Respiratory syncytial virus (RSV) is the most common cause of acute lower respiratory tract infection in young children worldwide, accounting for an estimated 33.8 million cases of respiratory disease, over 3 million of which require hospitalization, and between 66,000 and 199,000 deaths in this susceptible population. Additionally, severe RSV infection early in life is associated with an increased risk of wheeze and other airway disorders later in life. Despite this, there is currently no vaccine or economically reasonable prophylactic regimen to prevent infection. While disease is typically more severe in infancy RSV can infect throughout the lifespan repeatedly as the body does not develop protective immunity during primary or subsequent infection. The mechanisms behind this incomplete immunity are unclear. RSV has been reported to infect numerous extra-epithelial cell types. Interestingly, viral infection in human mesenchymal stem cells (MSCs) has been reported, but the consequences are poorly understood. MSCs are an immune regulatory cell population present in nearly every organ including the nasal mucosa and the lung. They play a role in regulating immune responses and mediating tissue repair. In the following studies we sought to determine whether RSV infection of MSCs enhances their immune regulatory functions and contributes to RSV-associated lung disease. RSV was shown to replicate in human MSCs by fluorescence microscopy, plaque assay, and expression of RSV transcripts. RSV-infected MSCs showed differentially altered expression of cytokines and chemokines such as IL-1β, IL-6, IL-8 and SDF-1 compared to normal human bronchial epithelial cells. Notably, RSV-infected MSCs exhibited significantly increased expression of IFN-β (~100-fold) and indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) (~70-fold) compared with mock-infected MSCs. IDO was identified in cytosolic protein of infected cells by Western blots and enzymatic activity was detected by tryptophan catabolism assay. Treatment of PBMCs with culture supernatants from RSV-infected MSCs reduced their proliferation in a dose dependent manner. This effect on PBMC activation was reversed by treatment of MSCs with the IDO inhibitors 1-methyltryptophan and vitamin K3 during RSV infection. We also demonstrated the pathway leading to IDO expression in RSV infected MSCs. Neutralizing IFN-β prevented IDO expression and activity indicating its role as a viral response factor perhaps “high jacked” by the virus in immune escape. Treatment of MSCs with an endosomal TLR, but not a RIG-I, inhibitor prevented IFN-β and IDO expression. Additionally, TLR3/dsRNA complex inhibitor was able to block IFN-β stimulation, while a TLR7/8/9 inhibitory ODN did not, suggesting that endosomal TLR3 detection of RSV dsRNA was leading to IFN-β and IDO expression. Together, these findings indicate that RSV infection of MSCs triggers their immune regulatory function via TLR3 recognition of dsRNA, upregulating IFN-β expression and IDO activity, ultimately affecting immune cell proliferation. This finding may account for the lack of protective RSV immunity and consequent repeated infections throughout one's lifetime.

Grâce à leurs propriétés de différenciation, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) constituent aujourd’hui un outil en médecine régénérative. La moelle osseuse reste une des plus utilisées. Une diminution de la capacité de prolifération et de différenciation des CSM-MO, au cours des passages, a été montrée. En parallèle, certaines études montrent que l'impact de l'âge du donneur sur les propriétés de CSM-MO reste encore controversé. Le but de notre étude était de mieux comprendre l'effet de l'âge du donneur mais aussi des passages en culture sur la capacité de prolifération et de différenciation des CSM de moelle osseuse. Les échantillons ont été séparés en 4 groupes en fonction de l’âge des donneurs (<20 ans; 20-40 ans; 40-60 ans; >60 ans) et les analyses ont été réalisés lors de la culture de cellules pendant 5 passages. Les résultats obtenus montrent que la capacité de prolifération de CSM-MO obtenues à partir de donneurs jeunes est supérieure à celle de cellules des donneurs âgés. De plus, cette capacité de prolifération diminue en fonction des passages en culture. En parallèle, la capacité des cellules à former des colonies, mesurée par le test CFU-F, diminue légèrement en fonction de l’âge des donneurs mais de façon importante en fonction du passage. Enfin, la capacité de différenciation des CSM-MO vers les trois types cellulaires étudiés, diminue en fonction des passages de cellules mais également en fonction de l’âge des donneurs. Notre étude montre que les propriétés des CSM issues de moelle osseuse sont modifiées lors de l’amplification in vitro mais aussi en fonction de l’âge des donneurs / Today with their properties of differentiation into specific cells types, mesenchymal stromal cells (MSC) can be used in regenerative medicine. Bone marrow (BM) is the better characterized one. The researchers have proven that with increasing passage number in culture the proliferation and differentiation potential of MSC decrease. In parallel many researchers have showed the impact of donor age on MSC properties remains controversial. The aim of our study was to better understand the effect of donor age but also culture passages on the proliferation and differentiation ability of bone marrow mesenchymal stromal cells. The samples were separated into 4 groups depending on the donor age (<20 years; 20-40 years; 40-60 years; > 60 years) and The samples were cultured for 5 passages. The results obtained show that the MSC proliferative capacity obtained from young donors is greater than that of cells from older donors. In addition, the proliferative capacity decreases with increasing passage number in culture. In parallel, the ability of colony-forming unit-fibroblast, measured by the CFU-F assay, decreases slightly depending on the age of the donors but significantly depending on the passage. Finally, the MSC differentiation ability decreases according to the passage of the cells but also depending on the donor age. Our study shows that the properties of bone marrow derived MSC are modified not only during amplification in vitro but also in terms of donor age

Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

Au début de ma thèse, je me suis intéressé aux processus qui sous-tendent la communication cellulaire et plus spécifiquement les interactions cellule-cellule. Pourquoi une cellule établit-elle un contact spécifique avec une autre cellule ? Comment les cellules répondent-elles à cette interaction et quels en sont les effets ? J'ai utilisé comme modèle d'étude l'interaction entre les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) et des lignées de cancer du sein. L'objectif de mon travail a été d'analyser les mécanismes de ces interactions entre CSM et cellules cancéreuses et d'en évaluer les effets sur les fonctions des cellules cancéreuses. En effet, des mécanismes de recrutement des CSM aux sites tumoraux ont été décrits avec des effets sur la progression tumorale, ce qui ouvre par ailleurs des perspectives pour de nouvelles approches thérapeutiques. J'ai tout d'abord développé un système expérimental de microscopie confocale en temps réel pour observer le type d'interaction qui est produit entre les CSM humaines et les cellules de carcinomes mammaires MDA-MB-231 et MCF7. J'ai constaté la formation dynamique de structures tubulaires entre les deux types cellulaires et, de façon surprenante, le passage des mitochondries des CSM vers les cellules cancéreuses. En un deuxième temps, j'ai utilisé un système d'invasion dans une matrice 3D de collagène, que nous avons adapté à la coculture, afin d'observer les effets de l'interaction des MDA-MB-231 avec les CSM. En accord avec la littérature, nous avons constaté une augmentation du pouvoir invasif des cellules cancéreuses, effet qui pouvait être lié au transfert des mitochondries provenant des CSM. Pour répondre à cette question, j'ai mis au point un protocole pour transférer spécifiquement des mitochondries, isolées à partir de cellules, vers d'autres cellules. Ce protocole, exploité dans ce manuscrit pour le transfert de mitochondries de CSM vers les cellules cancéreuses MDA-MB-231, peut être transposé à d'autres types cellulaires et fait l'objet d'une demande de brevet. Nos données indiquent que l'acquisition de mitochondries de CSM par les cellules cancéreuses modifie leurs propriétés fonctionnelles et augmente leur capacité de prolifération et d'invasion. Concernant leur activité métabolique, on observe une augmentation de leur respiration mitochondriale et de leur production d'ATP. Nos données préliminaires suggèrent aussi une augmentation de l'expression transcriptionnelle d'enzymes impliquées dans la synthèse des lipides et l'oxydation des acides gras. Ces données, générées grâce au protocole de transfert artificiel de mitochondries mis au point, montrent pour la première fois que les mitochondries des CSM peuvent majorer certaines propriétés cellulaires liées à la progression tumorale, comme la prolifération et l'invasion, et contribuer à une reprogrammation métabolique des cellules cancéreuses. Elles s'intègrent au rôle proposé par la communauté scientifique pour les CSM dans le microenvironnement tumoral. La technique de transfert artificiel de mitochondries nous permettra de répondre à d'autres questions restées ouvertes, comme le rôle possible des mitochondries des CSM dans les résistances développées par les tumeurs vis-à-vis des agents anti-cancéreux. Le protocole de transfert de mitochondries développé au laboratoire constitue une technique de choix et offre de nombreux avantages comparativement à d'autres techniques comme la micro-injection et la génération des hybrides cytoplasmiques. Sa mise en œuvre est en effet simple et reproductible et permet de traiter une grande quantité de cellules. Cette méthode permet d'envisager de nombreuses perspectives et applications dans le domaine de la reprogrammation métabolique, comme par exemple de restaurer les capacités d'une cellule dysfonctionnelle par le transfert de mitochondries issues d'une cellule saine et « métaboliquement active ». / At the beginning of my thesis, I was interested in the process involved in cell communication, more specifically in cell-to-cell interactions. Why does a cell specifically establish contacts with another one, how do cells respond to these interactions and what are the effects? As a model to answer these questions, I studied the interactions between MSCs and two breast cancer cell lines. The study of the communications between MSCs and tumor cells is an alternative to explore and understand tumor progression. MSC recruitment to the tumor is shown to favor the progression of the disease. The mechanisms of this dialogue are multiple and are the object of a great number of studies that aim at finding new therapeutic approaches. The objective of this work was to analyze the interactions between MSCs and cancer cells and evaluate the potential effects of this communication in tumor progression. First, I developed an experimental system of real time confocal microscopy in order to observe the interaction produced between MSCs and the breast carcinoma MDA-MB-231 and MCF-7 cells. I noticed the dynamic formation of tubular structures between the two different cell types and, surprisingly, the passage of mitochondria from MSCs to the cancer cells. Second, we used a 3D system of cell invasion in a collagen matrix, which we adapted for the coculture, in order to observe the effects of the interactions between the MDA-MB-231 and MSCs. In agreement with the literature, we observed an increase in the migratory potential of the cancer cells, an effect that could be linked to the transfer of mitochondria from MSCs to the cancer cells. To answer this question, I set up a protocol to specifically transfer to the cancer cells mitochondria isolated from the MSCs and test directly the functional consequences for the cancer cells. This protocol can be used to transfer mitochondria, not only from MSCs but also from other cells. This method is currently submitted to a patent process. Our results show that the transfer of MSC mitochondria to the cancer cells modifies cancer cells functional properties and increase their invasive and proliferative capacities. Concerning the metabolic activity, we noticed an increase in mitochondrial respiration and ATP production. We also observed an increase in the transcription level of enzymes related to the lipid synthesis and fatty acid oxidation. The results generated with this new protocol of mitochondria transfer show, for the first time, that mitochondria originating from MSCs can improve cellular capacities linked to the tumor progression. The role proposed by the scientific community for the interactions of MSCs with the tumor cells fits with the data generated in our work. Several questions remain open. In particular, could the transfer of mitochondria from MSCs to the cancer cells contribute to the acquisition of resistance to anti-cancer agents observed in patients? The protocol of transfer of mitochondria that we developed in the laboratory is a technique of choice and offers many advantages over other techniques such as microinjection and cytoplasmic hybrids; its implementation is simple and reproducible and can target large numbers of cells. This method opens numerous perspectives and potential applications such as the study of metabolic reprogramming. Thus, we could consider restoring the activity of dysfunctional cells by transferring mitochondria from “metabolically active” or healthy cells. In the long term, one of the applications could be transferring healthy or genetically modified mitochondria to zygotes carrying mitochondrial DNA mutations, in order to treat pathologies like infertility, neuro-degenerative diseases, cancer and premature aging.

O sucesso no desenvolvimento de tumores não dependente somente de mutações, mas também é influenciado pelo microambiente do tumor; nele ocorre a interação entre as células tumorais e o estroma. Essa interação pode ser mediada por vesículas liberadas por essas células para o meio extracelular. Essas vesículas atuam na comunicação celular que pode influenciar a progressão tumoral. O objetivo deste estudo foi analisar as interações mediadas por vesículas entre células tumorais e fibroblastos normais. As células tumorais foram plaqueadas sobre a monocamada de fibroblastos e carregadas com diferentes corantes vitais. Nossos resultados evidenciaram a presença e a troca de vesículas entre as células em co-cultura. Vesículas isoladas mostraram tamanhos heterogêneos. Células tumorais possuem mais vesículas que as células normais. As vesículas são compostas pelas proteínas AHNAK e Anexinas. AHNAK foi detectada em vesículas trocadas e estava aumentada em tumores. AHNAK é molécula estrutural das vesículas extracelulares que pode influenciar a biologia dos tumores de mama. / The successful development of tumors is not only dependent on cell mutations, but also driven by the tissue microenvironment; relies on interaction of cells and their surrounding stroma. Some cell types release vesicular structures into the extracellular space that would be involved in cellular communication and tumor progression. The aim of this study was to analyze vesicle-mediated interactions between tumor cells and normal fibroblasts. Tumor cells were plated above fibroblasts monolayer and both loaded with different vital dyes. Our results evidenciated presence and exchange of vesicles between breast tumor cells and fibroblasts in co-culture. Vesicles isolated showed heterogeneous sizes. Tumor cell showed more vesicles than normal cells. These vesicles were composed of AHNAK and Annexins proteins. The protein AHNAK was detected in exchanged vesicles and was increased in tumors when compared to normal breast tissues. AHNAK could represent a vesicle structural molecule that would influence breast tumor biology.

1. Einleitung Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) stellen eine interessante Therapieoption in der regenerativen Medizin verschiedener Erkrankungen dar. Aufgrund ihrer Herkunft aus mesodermalem Gewebe ist ihr Einsatz in der Therapie von Sehnenerkrankungen als günstig anzusehen, wo sie bei Pferden bereits erfolgreich verwendet werden. Da dieser Erkrankungskomplex mit degenerativen Veränderungen der Achillessehne des Menschen vergleichbar ist, wäre eine Translation der gewonnenen Ergebnisse in die Humanmedizin wünschenswert. Die zugrunde liegenden Wirkmechanismen bei der Sehnenregeneration sind allerdings bis zum heutigen Tage noch nicht vollständig geklärt. Unter anderem wird eine tenogene Differenzierung der MSC mit nachfolgender Produktion von extrazellulärer Matrix (EZM) diskutiert. Als Nachweis hierfür wird die Genexpression von Matrixproteinen sowie Transkriptionsfaktoren angesehen. Die Isolation von MSC ist aus verschiedenen Geweben möglich; allerdings haben Untersuchungen deutliche Unterschiede in den in-vitro-Charakteristika zwischen den Zellquellen aufgezeigt. Trotz dieser unterschiedlichen Eigenschaften fasst die International Society for Cellular Therapy (ISCT) seit 2006 humane MSC als plastikadhärente Zellen mit tripotentem Differenzierungspotential sowie einem definierten Antigenprofil zusammen. Um eine Vergleichbarkeit equiner und humaner MSC und somit eine bessere Übertragbarkeit gewonnener Erkenntnisse aus der Pferdemedizin zu erreichen, steht aktuell die Untersuchung der geforderten Antigenexpression noch aus. 2. Ziele der Untersuchung In der vorliegenden Arbeit sollte daher erstmalig eine vollständige Charakterisierung des geforderten Antigenprofils equiner MSC aus fünf verschiedenen Quellen durchgeführt werden, um einen Vergleich mit humanen Zellen zu ermöglichen. Zudem sollte eine vergleichende Darstellung der Sehnenmarkerexpression durchgeführt werden, welche das Wissen um die in-vitro-Eigenschaften von MSC erweitern und in Folge zur Auswahl einer optimal für die Therapie von Sehnenerkrankungen geeigneten Zellquelle beitragen soll. 3. Materialien und Methoden In der ersten Studie wurden equine MSC aus Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, Nabelschnurgewebe und Sehnengewebe bis zur Passage 3 kultiviert und anschließend mittels Durchflusszytometrie auf das Vorkommen der Antigene CD 29, CD 44, CD 73, CD 90 und CD 105 sowie das Fehlen der Antigene CD 14, CD 34, CD 45, CD 79α und MHC II untersucht. In der zweiten Studie wurde eine Genexpressionsanalyse der Sehnenmarker Kollagen 1A2, Kollagen 3A1, Decorin, Tenascin-C und Skleraxis vergleichend mittels Echtzeitpolymerasekettenreaktion an den isolierten Zellen durchgeführt. In beiden Studien wurde eine Probenzahl von n= 6 für jede Zellquelle untersucht. 4. Ergebnisse Keine der untersuchten Zellquellen erfüllte die MSC-Definition der ISCT bezüglich des Antigenprofils. Insbesondere durch den fehlenden Nachweis CD 73 (< 3,07 %) in allen untersuchten Proben unterscheiden sich equine und humane MSC. Die einzigen stabil exprimierten Antigene sind die zusätzlich untersuchten Proteine CD 29 (37,5 % - 65,42 %) und CD 44 (32,2 % - 97,18 %). Das Vorkommen CD 105 konnte in MSC aus Fett- und Sehnengewebe belegt werden. Zusätzlich war ein Nachweis von CD 90 in MSC aus Fettgewebe möglich, welche somit die größte Ähnlichkeit mit der humanen Zellpopulation aufweisen. Die Studie zur Genexpressionsanalyse weist auf eine Basisexpression von Kollagen 1A2, 3A1 und Decorin in MSC aus verschiedenen Quellen hin, welche über der von nativem Sehnengewebe liegt. Auch hier weisen wiederum MSC aus Fettgewebe die höchste Expression auf. 5. Schlussfolgerungen Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zu einer vertiefenden in-vitroCharakterisierung equiner MSC. Das Antigenprofil equiner MSC ist nicht vollständig mit dem humaner identisch. Eine abschließende Beurteilung sollte durch Untersuchungen mit spezies-spezifischen Antikörpern erfolgen. Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse unterstützen die Theorie, dass MSC die Sehnenheilung durch Produktion von extrazellulärer Matrix beeinflussen. Der Einsatz von MSC aus Fettgewebe in der Therapie von Sehnenerkrankungen sollte forciert werden, da ihre hohe Sehnenmarkerexpression einen Hinweis auf eine Verbesserung der Sehnenregeneration darstellt.

In der Diagnostik der gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) spielt neben der Histologie die Immunhistochemie eine zentrale Rolle. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Fragestellung, welche Wertigkeit der Mutationsanalyse im diagnostischen Kontext zukommt und wie stabil Immunphänotyp und Mutationsstatus im Verlauf der Erkrankung tatsächlich sind. In drei Fällen rezidivierter GIST war die Histomorphologie, die Immunhistochemie und der Mutationsstatus im Vergleich zum Primärtumor stabil. Bei den untersuchten synchron auftretenden Tumoren von drei Patienten waren in der Mutationsanalyse unterschiedliche Ergebnisse zu erheben. Bei zwei Patienten unterstützte das unterschiedliche Mutationsmuster das Vorliegen synchroner Tumoren, bei einem Patienten ist das Vorliegen eines Primärtumors und einer Metastase statt einem synchronen GIST wahrscheinlich. Die Untersuchung metastasierter GIST wurde an verschiedenen Tumoren von neun Patienten durchgeführt. Acht der neun Fälle zeigten sich bezüglich der Metastasen genotypisch stabil, einer der acht Fälle wies zusätzlich einen Zugewinn einer Punktmutation auf, die als Möglichkeit eines Tumormosaiks oder als neu erworbene zusätzliche Mutation zu werten sein könnte. Zudem wurden 28 Fälle unklarer spindelzelliger Tumoren mit uneinheitlichem immunhistochemischen Profil untersucht. In Zusammenschau mit der Mutationsanalyse war eine eindeutige Bestimmung der Tumorentität möglich. Abschließend zeigt sich die Kombination aus Histomorphologie, immunhistochemischer Untersuchung und Mutationsanalyse als gutes diagnostisches Mittel zur Sicherung der Tumorentität und Entdeckung eventuell neu aufgetretener prognostisch relevanter Mutationen mit therapeutischer Konsequenz.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 2 1.1 Definition und Epidemiologie 2 1.1.1 Definition 2 1.1.2 Epidemiologie 3 1.2 Histologie 3 1.2.1 Spindelzellige GIST 4 1.2.2 Epitheloide GIST 5 1.2.3 Intermediäre GIST 6 1.2.4 Mitosen 7 1.3 Immunhistochemie 8 1.4 Molekulare Pathologie 9 1.5 Klinische Diagnostik 11 1.6 Krankheitsverlauf und Risikoabschätzung 11 1.7 Therapie 13 1.7.1 Patienten mit lokalem Tumorgeschehen 13 1.7.2 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem GIST 13 2. Zielsetzung 15 3. Material und Methoden 16 3.1 Untersuchungsgut 16 3.1.1 Rezidivierte gastrointestinale Stromatumoren 16 3.1.2 Synchrone gastrointestinale Stromatumoren 16 3.1.3 Metastasierte gastrointestinale Stromatumoren 16 3.1.4 Unklare spindelzellige Tumoren 17 3.2 Chemikalien 17 3.3 Verbrauchsmaterialien 17 3.4 Chemikalien-Zusammensetzungen 18 3.5 Geräte 19 3.6 Antikörper Immunhistochemie 20 3.7 Oligonukleotide 20 3.8 Bestimmung des Risikoprofils und TNM-Klassifikation 22 3.9 Immunhistochemie 24 3.9.1 Probenaufarbeitung 25 3.9.2 Durchführung und Färbung 25 3.9.3 Auswertung und Kontrolle 26 3.10 Mutationsanalyse 27 3.10.1 Probenaufbereitung 27 3.10.2 Entparaffinierung 27 3.10.3 DNA-Extraktion 27 3.10.4 Amplifikation / Polymerase-Kettenreaktion 29 3.10.5 Konzentrationsbestimmung des PCR-Produktes 30 3.10.6 Kapillargelelektrophorese 30 3.10.7 Aufreinigung der PCR-Produkte 32 3.10.8 Sanger-Sequenzierung 32 3.10.9 Sequenzauswertung 33 4. Ergebnisse 35 4.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST 37 4.1.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und Miettinen 37 4.1.2 Immunhistochemie 38 4.1.3 Mutationsanalyse 38 4.2 Patienten mit synchron aufgetretenen GIST 39 4.2.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und Miettinen 40 4.2.2 Immunhistochemie 41 4.2.3 Mutationsanalyse 41 4.3 Patienten mit metastasiertem GIST 42 4.3.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und Miettinen 44 4.3.2 Immunhistochemie 45 4.3.3 Mutationsanalyse 47 4.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren 49 4.4.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und Miettinen 51 4.4.2 Immunhistochemie 53 4.4.3 Mutationsanalyse 54 5. Diskussion 57 5.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST 57 5.2 Patienten mit synchronen GIST 59 5.3 Patienten mit metastasiertem GIST 61 5.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren 70 Zusammenfassung 73 Tabellenverzeichnis 76 Abbildungsverzeichnis 78 Literaturverzeichnis 79 Erklärung 84 Danksagung 85 Lebenslauf 86

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21018号 / 医博第4364号 / 新制||医||1028(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小川 誠司, 教授 柳田 素子, 教授 江藤 浩之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21257号 / 医博第4375号 / 新制||医||1029(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 増永 慎一郎, 教授 妹尾 浩, 教授 松田 道行 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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