O2-.-detection methods were found to be directly affected by the biological systems studied, spin trapping with DEPMPO being the most reliable method for qualitative O2-.-detection. Quantitative O2-.-detection requires knowledge about the stability of the respective adduct. A mathematical model for the calculation of O2-.-formation rate in various detection systems is worked out.

L’allergie de contact est une pathologie touchant de 15 à 20 % de la population occidentale. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement, la seule façon efficace de prévention étant l’éviction totale des allergènes. Les tests de sensibilisation de nouvelles molécules avant leur mise sur le marché ont été réalisés sur l’animal jusqu’à l’interdiction dans le 7ème amendement à la directive Européenne concernant l’industrie cosmétique. Dans ce contexte il est primordial de développer des méthodes alternatives. Ce travail de thèse propose d’analyser la problématique de l’allergie de contact en allant de la molécule au tissu pour les allergènes réagissant par voie radicalaire :In chemico : étude de la réactivité des hydroperoxydes allyliques vis-à-vis des acides aminés par la RMNIn situ : études de radicaux issus de ces composés sur des épidermes humains reconstitués par RPEIn cellulo : étude du stress oxydant sur les cellules dendritiques et la voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE. / Allergic contact dermatitis is a pathology affecting 15 to 20% of the Western population. Until now no treatment exists, the prevention is the eviction of allergens. In the past, tests concerning new molecules for the market were tested on animals until the prohibition in the 7th amendment of the European directive concerning the cosmetics industry. In this context it is essential to develop alternative methods to assess the allergenic potential of chemicals.This manuscript proposes to analyze the problem of the allergic contact dermatitis from the molecule to the tissue for allergens reacting through radical mechanisms:In chemico: study of the reactivity profile of allylic hydroperoxides toward amino acids by NMRIn situ: radical intermediates formation on reconstructed human epidermis from allylic hydroperoxides by EPR In cellulo: study of the oxidative stress from allylic hydroperoxides on dendritic cells trough the Keap1/Nrf2/ARE sensor pathway.

La détection par RPE en solution du radical NO n’est possible qu’après piégeage sur une molécule appropriée. Les travaux décrits dans ce manuscrit concernent l’étude des potentialités des composés PG3 et DSB dans ce domaine : ces deux molécules possèdent un motif diénique conjugué devant permettre, après une cycloaddition [4+1] avec NO, l’obtention d’adduits nitroxyde détectables en RPE. En présence d’oxygène, le PG3 piège efficacement NO et NO2 dans le tert-butylbenzène, conduisant respectivement à un nitroxyde et à un oxynitroxyde stables avec des spectres de RPE très caractéristiques. En solvant plus polaire ou en milieu aqueux, le PG3 ne piège pas directement NO mais son dérivé oxydé NO2. Le DSB a montré, en présence d’oxygène, une bonne capacité de piégeage du radical NO dans divers solvants organiques, conduisant à un nitroxyde cyclique stable aisément indentifiable par RPE, bien qu’aucun adduit n’ait jamais été observé par RPE après réaction avec NO2. Les deux composés PG3 et DSB sont stables et ne nécessitent donc pas d’être générés in situ. L’ensemble des résultats obtenus relance l’intérêt d’utiliser des diènes conjugués comme piège à NO, bien que des composés plus hydrophiles doivent maintenant être élaborés en vue d’utilisations en milieux biologiques. / NO radical requires to be trapped before its EPR detection in solution. The work described therein deals with the study of the potentialities of the compounds PG3 and DSB in this field: both molecules show a conjugated diene moiety that could allow a [4+1] cycloaddition with NO, thereby yielding EPR detectable nitroxide adducts. In the presence of oxygen, PG3 trapped efficiently NO and NO2 radicals in tert-butylbenzene, leading to stable cyclic nitroxide and oxynitroxide, respectively, with characteristic EPR spectra. In more polar solvents and in aqueous media, PG3 was found to trap NO2, formed after NO oxidation, rather than NO itself. In the presence of oxygen, DSB trapped efficiently NO in various solvents, yielding a stable cyclic nitroxide easily identified on the basis of its EPR spectrum, though no EPR signal was ever detected after reaction between DSB and NO2. PG3 and DSB both showed a high thermal stability and no in situ generation is necessary. All these results re-boost interest in using conjugated dienes as NO traps, though more hydrophilic compounds should now be elaborated for biological applications.

The Ph.D. thesis was focused on EPR study of redox reactions of selected types of phenols, secondary amines and diperoxy coumpounds. Within the study some redox agents were employed in nonpolar, in some special cases also in polar solvents. EPR spectra of generated radical products were interpreted using spectral simulation. Study of radical reactions under participation of phenols was preferentially concentrated on the behavior of para methyl substituted phenols, where the instability of this substituent in relation to the applied redox agents was evaluated. The tendency towards the abstraction of hydrogen from methyl group, representing the paralell mechanism to the hydrogen abstaction from phenolic OH group was proved. The generated benzyl radicals were undirectly detected in the form of adducts with aromatic nitroso compounds. These adducts undergo the consecutive transformations, leading to the formation of new types of phenoxy radicals. The study of the decomposition of NH bonds was performed with substituted N,N´-paraphenylenediamines, 1-anilino-1-phenylpentane-3-ones and amino substituted 1,3-dimethyluracils. By the oxidation with 3-chloroperbenzoic acid the corresponding nitroxyl radicals were prepared. In the case of 1-anilino-1-phenylpentane-3-ones the aminyl radicals were prepared by the oxidation with PbO2, which existence was evidenced by spin trapping method with nitrosobenzene. In the framework of the investigation of the decomposition of -O-O- bonds the oxygen centred radicals, generated from peroxidic compounds of Luperox type using selected redox agents were detected by spin trapping method. The analysis of EPR spectra documented that primary alkoxyl radicals undergo the consecutive fragmentation, which leads in the presence of oxygen to the formation of secondary alkoxyl radicals. The generation of oxygen centred radicals during the decomposition was indirectly proved in the presence of model phenolic compounds, where due to the abstraction of hydrogen from phenolic OH group the phenoxyl radicals are formed.

Le travail présenté dans ce mémoire de thèse concerne pour l'essentiel, l'utilisation des dialkylzincs en tant que médiateurs de réactions radicalaires. La particularité de ces organométalliques réside dans le fait qu'ils sont, d'une part, de très bons précurseurs de radicaux alkyle en présence d'oxygène, et d'autre part, qu'ils peuvent subir des réactions de substitution homolytique bimoléculaire permettant de passer au cours d'une même réaction d'une espèce radicalaire à une espèce organométallique. Ainsi, les dialkylzincs sont de très bons médiateurs de réactions radicalaires et polaires en cascade en milieu aérobie.Cette méthodologie a été appliquée à la synthèse one-pot stéréosélective de γ-lactones disubstituées et de pyrrolizidines à partir du fumarate de diéthyle. La synthèse inédite de dérivés fumariques tri- et tétrasubstitués a été réalisée, à partir de l'acétylènedicarboxylate de diéthyle. Des cétoesters ont également été préparés à partir du bromoacrylate d'éthyle et de cétones silylées. L'utilisation d'azoture d'alkyle comme accepteur de radicaux s'est révélée infructueuse mais a permis de détecter une réactivité originale des azotures d'alkyle, qui en présence d'iodure de tertiobutyle, sont convertis en iodures correspondants. Enfin, une étude fondamentale par RPE du mécanisme d'oxydation des dialkylzincs a été réalisée afin de mieux appréhender les différences de comportement observées pour les divers dialkylzincs à l'échelle préparative. / The research work reported in this thesis is essentially concerned with the use of dialkylzincs in radical reactions. The peculiar behavior of these organometallic reagents resides in the fact that they are good precursors of alkyl radicals in the presence of oxygen and that they are good partners for bimolecular homolytic substitution reactions that enable to generate polar species from radical ones. Thereby, dialkylzincs are reagents of choice to perform radical-polar cascades in aerobic medium.This methodology has been applied to the one-pot stereoselective synthesis of disubstituted γ-lactones and pyrrolizidines from diethylfumarate and to the original formation of tri- and tetrasubstituted fumaric derivatives from diethylacetylene dicarboxylate. Ketoesters have also been prepared from bromoethylacrylate and sylilated ketones. The use of alkyl azide as radical acceptor in this process failed but a new reactivity of alkyl azides was detected during this study, i.e, their original conversion into the corresponding alkyl iodides in the presence of t-BuI.Finally, mechanistic studies have been achieved to investigate the mechanism of the oxidation of dialkylzincs. EPR experiments have been performed with the aim to gain a better understanding of the behavior observed for various dialkylzincs at preparative scale.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The endothelium is a single layer of cells lining the arteries and is involved in many physiological reactions which are responsible for vascular tone. Free radicals are important participants in these chemical reactions in the endothelium. Here we quantify free radicals, ex vivo, in biological tissue with continuous wave electron paramagnetic resonance (EPR). In all of the experiments in this thesis, we use a novel EPR spin trapping technique that has been developed for tissue segments. EPR spin trapping is often considered the ‘gold standard’ in reactive oxygen species (ROS) detection because of its sensitivity and non-invasive nature. In all experiments, tissue was placed in physiological saline solution with 190-mM PBN (N-tert-butyl-α-phenylnitrone), 10% by volume dimethyl-sulphoxide (DMSO) for cryopreservation, and incubated in the dark for between 30 minutes up to 2 hours at 37°C while gently being stirred. Tissue and supernatant were then loaded into a syringe and frozen at -80°C until EPR analysis. In our experiments, the EPR spectra were normalized with respect to tissue volume. Conducting experiments at liquid nitrogen temperature leads to some experimental advantages. The freezing of the spin adducts renders them stable over a longer period, which allows ample time to analyze tissue samples for ROS. The dielectric constant of ice is greatly reduced over its liquid counterpart; this property of water enables larger sample volumes to be inserted into the EPR cavity without overloading it and leads to enhanced signal detection. Due to Maxwell-Boltzmann statistics, the population difference goes up as the temperature goes down, so this phenomenon enhances the signal intensity as well. With the ‘gold standard’ assertion in mind, we investigated whether slicing tissue to assay ROS that is commonly used in fluorescence experiments will show more free radical generation than tissue of a similar volume that remains unsliced. Sliced tissue exhibited a 76% increase in ROS generation; this implies that higher ROS concentrations in sliced tissue indicate extraneous ROS generation not associated with the ROS stimulus of interest. We also investigated the role of ROS in chronic flow overload (CFO). Elevation of shear stress that increases production of vascular ROS has not been well investigated. We hypothesize that CFO increases ROS production mediated in part by NADPH oxidase, which leads to endothelial dysfunction. ROS production increased threefold in response to CFO. The endothelium dependent vasorelaxation was compromised in the CFO group. Treatment with apocynin significantly reduced ROS production in the vessel wall, preserved endothelial function, and inhibited expressions of p22/p47phox and NOX2/NOX4. The present data implicate NADPH oxidase produced ROS and eNOS uncoupling in endothelial dysfunction at 1 wk of CFO. In further work, a swine right ventricular hypertrophy (RVH) model induced by pulmonary artery (PA) banding was used to study right coronary artery (RCA) endothelial function and ROS level. Endothelial function was compromised in RCA of RVH as attributed to insufficient endothelial nitric oxide synthase cofactor tetrahydrobiopterin. In conclusion, stretch due to outward remodeling of RCA during RVH (at constant wall shear stress), similar to vessel stretch in hypertension, appears to induce ROS elevation, endothelial dysfunction, and an increase in basal tone. Finally, although hypertension-induced vascular stiffness and dysfunction are well established in patients and animal models, we hypothesize that stretch or distension due to hypertension and outward expansion is the cause of endothelial dysfunction mediated by angiotensin II type 1 (AT1) receptor in coronary arteries. The expression and activation of AT1 receptor and the production of ROS were up regulated and endothelial function deteriorated in the RCA. The acute inhibition of AT1 receptor and NADPH oxidase partially restored the endothelial function. Stretch or distension activates the AT1 receptor which mediates ROS production; this collectively leads to endothelial dysfunction in coronary arteries.