L'architecture des plantes est le résultat combiné des développements des structures topologique et géométrique qui interviennent dans l'acquisition de la biomasse et sa répartition sous l'influence des processus physiologiques. Pourtant cet aspect a été longtemps négligé dans la communauté des modèles dynamiques. Récemment les modèles structures fonction se sont montrés pertinents pour prendre en compte des questions comme les interactions plantes environnement (l'interception de la lumière), les interactions entre croissance et développement (répartition de la biomasse) en se plaçant au niveau de l'organe. Cependant les couts en calcul de la simulation numérique de ces processus rendent les applications impraticables en agriculture. Cette thèse vise a combiner le modèle structure fonction Greenlab avec d'une part un modèle de culture et d'autre part un modèle forestier basés sur le peuplement afin d'y introduire le concept d'architecture des plantes. Le modèle de culture Pilote fournit des prédictions de récoltes basés sur les paramètres de l'environnement (radiation, précipitations) et l'indice foliaire et l'indice de récolte. Une étude sur Maïs conjointe entre Pilote et GreenLab a permis d'expliciter en détail les paramètres de la production. Les indices foliaires et de récolte dépendent directement des paramètres sources puits, et la variabilité individuelle entre plantes est explicitée directement par les variations des retards a la germination et celles des surfaces disponibles par plantes (compétition spatiale). Tous ces paramétrés peuvent être calibré par méthodes inverses. Ainsi la jonction des deux types de modèles est réalisée au niveau du passage de la plante au peuplement.Une autre étude conjointe a été effectuée avec le modèle forestier empirique PNN qui modélise la croissance des peuplements forestiers de Pins noirs. A partir des données statistiques classiques sur les mesures de troncs et de houppiers, combinées avec les connaissances architecturales du Pin issues d'AMAP, GreenLab peut restituer l'architecture de l'arbre et visualiser des scenarios de sylviculture incorporant des élagages. Le procédé va jusqu'à l'obtention d'images de synthèse réalistes des peuplements. En conséquence il semble efficace de coupler les modèles de cultures et les modèles forestiers qui intègrent les connaissances écophysiologiques au niveau peuplement avec les modèles structures fonctions qui intègrent ces connaissances au niveau de l'architecture de la plante. Le modèle GreenLab par ses affinités avec ces deux types de modèles et ses performances en calcul, permet d'apporter un complément d'information essentiel sur la description du fonctionnement d'un peuplement tant du point de vue développement, que du point de vue des relations sources puits dans la plante. Enfin le modèle couplé a une plateforme comme Xplo (AMAP) permet en plus une simulation réaliste 3D du peuplement végétal aux divers stades de la croissance. / Plant architecture implies the development of both topological and geometrical structure over time, which determines resource acquisition, in the meantime interacts with physiological processes. However it has long been overlooked in traditional community dynamics models. Based on plant architecture, functional-structural plant models (FSPM) have showed their particular capability in addressing questions like interactions between plant and environment (e.g. light interception), between structure development and growth (e.g. carbon allocation), as they take into account morphogenesis with organ-level explicit descriptions. Anyway, high demand of time and memory for simulation and inverse calculation prevents FSPM from further agricultural or sylvicultural practice. This thesis attempts the combination of a mathematic FSPM GreenLab and a crop model or an empirical forest model (EFM) to introduce individual-based architectural support for community growth study. In the case of maize, disagreement from stand level (by crop model PILOTE) and individual level (by GreenLab) growth simulations implies different emergence time of individuals, which is used to quantify the distribution. By supposing that theoretical projective area (Sp) is determined by the growth situation and the final size of individual architecture, the variance of Sp is reversely computed with the variance of organ compartment measurements to characterize individual variability. In the case of Black pine, architecture dynamics built in GreenLab according to Rauh's model (architecture model for pine tree) are adapted to the simulation of an EFM PNN. As a consequence, thinning scenarios are well incorporated in the final stand visualization. From these preliminary applications, following conclusions can be drawn: (i) FSPM is able to provide individual performances (i.e. organ development and expansion) inside an area of crop field for crop models. (ii) The crop model may regulate the combined form of individuals from integral level. Both aspects are significant to deepen understanding of stand growth. (iii) Architecture conceptions integrated in FSPM may be adapted to EFM simulations for a data-driven visualization. (iv) EFM can guarantee ecological/sylvicultural function for 3D stand visualization. To take into consideration biomass processes, additional observations are needed. As models are independent in combinations, the same methods can be extended to linkage with other stand models.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

Dans la perspective de trouver de nouvelles thérapies dans le traitement du diabète de type II, non insulino-dépendant, le Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) constitue un excellent candidat. Si son mécanisme d'action est bien connu, il reste toutefois à résoudre de grands problèmes fondamentaux, avant de le substituer aux molécules utilisées pour une telle pathologie. En particulier, la compréhension de la liaison du GLP-1 à son récepteur demeure un point crucial. Une meilleure connaissance des structures du ligand et du récepteur sont nécessaires. De plus, ce peptide ne peut être utilisé dans sa forme native, dû à une inactivation rapide par les protéases.<br /><br />Pour essayer d'augmenter la stabilité du peptide, et en tenant compte des positions clés définies dans la littérature, plusieurs analogues du GLP-1-(7-37) sont conçus, et synthétisés. Ils possèdent principalement des pharmacomodulations au niveau de la partie N-terminale. Des substitutions sont également réalisées dans la partie centrale du peptide, permettant de vérifier certaines hypothèses concernant sa conformation. Considérant les résultats de liaison et d'efficacité in vitro, certains analogues sont sélectionnés pour des études in vivo d'activité et de stabilité métabolique. Le [a8,desR36]GLP-1-(7-37) se distingue des autres tant par sa grande stabilité que son efficacité, supérieure à la molécule native. Ce composé est en phase de développement pré-clinique.<br /><br />Parallèlement, la conformation de chaque analogue est étudiée (CD, IR) et ainsi, confrontée aux résultats in vitro, il est possible de proposer une conformation bioactive.<br /><br />Enfin, pour appréhender plus en avant les mécanismes de liaison du peptide avec son récepteur spécifique, la modélisation moléculaire du récepteur fait ressortir quelques hypothèses quant à la localisation probable de l'interaction hormone-récepteur. Des analyses biophysiques et la synthèse de fragments du récepteur, ont permis d'étayer de telles hypothèses.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

La modélisation de la croissance des plantes a vu le jour à la fin du XXème siècle, à l'intersection de trois disciplines : l'agronomie, la botanique et l'informatique. Après un premier élan qui a donné naissance à un grand nombre de modèles, un deuxième courant a vu le jour au cours de la dernière décennie pour donner à ces modèles un formalisme mathématique et statistique. Les travaux développés dans cette thèse s'inscrivent dans cette démarche et proposent deux axes de développement, l'un autour de l'évaluation et de la comparaison de modèles, et l'autre autour de l'étude de la variabilité inter-plantes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la capacité prédictive des modèles de croissance de plantes, en appliquant une méthodologie permettant de construire et d'évaluer des modèles qui seront utilisés comme outils prédictifs. Une première étape d'analyse de sensibilité permet d'identifier les paramètres les plus influents afin d'élaborer une version plus robuste de chaque modèle, puis les capacités prédictives des modèles sont comparées à l'aide de critères appropriés. %Cette étude a été appliquée au cas de la betterave sucrière. La deuxième partie de la thèse concerne la prise en compte de la variabilité inter-individuelle dans les populations de plantes. %Il existe en effet une forte variabilité entre plantes, d'origine génétique ou environnementale, dont il est nécessaire de tenir compte. Nous proposons dans cette thèse une approche basée sur l'utilisation de modèles (non linéaires) à effets mixtes pour caractériser cette variabilité. L'estimation paramétrique par maximum de vraisemblance nécessite l'utilisation de versions stochastiques de l'algorithme d'Espérance Maximisation basées sur des simulations de type Monte Carlo par Chaîne de Markov. Après une première application au cas de l'organogenèse chez la betterave sucrière, nous proposons une extension du modèle structure-fonction Greenlab à l'échelle de la population.%, appliqué aux cas de la betterave sucrière et du colza.

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Les protéines de la famille L7Ae sont les constituants de nombreuses RNP essentielles. Chez les vertébrés, les particules snoRNP C/D et H/ACA sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes, la UsnRNP U4 dans l'épissage des pré-ARNm, le complexe télomérase dans la réplication des télomères, et les mRNP SECIS dans la traduction des sélénoprotéines. Comme c'est le cas pour la majorité des RNP eucaryotes, leur assemblage, sous forme d'entités fonctionnelles, ne constitue pas un processus autonome et requiert l'intervention de facteurs spécialisés. En basant notre étude sur l'assemblage des snoRNP C/D, dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, et en utilisant des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de génétique, nous avons entrepris de caractériser ces événements. Nos travaux ont contribué à identifier un ensemble de protéines, agissant de façon coordonnée au sein d'une machinerie conservée entre la levure et l'homme. Cette dernière est composée de deux principales sous-unités : (i) Rsa1p/NUFIP, une protéine plate-forme, qui interagit avec certaines protéines de la famille L7Ae et facilite l'assemblage des RNP, (ii) le complexe R2TP (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), qui pourrait opérer des remodelages conformationnels nécessaires à la formation des RNP matures. En plus de ces acteurs centraux, d'autres facteurs sont apparus intimement liés à ce mécanisme. La protéine Hit1p/TRIP3, interagit notamment avec Rsa1p/NUFIP et s'est avéré requise pour assurer sa stabilité chez la levure. La chaperonne HSP90, dont le rôle est prédominant chez l'homme, exerce son activité sur certains constituants des RNP. Enfin, la protéine Bcd1p/BCD1 pourrait être associée à cette machinerie dans le cadre spécifique de l'assemblage des snoRNP C/D / The L7Ae family proteins are essential components of many RNPs. In vertebrates, C/D and H/ACA snoRNPs are involved in ribosome biogenesis, the U4 snRNP in pre-mRNA splicing, the telomerase complex in telomeres replication, and mRNP SECIS in selenoproteins translation. Like most eukaryotic RNPs, assembly in functional entities is not an autonomous process and requires the intervention of specialized factors. Basing our study on the assembly of C/D snoRNP in the model organism Saccharomyces cerevisiae, and using approaches of molecular biology, biochemistry and genetics, we undertook to decipher these mechanisms. Our work has helped to identify a set of proteins, acting in a coordinated manner within a machinery conserved between yeast and human. This machinery consists of two major subunits: (i) Rsa1p/NUFIP, a platform protein that interacts with some proteins of the L7Ae family and facilitates the RNPs assembly, (ii) the R2TP complex (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), which could induce conformational remodeling necessary for the formation of mature RNPs. In addition to these key players, other factors appeared closely linked to this mechanism. The Hit1p/TRIP3 protein interacts with Rsa1p/NUFIP and is required to ensure its stability in yeast. HSP90 chaperone, whose role is predominant in human, operates on some components of the RNPs. Finally, the Bcd1p/BCD1 protein is associated specifically with this machinery during C/D snoRNPs assembly

Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/ L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/ L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque. / The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/ Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/ Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure.