Introduction : L’efficacité de la greffe d’îlots n’est plus à démontrer mais elle reste l’objet de recherches pour améliorer la qualité et la survie des îlots greffés souvent fragilisés par la destruction enzymatique de leur microenvironnement lors de la procédure d’isolement. Dans ce contexte, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) d’origine pancréatique représentent un outil intéressant par leurs propriétés d’immunomodulation et par leur capacité de sécrétion de facteurs du microenvironnement. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’effet des cellules stromales pancréatiques humaines sur les cellules β humaines.Méthodes : Des îlots humains purifiés ont été maintenus en culture pendant plusieurs jours. Les cellules adhérentes se formant en périphérie de l’îlot ont été sélectionnées et immortalisées. Ces nouvelles cellules « human islet-derived stromal cells » (hISC) ont ensuite été caractérisées pour déterminer leur profil mésenchymateux Nous avons ensemencé des cellules β humaines (lignée EndoC-βH1 ou cellules primaires) sur du milieu conditionné de hISC (hISC-CM) utilisé comme support de culture. L’adhérence, la survie, la prolifération, l’insulinosécrétion des cellules β cultivées sur le hISC-CM ont été mesurées et comparées à un support contrôle : la poly-L-lysine.Résultats : Les hISC présentent un profil phénotypique et transcriptomique très proche des CSM issues de la moelle osseuse. D’un point de vue fonctionnel, les hISC présentent une capacité d’immunomodulation. Elles expriment et sécrètent des protéines matricielles connues pour être présentes autour et à l’intérieur des îlots humains tels que les collagènes de type I, IV et VI, la laminine et la fibronectine. Au contact du hISC-CM les cellules EndoC-βH sur adhèrent st s’étalent. Le hISC-CM augmente l’expression du marqueur de prolifération PCNA et améliore la survie et la fonction des cellules EndoC-βH1. D’un point de vue mécanistique, l’interaction cellules β/hISC-CM active la phosphorylation de FAK (focal adhesion kinase) et ERK (extracellular signal-regulated kinases). A l’interface de cette interaction, la sous-unité β1 de l’intégrine est impliquée dans les effets observés du hISC-CM sur l’adhérence et la fonction des cellules β.Conclusion : Nos travaux démontrent l’intérêt prometteur des hISC en tant que cellules de soutien des cellules β humaines par la sécrétion de protéines matricielles pancréatiques. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le maintien des îlots en culture et leur conditionnement dans un microenvironnement plus physiologique permettant ainsi de préserver leur qualité fonctionnelle lors de la greffe. / Introduction : The efficacy of islet transplantation is well established. However, the procedure still needs improvements in the quality of grafted islets, often weakened by the loss of their surrounding tissue during the isolation process. In this respect, mesenchymal stromal cells (MSC) represent an interesting tool as they have immunomodulatory and anti-inflammatory properties and are known to secrete proteins involved in creating a favorable microenvironment. This work aims to investigate the effect of human pancreatic stromal cells on human β-cells.Methods : We characterized the mesenchymal profile of cells, previously immortalized in our lab from human islets of Langerhans adherent cells, hereafter named hISC (human islet-derived stromal cells). We seeded human β-cells (EndoC-βH1 cell line or primary β-cells) on hISC-conditioned medium (hISC-CM) used as coating of Petri dishes. We assessed spreading, survival, proliferation and glucose-induced insulin secretion of β-cells cultured on hISC-CM as compared to poly-L-lysine coating.Results : Phenotypic and transcriptomic profiles of hISC are close to bone-marrow MSC. The hISC have an immunomodulation capacity. They express and secrete extracellular matrix proteins known to be present around and within human islet such as types I, IV and VI collagens, laminin and fibronectin. EndoC-βH1 seeded on hISC-CM adhere and spread on cell culture surface. We show that hISC-CM has positive effects on EndocC-βH1 proliferation, survival and glucose-induced insulin secretion, as compared to poly-L-lysine. From mechanistic point of view, hISC-CM induces FAK (focal adhesion kinase) and ERK (extracellular signal-regulated kinases) phosphorylations. The β1-integrin subunit is involved in both adhesion and increased insulin secretion of β cells induced through hISC-CM.Conclusion : Our work demonstrates a promising interest of hISC as support cells for human β-cells by scaffolding factors secretion. It opens new perspectives for conditioning human β-cells in a more physiological microenvironment to preserve their functional quality before and after transplantation.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La myélofibrose primitive (MFP) est un néoplasme myéloprolifératif chromosome Philadelphie négatif rare, mais de pronostic sévère. Elle se caractérise par une prolifération clonale et une mobilisation des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSH/PH) de la moelle osseuse vers la rate et le foie. Cette anomalie de l’hématopoïèse est associée à une pathologie du stroma (myélofibrose, ostéosclérose et néoangiogenèse). L’existence d’anomalies moléculaires de la CSH/PH telles que les mutations de Jak2, Mpl, TET2 ou CALR ne permet pas à elle seule d’expliquer la physiopathologie de la maladie. Les résultats obtenus dans le laboratoire suggèrent que le microenvironnement médullaire au sein des niches hématopoïétiques et en particulier les cellules stromales mésenchymateuses (CSM), participe vraisemblablement à cette dérégulation de l’hématopoïèse, favorisant le développement du clone pathologique. Cependant, aucune preuve tangible d’une altération des CSM médullaires n’a été jusqu’à présent apportée.Dans ce travail, nous avons isolé les CSM de la moelle de patients atteints de MFP et réalisé une caractérisation « complète » de ces cellules : prolifération, phénotype, soutien de l’hématopoïèse, sécrétome, transcriptome, miRNome et capacités de différenciation. Nos résultats ont permis de dégager un faisceau d’arguments en faveur d’une dérégulation de leur différenciation ostéoblastique (DOB). (i) Les cytokines BMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF et Il-6 sont significativement produites en plus grande quantité par ces cellules. (ii) L’étude du transcriptome a révélé une expression significativement différente d’un ensemble de gènes impliqués dans la DOB tels que RUNX2, DLX5, TWIST1 et NOGGIN. (iii) De nombreux micro-ARN, dont certains sont connus pour être impliqués dans la DOB comme miR-210 ou dans le nichage des cellules souches hématopoïétiques comme miR-34a, sont dérégulés à l’état basal et au cours de cette DOB. (iv) Enfin, l’étude de leurs capacités de différenciation ostéoblastique in vitro et in vivo chez la souris immunodéprimée est en faveur d’une augmentation de ces capacités. Nous avons étudié l’impact du TGF- β1 dans cette DOB. Nous avons mis en évidence que les CSM de malades présentent un état basal d'activation de la voie de signalisation pSmad significativement augmenté, confirmant l’expression endogène de TGF-β1. En utilisant des inhibiteurs spécifiques du récepteur de type I au TGF- β, nous avons montré l’implication de cette cytokine dans les altérations de la DOB. En conclusion, notre travail montre pour la première fois que les CSM des malades de MFP sont anormales et ce indépendamment de la stimulation par le clone hématopoïétique pathologique, suggérant la présence d'anomalies constitutives ou acquises. Ces anomalies impliquent deux acteurs majeurs de la pathologie : le TGF-β1 et l'ostéogenèse. / Primary myelofibrosis (PMF) is a Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm, rare but associated with a poor prognosis. Its features are a clonal proliferation and an egress of hematopoietic stem cells (HSC) from bone marrow to spleen. These abnormalities of hematopoiesis are in relation with a pathological stroma (myelofibrosis, osteosclerosis and neoangiogenesis). Molecular abnormalities present in HSC partially explain the physiopathology of the disease. Results from our lab suggest that the bone marrow micro-environnement, especially mesenchymal stromal cells (MSC), are involved in the deregulation of hematopoiesis, promoting the clonal cells. However, there is no strong evidence of bone marrow MSC alterations reported for now.In our study, we isolated MSC from bone marrow of patients suffering from PMF and performed a broad characterization: proliferation, phenotype, hematopoiesis supporting capacities, secretome, transcriptome and miRNome analysis. Our results highlight arguments in favor of a deregulation of their osteogenic capacities. (i) Cytokines NMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF and Il-6 were significantly overproduced by MSCs. (ii) Transcriptome analysis revealed a specific signature involving genes participating in osteogenic differentiation such as RUNX2, DLX5, TWIST1 and NOGGIN. (iii) Many micro-RNAs, some know to be involved in osteogenic differentiation regulation, as mir-34a, are deregulated in MSCs and in MSC-derived osteoblasts. (iv) Finally, study of their osteogenic potency in vitro and in vivo in nude mice showed an increasing of their osteogenic potency. We studied the impact of TGF-β1 in this process and showed that PMF MSCs showed a basal expression of Smad pathway significantly increased as compared to control. Using specific inhibitor of TGF-β1 receptor, we demonstrated the implication of this cytokine in the osteogenic impairment.To summarize, our work shows for the first time that MSCs from PMF patients are abnormal, independently from stimulation by clonal cells, suggesting intrinsic abnormalities. These abnormalities involve two main factor of the disease: TGF-β1 and osteogenesis.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le tissu osseux a la capacité de se régénérer suite à une fracture. Cependant, des consolidations incomplètes concernent aujourd’hui environ un million de personnes par an. L’approche d’ingénierie tissulaire associant des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) à des biomatériaux émerge comme une stratégie prometteuse pour réparer ces défauts. Par ailleurs, l’efficacité de la régénération osseuse semble varier en fonction du donneur mais aussi du support associé. L’objectif de mon travail de thèse a été de comprendre les mécanismes à l’origine de ces variabilités. Pour cela, nous nous sommes intéressés à deux mécanismes : (i) l’impact des biomatériaux sur le devenir et les fonctions des CSM et (ii) l’impact de l’hétérogénéité inter-donneur des CSM sur les mécanismes moléculaires in vitro et in vivo, à l’origine des différences du potentiel ostéoformateur de ces cellules.Dans un premier temps, deux types de biomatériaux largement utilisés en clinique ont été comparés dans un modèle murin de greffe ectopique : une céramique biphasique d’hydroxyapatite/béta-tricalcium-phosphate (HA/bTCP) et une matrice osseuse humaine gamma-irradiée (Tutoplast® process Bone [TPB]). Nos résultats ont montré une meilleure formation osseuse lorsque les CSM sont combinées au TPB par rapport au HA/bTCP. Ceci est associé à une meilleure adhésion des CSM in vitro et in vivo ainsi qu’à une différentiation ostéoblastique supérieure sur le TPB. La contribution directe des CSM à former l’os est associée à un effet paracrine sur la chémoattraction et/ou la différentiation ostéogénique des cellules de l’hôte. Cet effet est indépendant des chimiokines PDGF et SDF-1 mais semble être régulé par la voie d’IGF-1. Un autre effet paracrine des CSM est observé sur l’activité ostéoclastique, qui est plus importante sur la céramique HA/bTCP et qui semble être régulée par le facteur RANKL. L’augmentation de l’activité ostéoclastique pourrait être à l’origine d’un déséquilibre de la balance résorption/formation osseuse sur le HA/bTCP.Ainsi, nos résultats montrent que le support impacte la persistance des CSM au niveau du site de la greffe ainsi que leur rôles directs et paracrines, l’ensemble étant à l’origine d’une variabilité de la formation osseuse.Cette formation osseuse a été observée avec seulement 70% des donneurs de CSM. Nous avons donc décidé dans la deuxième partie de ce projet d’évaluer les différences entre ces deux groupes de donneurs. In vitro aucune différence de prolifération, de différentiation ou de phénotypie des CSM n’a été observée. De plus, les analyses transcriptomique et sécrétomique réalisées in vitro n’ont montré aucune variabilité entre les deux groupes. In vivo, la persistance des CSM sur le site de la greffe est donneur dépendante et n’est pas liée à un défaut de vascularisation ou à une mort cellulaire par apoptose augmentée. Par ailleurs, nos résultats soutiennent l’existence d’une corrélation entre la formation osseuse et la capacité des CSM greffées à adhérer au support, survivre ainsi qu’à participer à la formation osseuse via une action directe et un effet paracrine.En conclusion, ce travail montre que l’efficacité de la formation osseuse dépend du devenir et des fonctions des CSM greffées. L’origine (donneur) ainsi que le microenvironnement (support associé) impactent l’adhésion, la survie et les mécanismes d’action de ces cellules au cours de la régénération osseuse. De plus, nous avons constaté que le potentiel ostéogénique des CSM est dû à leur participation directe à former l’os qui est synergique à un effet paracrine de chémoattraction et/ou de différentiation ostéogénique des cellules de l’hôte. / Despite bone capacity to regenerate after injury, incomplete consolidation concerns 1 million persons per year. Bone tissue engineering involving human bone marrow mesenchymal stromal cells (hBMSCs) loaded on biomaterials emerges as a new strategy to repair large bone defects. Nevertheless, efficacy of bone regeneration seems variable depending on the donor as well as on the associated scaffold. The aim of my PhD work was to understand mechanisms responsible for these variabilities. To this end, we focused on two objectives: (i) the impact of biomaterials on hBMSCs behavior and (ii) the impact of hBMSCs heterogeneities on molecular mechanisms in vitro and in vivo, resulting in variable bone-forming potential of these cells.First, two scaffolds widely used clinically were compared in an ectopic mouse model: the synthetic hydroxyapatite/beta-tricalcium-phosphate bioceramic (HA/βTCP) and the gamma-irradiated-processed human bone allograft (Tutoplast® Process Bone [TPB]). Our results showed that bone formation is higher when hBMSCs are loaded on TPB compared to HA/bTCP. This was correlated to a better hBMSCs adhesion in vitro as well as in vivo and to their higher osteoblastic differentiation on TPB. The direct participation of hBMSCs to form bone was associated to a paracrine effect of hBMSCs by inducing host cell chemoattraction and/or osteogenic differentiation, mediated probably by the IGF-1 pathway but independently from PDGF or SDF-1. Another paracrine effect was also observed on osteoclastic activity which was more important on HA/bTCP and could be RANKL dependent. This may impact the bone resorption/formation balance. Taken together, our results show that the associated scaffold impact MSCs persistence on the graft site, as well as their direct and paracrine effects leading to a variability in new bone amount.As bone formation was observed with only 70% of our donors, we then evaluated differences between the two groups. In vitro, no differences in cell proliferation, differentiation or phenotype were detected. Furthermore, transcriptomic and secretomic analysis in vitro did not identify any variability. The assessment of cell behavior in vivo showed that persistence of grafted cells was donor dependent and was not linked to a vascularization failure or a higher apoptosis. However, our results highlighted a correlation between bone formation and the ability of hBMSCs to attach and survive on the biomaterial as well as to contribute to bone formation by direct and paracrine effects.In conclusion, this work show that the efficacy of bone formation depend on the behavior of grafted hBMSCs. The origin (donor) and the microenvironment (associated scaffold) will impact their adhesion, survival and mechanisms of action during bone regeneration. Moreover, we identified that the osteogenic potential of hBMSCs act through a direct contribution that is synergic to a paracrine effect for host cell chemoattraction and differentiation.

Grâce à leurs propriétés de différenciation, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) constituent aujourd’hui un outil en médecine régénérative. La moelle osseuse reste une des plus utilisées. Une diminution de la capacité de prolifération et de différenciation des CSM-MO, au cours des passages, a été montrée. En parallèle, certaines études montrent que l'impact de l'âge du donneur sur les propriétés de CSM-MO reste encore controversé. Le but de notre étude était de mieux comprendre l'effet de l'âge du donneur mais aussi des passages en culture sur la capacité de prolifération et de différenciation des CSM de moelle osseuse. Les échantillons ont été séparés en 4 groupes en fonction de l’âge des donneurs (<20 ans; 20-40 ans; 40-60 ans; >60 ans) et les analyses ont été réalisés lors de la culture de cellules pendant 5 passages. Les résultats obtenus montrent que la capacité de prolifération de CSM-MO obtenues à partir de donneurs jeunes est supérieure à celle de cellules des donneurs âgés. De plus, cette capacité de prolifération diminue en fonction des passages en culture. En parallèle, la capacité des cellules à former des colonies, mesurée par le test CFU-F, diminue légèrement en fonction de l’âge des donneurs mais de façon importante en fonction du passage. Enfin, la capacité de différenciation des CSM-MO vers les trois types cellulaires étudiés, diminue en fonction des passages de cellules mais également en fonction de l’âge des donneurs. Notre étude montre que les propriétés des CSM issues de moelle osseuse sont modifiées lors de l’amplification in vitro mais aussi en fonction de l’âge des donneurs / Today with their properties of differentiation into specific cells types, mesenchymal stromal cells (MSC) can be used in regenerative medicine. Bone marrow (BM) is the better characterized one. The researchers have proven that with increasing passage number in culture the proliferation and differentiation potential of MSC decrease. In parallel many researchers have showed the impact of donor age on MSC properties remains controversial. The aim of our study was to better understand the effect of donor age but also culture passages on the proliferation and differentiation ability of bone marrow mesenchymal stromal cells. The samples were separated into 4 groups depending on the donor age (<20 years; 20-40 years; 40-60 years; > 60 years) and The samples were cultured for 5 passages. The results obtained show that the MSC proliferative capacity obtained from young donors is greater than that of cells from older donors. In addition, the proliferative capacity decreases with increasing passage number in culture. In parallel, the ability of colony-forming unit-fibroblast, measured by the CFU-F assay, decreases slightly depending on the age of the donors but significantly depending on the passage. Finally, the MSC differentiation ability decreases according to the passage of the cells but also depending on the donor age. Our study shows that the properties of bone marrow derived MSC are modified not only during amplification in vitro but also in terms of donor age

Au début de ma thèse, je me suis intéressé aux processus qui sous-tendent la communication cellulaire et plus spécifiquement les interactions cellule-cellule. Pourquoi une cellule établit-elle un contact spécifique avec une autre cellule ? Comment les cellules répondent-elles à cette interaction et quels en sont les effets ? J'ai utilisé comme modèle d'étude l'interaction entre les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) et des lignées de cancer du sein. L'objectif de mon travail a été d'analyser les mécanismes de ces interactions entre CSM et cellules cancéreuses et d'en évaluer les effets sur les fonctions des cellules cancéreuses. En effet, des mécanismes de recrutement des CSM aux sites tumoraux ont été décrits avec des effets sur la progression tumorale, ce qui ouvre par ailleurs des perspectives pour de nouvelles approches thérapeutiques. J'ai tout d'abord développé un système expérimental de microscopie confocale en temps réel pour observer le type d'interaction qui est produit entre les CSM humaines et les cellules de carcinomes mammaires MDA-MB-231 et MCF7. J'ai constaté la formation dynamique de structures tubulaires entre les deux types cellulaires et, de façon surprenante, le passage des mitochondries des CSM vers les cellules cancéreuses. En un deuxième temps, j'ai utilisé un système d'invasion dans une matrice 3D de collagène, que nous avons adapté à la coculture, afin d'observer les effets de l'interaction des MDA-MB-231 avec les CSM. En accord avec la littérature, nous avons constaté une augmentation du pouvoir invasif des cellules cancéreuses, effet qui pouvait être lié au transfert des mitochondries provenant des CSM. Pour répondre à cette question, j'ai mis au point un protocole pour transférer spécifiquement des mitochondries, isolées à partir de cellules, vers d'autres cellules. Ce protocole, exploité dans ce manuscrit pour le transfert de mitochondries de CSM vers les cellules cancéreuses MDA-MB-231, peut être transposé à d'autres types cellulaires et fait l'objet d'une demande de brevet. Nos données indiquent que l'acquisition de mitochondries de CSM par les cellules cancéreuses modifie leurs propriétés fonctionnelles et augmente leur capacité de prolifération et d'invasion. Concernant leur activité métabolique, on observe une augmentation de leur respiration mitochondriale et de leur production d'ATP. Nos données préliminaires suggèrent aussi une augmentation de l'expression transcriptionnelle d'enzymes impliquées dans la synthèse des lipides et l'oxydation des acides gras. Ces données, générées grâce au protocole de transfert artificiel de mitochondries mis au point, montrent pour la première fois que les mitochondries des CSM peuvent majorer certaines propriétés cellulaires liées à la progression tumorale, comme la prolifération et l'invasion, et contribuer à une reprogrammation métabolique des cellules cancéreuses. Elles s'intègrent au rôle proposé par la communauté scientifique pour les CSM dans le microenvironnement tumoral. La technique de transfert artificiel de mitochondries nous permettra de répondre à d'autres questions restées ouvertes, comme le rôle possible des mitochondries des CSM dans les résistances développées par les tumeurs vis-à-vis des agents anti-cancéreux. Le protocole de transfert de mitochondries développé au laboratoire constitue une technique de choix et offre de nombreux avantages comparativement à d'autres techniques comme la micro-injection et la génération des hybrides cytoplasmiques. Sa mise en œuvre est en effet simple et reproductible et permet de traiter une grande quantité de cellules. Cette méthode permet d'envisager de nombreuses perspectives et applications dans le domaine de la reprogrammation métabolique, comme par exemple de restaurer les capacités d'une cellule dysfonctionnelle par le transfert de mitochondries issues d'une cellule saine et « métaboliquement active ». / At the beginning of my thesis, I was interested in the process involved in cell communication, more specifically in cell-to-cell interactions. Why does a cell specifically establish contacts with another one, how do cells respond to these interactions and what are the effects? As a model to answer these questions, I studied the interactions between MSCs and two breast cancer cell lines. The study of the communications between MSCs and tumor cells is an alternative to explore and understand tumor progression. MSC recruitment to the tumor is shown to favor the progression of the disease. The mechanisms of this dialogue are multiple and are the object of a great number of studies that aim at finding new therapeutic approaches. The objective of this work was to analyze the interactions between MSCs and cancer cells and evaluate the potential effects of this communication in tumor progression. First, I developed an experimental system of real time confocal microscopy in order to observe the interaction produced between MSCs and the breast carcinoma MDA-MB-231 and MCF-7 cells. I noticed the dynamic formation of tubular structures between the two different cell types and, surprisingly, the passage of mitochondria from MSCs to the cancer cells. Second, we used a 3D system of cell invasion in a collagen matrix, which we adapted for the coculture, in order to observe the effects of the interactions between the MDA-MB-231 and MSCs. In agreement with the literature, we observed an increase in the migratory potential of the cancer cells, an effect that could be linked to the transfer of mitochondria from MSCs to the cancer cells. To answer this question, I set up a protocol to specifically transfer to the cancer cells mitochondria isolated from the MSCs and test directly the functional consequences for the cancer cells. This protocol can be used to transfer mitochondria, not only from MSCs but also from other cells. This method is currently submitted to a patent process. Our results show that the transfer of MSC mitochondria to the cancer cells modifies cancer cells functional properties and increase their invasive and proliferative capacities. Concerning the metabolic activity, we noticed an increase in mitochondrial respiration and ATP production. We also observed an increase in the transcription level of enzymes related to the lipid synthesis and fatty acid oxidation. The results generated with this new protocol of mitochondria transfer show, for the first time, that mitochondria originating from MSCs can improve cellular capacities linked to the tumor progression. The role proposed by the scientific community for the interactions of MSCs with the tumor cells fits with the data generated in our work. Several questions remain open. In particular, could the transfer of mitochondria from MSCs to the cancer cells contribute to the acquisition of resistance to anti-cancer agents observed in patients? The protocol of transfer of mitochondria that we developed in the laboratory is a technique of choice and offers many advantages over other techniques such as microinjection and cytoplasmic hybrids; its implementation is simple and reproducible and can target large numbers of cells. This method opens numerous perspectives and potential applications such as the study of metabolic reprogramming. Thus, we could consider restoring the activity of dysfunctional cells by transferring mitochondria from “metabolically active” or healthy cells. In the long term, one of the applications could be transferring healthy or genetically modified mitochondria to zygotes carrying mitochondrial DNA mutations, in order to treat pathologies like infertility, neuro-degenerative diseases, cancer and premature aging.

Les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) sont les tumeurs mésenchymateuses les plus fréquentes du système digestif. Elles ont pour origine les cellules interstitielles de Cajal (ICC) ou les cellules précurseurs mésenchymateuses communes aux ICCs et aux cellules musculaires lisses (SMC). Les GISTs sont des tumeurs qui sont chimiorésistantes et radiorésistantes. L'identification de mutations activatrices des gènes KIT (75-80%) ou/et PDGFRA (5-10%) a ouvert la voie à un traitement systémique chez les patients GIST sous forme d'Imatinib, un inhibiteur de tyrosine-kinase. Si ce traitement aboutit à une réponse clinique d'amélioration, un certain nombre d'effet secondaire sont néanmoins observés, comme les résistances au traitement. Afin d'améliorer le traitement initial, la physiopathologie du GIST doit progresser. La musculature de l'appareil digestif est une structure complexe composée de SMCs, de neurones entériques, de fibroblastes et d'ICCs. Au cours du développement, le mésoderme splanchnique donnera lieu au moins à deux types de cellules, les SMCs et les ICCs. Récemment, notre laboratoire a montré que la protéine de liaison à l'ARN RBPMS2 (pour RNA Binding Protein with Multiple Splicing 2) est impliquée dans le développement et le remodelage des SMCs digestives. Les travaux que j'ai réalisés au cours de ma thèse avaient pour objectifs d'étudier l'expression et la fonction de RBPMS2 dans les tumeurs GISTs humains. Nous avons analysé l'expression de RBPMS2 dans les GIST humains et nous avons démontré que RBPMS2 était fortement exprimé dans les tumeurs GISTs de manière indépendante de l'activité KIT. Nous avons également analysé la fonction de RBPMS2 en culture et avons montré que l'expression ectopique de RBPMS2 dans les SMCs humaines adultes et différenciées culture conduisaient à l'augmentation de leur taux de prolifération et altèreraient leur différenciation. Ces résultats suggèrent que RBPMS2 et les voies de signalisation qu´il contrôle pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles dans la thérapie des tumeurs GISTs. / Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are the most common mesenchymal neoplasm of the GI tract. They are supposed to arise from the interstitial cells of Cajal (ICCs) or from a mesenchymal precursor cell, common of ICCs and smooth muscle cells (SMCs). GISTs are highly resistant to conventional chemotherapy and radiotherapy. However, a targeted therapy is now proposed. These tumors have activating mutations in two closely related genes, the KIT (75-80%) or/and the PDGFRA (5-10%). Targeting these mutated activated proteins with Imatinib mesylate, a small-molecule tyrosine kinase inhibitor, has proven efficient in GIST treatment. However, resistance to Imatinib finally develops and new-targeted therapies are necessary. The musculature of the gastrointestinal (GI) tract is a highly complex structure composed of visceral SMCs, enteric neurons, fibroblast-like cells and ICCs. During the development, the splanchnic mesoderm will give rise at least to two cell types, ICCs and SMCs. Recently our laboratory showed that the RNA Binding Protein with Multiple Splicing 2 (RBPMS2) is involved into the development and remodeling of SMC.My PhD works investigate the expression and function of RBPMS2 in human GISTs. We analyzed the expression of RBPMS2 in human GISTs and we found that RBPMS2 was abnormally highly expressed in the tumoral cells of GISTs. We also analyzed the function of RBPMS2 into human adult SMC cell culture and demonstrated that ectopic expression of RBPMS2 in mature and differentiated SMC cultures increases their proliferation rate and alters their differentiation. These findings suggest that RBPMS2 could be a potential target for cancer therapy.

Les cellules stromales/souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton humaines (CSM-WJ) représentent une source abondante et intéressante de cellules souches pour des applications en ingénierie cellulaire et tissulaire. Leur origine fœtale leur confère des caractéristiques spécifiques par rapport aux cellules stromales/souches mésenchymateuses isolées à partir de moelle osseuse humaine (CSM-MO). Tout d'abord, le but de ce travail est d'optimiser les conditions de culture des CSM-GW pour leur utilisation clinique ultérieure. Nous nous concentrons sur l'influence de la concentration en oxygène lors de l'expansion en monocouche de P1 à P7 sur plusieurs paramètres permettant de caractériser les CSM. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Notre travail a montré des différences entre les deux sources cellulaires en termes de prolifération et de différenciation adipocytaire. D’après nos résultats, l'hypoxie, au cours de l'expansion, est un paramètre important à prendre en compte en ce qui concerne la prolifération et le potentiel de différenciation chondrocytaire. L'influence des facteurs obstétricaux sur les caractéristiques des CSM-GW est également explorée. Cette étude se situant également dans le cadre de l’ingénierie tissulaire du cartilage, la seconde phase du projet consiste à induire la différenciation des cellules en chondrocytes en ensemençant ces dernières dans un biomatériau à base d’alginate et d’acide hyaluronique, et sur une cinétique de 28 jours. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Après 4 semaines de culture, les CSM-GW sont capables de s'adapter à leur environnement et d’exprimer des gènes et des protéines matriciels spécifiques du cartilage tels que le collagène de type 2, qui se trouve plus exprimé après différenciation à partir des CSM-GW qu’à partir de CSM-MO / Mesenchymal Stromal/Stem Cells from human Wharton’s jelly (WJ-MSC) are an abundant and interesting source of stem cells for applications in cell and tissue engineering. Their fetal origin confers specific characteristics compared to Mesenchymal Stromal/Stem Cells isolated from human bone marrow (BM-MSC). First, the aim of this work is to optimize WJ-MSC culture conditions for their subsequent clinical use. We focus on the influence of oxygen concentration during monolayer expansion on several parameters to characterize MSC. The results are compared to those obtained with BM-MSC. Our work distinguishes WJ-MSC from BM-MSC in terms of proliferation and adipogenic differentiation. Considering our results, hypoxia during cell expansion is an important parameter to take into account regarding proliferation potential but also chondrogenic differentiation potential. The influence of obstetric factors on WJ-MSC characteristics is also explored. In cartilage tissue engineering context, the second phase of the project is to induce cell differentiation into chondrocytes by seeding them in Alginate/Hyaluronic Acid hydrogel scaffold, and during 28 days. The results obtained are compared to those obtained with BM-MSC. After 4 weeks of culture, WJ-MSC are able to adapt to their environment and express specific cartilage-Related genes and matrix proteins such as type 2 collagen, which is found more expressed after differentiation fromWJ-MSC, than from BM-MSC

Chef de file des inhibiteurs de tyrosines kinase, l’Imatinib Mesylate (IM) a révolutionné la prise en charge de la leucémie myéloïde chronique et des tumeurs stromales gastro-intestiales. En plus de son action directe sur les cellules tumorales, une partie de l’efficacité thérapeutique de l’IM a été attribuée à son aptitude à moduler la réponse immunitaire. Cette propriété soulève la possibilité que les résultats cliniques de l’IM pourraient être améliorés en le combinant efficacement à une immunothérapie. A cet effet, nous avons montré dans un modèle préclinique que l’interleukine-2 (IL-2) – adjuvant des cellules NK – augmente l’efficacité de l’IM. Nous avons également démontré une efficacité supérieure de l’IM en association au cyclophosphamide (CTX) du fait de l’inhibition des lymphocytes T régulateurs. Nous avons donc entrepris un essai clinique de phase 1 associant l’IM, l’IL-2 et le CTX chez des patients ayant une tumeur solide métastatique ou localement avancée. Les objectifs de cet essai sont (i) de déterminer la dose maximale tolérée d’IL-2 associée à l’IM et au CTX ; (ii) d’étudier les paramètres pharmacocinétiques de l’association ; (iii) d’évaluer l’efficacité de l’association et (iv) son effet sur les effecteurs de l’immunité. Au total, 17 patients ont été inclus dans cette étude. La DMT d’IL-2 associée à la dose fixe de 400 mg d’IM correspond à 6 MUI/j. A ce niveau de dose, tous les patients ont présenté au moins un effet indésirable imputable au traitement : principalement fièvre et frissons, augmentation des enzymes hépatiques, asthénie et nausée mais sans que ne soit observée de toxicité limitante. L’étude des paramètres pharmacocinétiques révèle une augmentation significative de l’exposition systémique à l’IM en fin de cycle et qui semble être imputable à l’IL-2. La pharmacocinétique de l’IL-2 n’est par contre pas modifiée par l’administration concomitante d’IM. Sur le plan des effecteurs de l’immunité, l’association IM, IL-2 et CTX diminue le taux de lymphocytes B, lymphocytes T (LT) CD4+ et LT CD8+ mais active les cellules NK puisqu’on observe une augmentation des marqueurs CD56bright, HLA-DR et TRAIL. De manière intéressante, la sous-population de cellules NK HLA-DR+ possède des capacités de dégranulation plus importante après exposition à cette association et son expansion est associée à une meilleure survie. Cette association pourrait donc s’avérer particulièrement intéressante dans le traitement de tumeurs sensibles d’une part à l’IM et d’autre part à la lyse par les cellules NK. Les GIST étant particulièrement sensibles à l’IM, nous avons étudié l’infiltrat tumoral présent au niveau de ses tumeurs. Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle pronostique de l’infiltrat en LT et NK sur la survie sans progression des GIST. En vue d’une étude de phase 2, les GIST apparaissent donc être un modèle tumoral particulièrement pertinent pour évaluer les bénéfices de l’association IM, IL-2 et CTX. / Imatinib mesylate (IM) was the first tyrosine kinase inhibitor to be successfully used in clinical practice and its introduction has revolutionized the management of chronic myeloid leukemia and gastrointestinal stromal tumors. In addition to its direct effects on malignant cells, IM appears to exert immunological off-target effects that contribute to its anticancer effects. Thus, combining IM with immunotherapy might improve patients’ clinical outcome. Indeed, IM combined to Interleukin-2 (IL-2) - a cytokine that enhances natural killer (NK) cells functions - improved antitumor responses in preclinical models. We also observed synergistic effects of cyclophosphamide (CTX) and IM as a result of the inhibition of regulatory T lymphocytes. Based on the promising results of these preclinical studies, we developed a phase 1 clinical trial which combines metronomic CTX, IM and escalating doses of IL-2 in patients affected by refractory solid tumors. The goals of this study were (i) to determine the maximum tolerated dose of IL-2 combined with IM and CTX ; (ii) to study the pharmacokinetics of IM and IL-2 ; (iii) to evaluate clinical efficacy of the combined therapy and (iv) effects of the association on immune parameters. A total of 17 patients were enrolled in the study. The maximum tolerated dose of IL-2 combined with IM, given at a constant dose of 400 mg was determined to be 6 MIU/day. At this dose level, all patients experienced at least one treatment-related adverse event: fevers and chills, transaminase elevation, fatigue and nausea but no dose-limiting toxicities were observed. Pharmacokinetic studies revealed that the co-administration of IL-2 increases the systemic exposure of patients to IM. In contrast, the pharmacokinetics of IL-2 was not modified by IM. The combined therapy markedly reduced the absolute numbers of B lymphocytes, CD4+ T cells and CD8+ T cells in a IL-2 dose-dependant manner. The NK cell compartment was activated, exhibiting a significant upregulation of CD56bright, HLA-DR and TRAIL. Interinstingly, the abundance of HLA-DR+ NK cells after one course of combined therapy positively correlated with both progression free- and overall survival. Thus, it could be of interest to evaluate this immunotherapeutic regimen in a tumor model sensitive to IM and to lysis by NK cells and evaluate whether the adjunction of IL-2 can boost the efficacy of IM. GIST are particularly sensitive to IM, thus we performed a retrospective study of the immune infiltrates and their prognostic value in these tumors. We found that both LT and NK cell infiltrates were independent prognostic factors for progression-free survival. For a phase 2 clinical trial, gastrointestinal stromal tumors appear to be a particularly relevant to evaluate the benefits of the association IM, IL-2 and CTX.