Le monoxyde d’azote (NO), dont le rôle biologique a été découvert à la fin du 20ème siècle, est impliqué dans la régulation de nombreux processus à l’échelle de la cellule et de l’organisme. Sa biosynthèse est réalisée par les enzymes NO synthases (NOS), et met en jeu la liaison de NADPH à leur domaine réductase suivie d’une série de transfert d’électrons vers leur domaine oxygénase, où la formation de NO se produit par oxydation de la L-arginine. En s’inspirant de mimes photo-activables de NADPH précédemment décrits dans la littérature, appelés nano-déclencheurs (NT, de l’anglais nanotriggers), induisant la production de NO par illumination, nous avons conçu et synthétisé de nouvelles générations de composés potentiellement capables d’initier l’activité catalytique de NOS sous irradiation. Ils comportent une unité de reconnaissance de NOS dérivée de l’adénosine et une unité chromophorique de type diaminophényl butadiène, liées entre elles par un groupement triazole. Ces structures modulables, facilement assemblées par chimie « click » ont permis la préparation d’une librairie de nano-déclencheurs, dont les propriétés photophysiques et la stabilité dans des conditions physiologiques ont été évaluées. Ces nouvelles générations de composés offrent des perspectives intéressantes pour le contrôle de processus biologiques par la lumière. / Nitric oxide (NO), whose biological role has been discovered in the late 20th century, is involved in the regulation of many processes in cell and organism. Its biosynthesis is carried out by enzymes named nitric oxide synthases (NOS) and involves NADPH binding to their reductase domain followed by a series of electron transfers to their oxygenase domain, where the formation of NO takes place by oxidation of L-arginine. Inspired by photoactivatable NADPH mimics called nano-triggers (NT), previously described in the literature, able to produce NO upon illumination, we designed and synthesized new generations of compounds potentially capable of initiating the catalytic activity of NOS under irradiation. They contain a recognition unit for NOS derived from adenosine and a diaminophenyl butadiene chromophoric moiety, linked together by a triazole group. These modular structures, easily assembled by "click" chemistry allowed the preparation of a library of nano-triggers, whose photophysical properties and stability under physiological conditions were evaluated. These new generations of compounds offer interesting perspectives for the control of biological processes by light.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T13:14:56Z No. of bitstreams: 1 diegopandelojose.pdf: 913814 bytes, checksum: 7e149c7c8e0bee3253c4894426a6892c (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:36:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 diegopandelojose.pdf: 913814 bytes, checksum: 7e149c7c8e0bee3253c4894426a6892c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diegopandelojose.pdf: 913814 bytes, checksum: 7e149c7c8e0bee3253c4894426a6892c (MD5) Previous issue date: 2009-03-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae, inclusa no clado Asteridaee, ordem Lamiales, compreendendo aproximadamente 175 gêneros e 2800 espécies, onde muitos gêneros apresentam plantas com propriedades medicinais e ornamentais. A espécie Lippia alba, originária da América do Sul, também ocorre no Brasil e é uma das mais estudadas do gênero Lippia. Ela floresce durante o ano todo e recebe grande destaque no gênero, devido às suas inúmeras propriedades medicinais. O óleo essencial de Lippia alba é composto basicamente por sesqui e monoterpenos, que são as substâncias responsáveis por suas propriedades medicinais. O objetivo central do presente trabalho foi clonar e analisar a expressão de dois potenciais genes codificadores de terpeno sintases em Lippia alba. Através do alinhamento de genes codificadores de monoterpeno sintases caracterizadas, primers degenerados foram desenhados dentro de regiões conservadas e utilizados para se obter a clonagem de genes codificadores de terpeno sintases em Lippia alba. Dois potenciais genes codificadores de terpeno sintases foram clonados, LaTPS12 e LaTPS23. Após a clonagem, técnicas de RT-PCR semiquantitativo foram empregadas para análises de expressão desses dois genes em diferentes estágios foliares e em três diferentes quimiotipos de Lippia alba. Os resultados mostraram que em folhas situadas no quarto segmento nodal o gene LaTPS12 apresenta maior nível de expressão. A diferença na expressão do gene LaTPS23 foi menos acentuada nos três quimiotipos analisados em relação ao gene LaTPS12, que apresentou uma expressão diferencial. Análises filogenéticas foram realizadas comparando-se as seqüências desses dois genes com outros genes codificadores de terpeno sintases já caracterizadas de diferentes espécies de plantas. De acordo com essas análises, LaTPS12 e LaTPS23 pertencem à classe TPS-b, que é composta principalmente por monoterpeno sintases de angiospermas. / The genus Lippia belongs to Verbenaceae family, Asteridaee, order Lamiales. This family comprises about 175 genus and 2800 species, and many of them have medicals and ornamentals proprierties. Lippia alba is native from South America, and is also found in Brazil and is the most studied species of the genus Lippia. This plant blooms throughout the year and has great importance due to its medicinal properties. The Lippia alba essential oils are composed by sesquiterpenes and monoterpenes conferring its medicinal properties. The aim of this work was to clone and to analize gene expression of putative terpene synthases genes (TPS) in Lippia alba. Alignment of TPS genes was used to design degenerate primers into conserved domains for cloning of these genes in Lippia alba. We have cloned two putative TPS genes, LaTPS12 and LaTPS23. After cloning, semiquantitative RT-PCR was employed to expression analysis of these two genes in different leaf stages and among three different chemotypes of Lippia alba. The result of expression level showed that LaTPS12 occurred at higher level in leaves located in fourth nodal segment and showed a marked differential expression among the chemotypes. The difference of expression of the LaTPS23 was less prominent comparing the three studied chemotypes. We performed a phylogenetic analysis in order to compare the LaTPS12 and LaTPS23 to others TPS genes in different plant species. The results showed that these LaTPS12 and LaTPS23 belong to the class TPS-b, which comprises mainly angiosperms monoterpene synthases genes.

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Marta Cristina Teixeira Duarte / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T21:03:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_Paula_M.pdf: 7905078 bytes, checksum: 6735b6d77cec7c206090abaa6e56fdfc (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os micro-organismos associados ao continente Antártico apresentam populações diversas e metabolicamente ativas, porém o potencial farmacológico dos compostos obtidos pelos micro-organismos é pouco conhecido. As bactérias são importante fonte de compostos utilizados atualmente como antimicrobianos, e as principais vias de biossíntese de muitos antibióticos são catalisadas pelos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). O presente estudo teve como objetivo a avaliação genética e funcional da produção de compostos antimicrobianos obtidos de bactérias isoladas na Baía do Almirantado, Antártica, a identificação taxonômica das bactérias que apresentaram tal potencial e a identificação do perfil químico dos compostos antimicrobianos. O total de 153 bactérias foi isolado do ambiente antártico, 127 isolados apresentaram pelo menos um dos genes PKSI, PKSII e NRPS. Estes foram identificados através do sequenciamento parcial do gene RNA ribossomal 16S e pertencem a 28 gêneros distintos, sendo representantes dos Filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes. A avaliação funcional da produção de antimicrobianos foi realizada com o total de 76 isolados dos quais 30 isolados formaram halos de inibição frente a micro-organismos testes. Os extratos brutos obtidos foram avaliados quanto à concentração inibitória mínima (MIC) frente a oito micro-organismos não virulentos, e 18 extratos brutos apresentaram atividade inibitória, onde se destaca o extrato denominado E131, obtido da bactéria do gênero Streptomyces, que apresentou atividade bacteriostática frente S. aureus e M. luteus, e atividade bactericida frente a C. albicans e B. subtilis. Frente a micro-organismos isolados de amostras clínicas, 11 extratos brutos apresentaram atividade inibitória frente a quatro cepas de Neisseria meningitides, com MIC dos extratos brutos variando de 0,0313 mg.mL-1 até 2,0 mg.mL-1. O extrato E46, obtido da bactéria Pseudoalteromonas sp., destacou-se quanto à atividade inibitória observada frente às quatro cepas avaliadas. Frente à cepa B4, destacam-se a atividade antimicrobiana dos extratos brutos obtido das bactérias Pseudoalteromonas sp. e Pseudomonas azotoformans CUG12536. Frente à cepa YUSA, destaca-se a atividade antimicrobiana observada pelo extrato bruto obtido da bactéria Marinilactibacillus sp., cuja atividade antimicrobiana foi relatada pela primeira vez neste gênero de bactéria. Os extratos brutos possuem em sua composição, compostos cuja atividade antimicrobiana é conhecida, como ácidos graxos e compostos cuja atividade antimicrobiana não está descrita na literatura. Os testes de fracionamento dos extratos frente a solventes de diferentes polaridades indicou que os extratos brutos são solúveis, em sua maioria, a solvente polar. Portanto, as bactérias isoladas da Antártica produzem compostos de interesse farmacológico e podem ser utilizadas como fonte de novos compostos. Tais resultados enfatizam a necessidade de mais estudos de bactérias associadas a ambientes extremos, como a Antártica / Abstract: Microorganisms associated with the Antarctic continent have various and metabolically active populations, but the pharmacological potential of compounds obtained by micro-organisms is poorly understood. Bacterias are an important source of compounds currently used as antimicrobial, major biosynthetic pathways of many antibiotics are catalyzed by the PKS genes (Polyketide Synthases) and NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). This study had the objective to genetic and functional evaluation of the antimicrobial activity of bacteria isolated in Admiralty Bay, Antarctica, and the taxonomic identification of bacteria that had such potential and identification of the chemical profile of antimicrobial compounds. The total of 153 bacteria was isolated from Antarctic environment, among the isolates, 127 isolates showed at least one of the genes PKSI, PKSII and NRPS. These were identified by partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene and belong to 28 different genera, with representatives of the phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. The functional evaluation of the production of antibiotic was conducted with a total of 76 isolates including 30 isolates that formed inhibition halos against test microorganisms. The crude extracts were evaluated as the minimum inhibitory concentration (MIC) against eight non-virulent microorganisms, and 18 crude extracts showed activity, highlighting the so-called E131 extract, obtained from bacteria of the genus Streptomyces, which showed bacteriostatic activity against S. aureus and M. luteus, and bactericidal activity against C. albicans and B. subtilis. Faced with microorganisms isolated from clinical samples, 11 crude extracts showed inhibitory activity against four strains of Neisseria meningitides, with MIC ranging from 0.0313 mg.mL-1 to 2.0 mg.mL-1. The E46 extract obtained from the bacterium Pseudoalteromonas sp., stood out as the inhibitory activity observed across the four evaluated strains. Faced with the strain B4, stand out the antimicrobial activity of crude extracts obtained from bacteria Pseudoalteromonas sp. and Pseudomonas azotoformans CUG12536. Against YUSA strain, Marinilactibacillus sp. crude extract showed antimicrobial activity, which was the first reported in this bacterial genus. The extracts have in their composition, antimicrobial compounds whose activity is known, such as fatty acids, and compounds whose antimicrobial activity is not described in the literature. Fractionation tests of extracts using solvents of different polarities, indicated that the crude extracts are soluble mostly the polar solvent. Therefore, the bacteria isolated from the Antarctic produce compounds of pharmacological interest and can be used as a source of novel compounds. These results highlight the need for more studies of bacteria associated with extreme environments, such as Antarctica / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

No description available.

Οι καρκίνοι του γαστρεντερικού συστήματος είναι από τους πιο συνηθισμένους τύπους καρκίνου στον αναπτυγμένο κόσμο. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι εκείνος με τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης, αλλά αντιμετωπίζεται με αρκετά καλή πρόγνωση. Αντίθετα, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι εκείνος με τη χειρότερη πρόγνωση και πολλές φορές δεν αντιμετωπίζεται. Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσεται εκτεταμένη έρευνα στα εξωκυττάρια μακρομόρια των καρκινικών ιστών και στο ρόλο τους στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, όπως επίσης και στις δυνατότητες επηρεασμού των παραγόντων αυτών φαρμακευτικά. Η παρούσα Διατριβή έχει δύο στόχους, ο πρώτος σχετίζεται με τη μελέτη των εξωκυττάριων πρωτεογλυκανών στον καρκίνο του παγκρέατος και ο δεύτερος με τη μελέτη του μεταβολισμού του υαλουρονικού οξέος στον καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της μελέτης των βιοσυνθετικών και καταβολικών του ενζύμων. Ο πρώτος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό βιοχημικών και ανοσοϊστοχημικών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε ότι μόνο δύο πρωτεογλυκανικά μόρια ανευρίσκονται στο παγκρεατικό καρκίνωμα, η versican και η decorin. Και οι δύο πρωτεογλυκάνες εντοπίστηκαν στο στρώμα και απουσίαζαν πλήρως από τα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποστηρίζει ότι παράγονται από τις ινοβλάστες του στρώματος. Ήταν σημαντική η αύξηση των ποσοτήτων των δύο πρωτεογλυκανών στο παγκρεατικό καρκίνωμα, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας και μεγάλη η διαφορά που εμφάνιζαν μεταξύ τους. Η versican αυξήθηκε 27 φορές και η decorin 7 φορές, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Η μεγαλύτερη αύξηση της versican σχετίζεται με τις ιδιότητες της πρωτεογλυκάνης, τόσο δομικές, ενυδατικές, χωροπληρωτικές, όσο και λειτουργικές, εφ’ όσον πρόκειται για πολυλειτουργικό μόριο. Επί πλέον, η versican συμβάλλει στην κατακόρυφη αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ παράλληλα συμβάλλει και στις αντι-προσκολλητικές ιδιότητες των κυττάρων, παρέχοντας τη δυνατότητα για υπέρμετρη, και πολλές φορές ανεξέλεκτη, κυτταρική ανάπτυξη σε τοπικό επίπεδο. Το γεγονός της χαμηλότερης αύξησης της συγκέντρωσης της decorin, σε σχέση με εκείνη της versican, θα μπορούσε να αποτελεί ένα μέτρο της επιθετικότητας του καρκίνου ή ακόμα, ένα μέτρο της κακοήθειας. Η αύξηση των πρωτεογλυκανών συνοδευόταν από σημαντικότατες αλλαγές στη βιοχημική δομή τους σε επίπεδο υδροδυναμικού μεγέθους, βαθμού και προτύπου θείωσης, όπως επίσης και επιμερίωσης του γλυκουρονικού σε ιδουρονικό. Οι αλλαγές αυτές θα μπορούσε να οφείλονται σε πολλαπλές αλλοιώσεις των βιοσυνθετικών μονοπατιών τους. Ο δεύτερος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό ενζυμολογικών, ανοσοενζυμικών και μοριακών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε σε όλα τα δείγματα η παρουσία των ισομορφών υαλουρονιδάσης Hyal1 και ΡΗ20, και σε πολλαπλές μορφές, αλλά και των Hyal2 και Hyal3, όμως μόνο σε προχωρημένο στάδιο, ως επίσης και η παρουσία των τριών συνθασών του υαλουρονικού. Παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή της έκφρασης με το καρκινικό στάδιο. Η Hyal1 εκφραζόταν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα παχέος εντέρου με καρκίνο σταδίου Α, όμως η έκφρασή της ήταν πάνω από δέκα φορές μεγαλύτερη στα αντίστοιχα καρκινικά, υποστηρίζοντας ότι η Hyal1 παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα. Το γεγονός ότι η έκφραση της Hyal1 στα καρκινικά δείγματα εμφάνιζε σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, σε συνδυασμό με το δεδομένο ότι η δράση της οδηγεί στην παραγωγή αγγειογενετικών θραυσμάτων υαλουρονικού, έρχεται σε συμφωνία με το δεδομένο ότι η διαδικασία της αγγειογένεσης απαιτείται κυρίως στα αρχικά στάδια της καρκινικής εξαλλαγής. Από την άλλη πλευρά, η ΡΗ20 εμφάνιζε υψηλότερη έκφραση, σε σχέση με την Hyal1, στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Α, η οποία όμως αυξανόταν τέσσερις φορές στα αντίστοιχα καρκινικά, υποδεικνύοντας και τη δική της συμμετοχή στη 10 διαδικασία της αγγειογένεσης. Στα επόμενα στάδια υπήρχε μεν αύξηση στην έκφραση της ΡΗ20, αυτή όμως ήταν μικρή, και πιθανόν να λειτουργεί με σκοπό την ακόμα μεγαλύτερη αποικοδόμηση του υαλουρονικού ώστε να χαλαρώσει η δομή του εξωκυττάριου χώρου και να δοθεί η δυνατότητα ανάπτυξης του καρκίνου ή μετάστασης των καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα, διαπιστώθηκε μικρή αύξηση της έκφρασης της ΡΗ20 στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Β και πολύ μεγαλύτερη σε εκείνα σταδίου C. Από τον έλεγχο της έκφρασης των συνθασών του υαλουρονικού διαπιστώθηκε ότι υπάρχει σημαντική σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση της HAS1, η οποία οδηγεί στη βιοσύνθεση υαλουρονικού μεγάλου μοριακού μεγέθους, υποστηρίζοντας ότι ο καρκίνος συντονίζει την παραγωγή υαλουρονικού με μέγεθος τέτοιο που, σύμφωνα με τις χωροπληρωτικές και ενυδατικές του ιδιότητες, μπορεί να βοηθήσει την ενυδάτωση του εξωκυττάριου χώρου και την κυτταρική ανάπτυξη. Από την άλλη πλευρά, η HAS2 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση, μόνο στα καρκινικά δείγματα, η οποία μπορεί να οδηγήσει στη βιοσύνθεση μεγαλομοριακού υαλουρονικού, που απαιτείται για τη σωστή και οργανωμένη ανάπτυξη του καρκινικού όγκου. Τέλος, η HAS3 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, υποδηλώνοντας ότι η παρουσία της είναι απαραίτητη σε σχεδόν σταθερό βαθμό για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου και τούτο γιατί το προϊόν της είναι μικρότερου μοριακού μεγέθους σε σχέση με τις υπόλοιπες συνθάσες. Αυτό εξ άλλου υποστηρίζεται και από το γεγονός ότι η HAS3 εμφανίζει τη μεγαλύτερη έκφραση σε σχέση με τις άλλες συνθάσες σε δείγματα σταδίου Α, στάδιο που είναι κρίσιμο για την αγγειογένεση και την υποβοήθηση της διατροφής των καρκινικών κυττάρων. Συμπερασματικά, γίνεται φανερό ότι τα καρκινικά κύτταρα συνδυάζουν πολλούς μηχανισμούς για την ανάπτυξη, τη διήθηση και την επέκταση του καρκίνου και τα εξωκυττάρια μακρομόρια μπορεί να έχουν κομβικό ρόλο σ’ αυτούς. Οι μηχανισμοί αυτοί, όπως μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή, είναι: ελεγχόμενη αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεογλυκανών versican και decorin, εξειδικευμένες τροποποιήσεις στη βιοχημική δομή των γλυκοζαμινογλυκανών, ελεγχόμενη έκφραση των βιοσυνθετικών και καταβολικών ενζύμων του υαλουρονικού. Όλες αυτές οι μεταβολές συντονίζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εξυπηρετήσουν τις απαιτήσεις του καρκίνου είτε στο επίπεδο της αγγειογένεσης είτε στο επίπεδο της οργάνωσης του εξωκυττάριου χώρου. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να προσανατολιστούν ακόμα περισσότερο στη συσχέτιση χημικής δομής και λειτουργικότητας των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης/δερματάνης, ώστε να γίνουν πλήρως αντιληπτοί οι ρόλοι αυτών των μακρομορίων, όπως επίσης στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν την έκφραση των ενζύμων του μεταβολισμού του υαλουρονικού, με απώτερο στόχο την ειδικότερη και πληρέστερη φαρμακευτική αντιμετώπιση του καρκίνου. / Cancers of gastrointestinal tract are the most common type of cancers in developed world. Colorectal cancer has the highest incidence, however it is treated with rather good prognosis. On the other hand, pancreatic cancer has very bad prognosis and in most cases it cannot be treated. The last years extended research focused to the extracellular macromolecules of cancer, their role in cancer progression and their possible use as drug targets. The present Thesis aimed to study the extracellular proteoglycans structure in pancreatic cancer and the hyaluronan metabolism in colorectal cancer. The first was investigated by using a combination of biochemical and immunohistochemical techniques, and from their results it was found that two extracellular proteoglycans were present in pancreatic carcinoma, versican and decorin. Both proteoglycans were detected in the stroma and were absent from cancer cells, suggesting their biosynthesis from normal fibroblasts. In addition, their amounts were highly increased in pancreatic carcinoma, as compared with normal pancreas. Their increase in cancer was disproportional. Versican was increased 27 times and decorin 7 times, as compared with normal pancreas. Versican increase is related to its structural, hydration and space-filling properties, as well as to its function, since it is a multifunctional macromolecule. Versican enhances cell proliferation, and together with its anti-adhesive properties, allows mainly uncontrolled cellular growth locally. The lower increase of decorin, as compared with that of versican, could explain aggressiveness and malignancy of pancreatic cancer. Proteoglycans increase was followed by extensive alterations in their biochemical structure, namely, hydrodynamic size, sulphation pattern, and epimerization of glucuronate to iduronate. These should be attributed to multiple alterations of their biosynthetic pathways. The second was investigated by using a combination of enzymatic, immunoenzymatic and molecular techniques, and from their results it was found that multiple forms of Hyal1 and PH20 were present in all samples, as well as all hyaluronan synthases (HASs). Hyal2 and Hyal3 were present in some samples of advanced stage of cancer. Changes in expression with cancer stage were observed. Hyal1 expressed in low levels in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 10 times greater in the respective cancerous. This finding suggested that Hyal1 is produced from cancer cells. Hyal1 expresssion showed a stage-related decrease and since its activity results to hyaluronan fragments of angiogenetic size, it could be concluded that Hyal1 is required at early stage of cancer. PH20 expressed in a higher rate than Hyal1 in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 4 times greater in the respective cancerous, suggesting its participation in angiogenesis. In advanced stages, PH20 expression was slightly increased, suggesting its participation in extracellular matrix disorganization to permit cancer growth and progression, as well as metastasis. This was also observed in apparently macroscopically normal parts of samples of advanced stages. From the examination of the expression of the various HASs, a great and stage-related increase of HAS1 was found. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of very high molecular size and thus it could be suggested that cancer regulates hyaluronan biosynthesis in such a way to fulfill cancer requirements in matrix hydration. HAS2 expression was also increased in a stage-related order only in cancerous samples, but the increase was lower than that of HAS1. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of high molecular size which might be required for well-organized cancer growth. HAS3 expression was slightly decreased in a stage-related order, suggesting that its presence is stably required for the correct cancer growth and progression, since its biosynthetic product is of lower hydrodynamic size, as compared with that of HAS1 and 12 HAS2. Moreover, HAS3 expression was higher than that of both other HASs in samples of stage A, a stage very critical for angiogenesis. From the results obtained, it could be concluded that cancer cells combine a variety of multiple mechanisms for cancer growth, progression and invasion, and that extracellular macromolecules might play a very critical role. The mechanisms, as studied in the present Thesis, are: selective and highly regulated increase of the proteoglycans versican and decorin, selective modifications of glycosaminoglycans biochemical structure, selective and highly regulated expression of biosynthetic and catabolic enzymes related to hyaluronan. All these changes coordinate to fulfill cancer requirements for either angiogenesis or extracellular matrix organization, depending on its stage. Future studies will be oriented to chondroitin/dermatan sulphate structure/function relationship for better understanding of the role of these macromolecules in cancer, and of the regulatory mechanisms implicated in the expression of the enzymes involved in hyaluronan metabolism, aiming at the cancer treatment.

Η εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια της νεφρικής λειτουργίας και εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης που οδηγεί σε γενικευμένη ίνωση του νεφρικού ιστού. Στους μηχανισμούς που ενοχοποιούνται για την εξέλιξη της βλάβης αυτής προς ίνωση συμμετέχουν κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες που προέρχονται από ενδοθηλιακά, επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα και κύτταρα του διάμεσου νεφρικού ιστού. Η ίνωση του διάμεσου νεφρικού χώρου είναι μία κοινή διαδικασία που χαρακτηρίζεται από την de novo ενεργοποίηση μυοϊνοβλαστών με αποτέλεσμα την αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης. Τα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα είναι πηγή προέλευσης των ενεργοποιημένων μυοϊνοβλαστών μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάπτωση. Διάφοροι μεσολαβητές της νεφρικής βλάβης όπως είναι και η κυκλοσπορίνη ερχόμενοι σε επαφή με κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου οδηγούν σε ενεργοποίηση προϊνωτικών παραγόντων εκκρίνοντας εξωκυττάρια ύλη. Μεταξύ αυτών των μεσολαβητών της νεφρικής βλάβης, ιδιαίτερο ρόλο φαίνεται ότι διαδραματίζουν το νιτρικό οξείδιο και η ενδοθηλίνη, δύο παράγοντες που μετέχουν σε φυσιολογικές, αλλά και παθοφυσιολογικές κυτταρικές διαδικασίες. Τα συστήματα νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σε επίπεδο υποδοχέων στο κυτταρικό επίπεδο προκαλώντας αλλαγές του αγγειακού τόνου και ενεργοποίηση ή αναστολή προϊνωτικών σημάτων. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των συστημάτων νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης σε σωληναριακά νεφρικά κύτταρα κάτω από την επίδραση της κυκλοσπορίνης. Χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες κυτταροκαλλιέργειες νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου (ΗΚ-2) τα οποία επωάσθηκαν σε θεραπευτικές και τοξικές συγκεντρώσεις κυκλοσπορίνης (CsA) και ακολούθησε η ανίχνευση του νιτρικού οξειδίου (NO), της ενδοθηλιακής και επαγώγιμης συνθετάσης του ΝΟ (e-NOS, i-NOS) και της ενδοθηλίνης-1 (ET-1) με τους Α και Β υποδοχείς της (ΕΤ-Α, ΕΤ-Β). Το ΝΟ μετρήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Griess, ενώ η συσσώρευση της ενδοθηλίνης και των Α και Β υποδοχέων της καθώς και οι συνθετάσες του ΝΟ ανιχνεύθηκαν τόσο σε επίπεδο μεταγράφου (m-RNA) χρησιμοποιώντας RT-PCR, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης με Western Blot ανάλυση. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα στο επωαστικό μέσο εκτός από κυκλοσπορίνη και ειδικούς αναστολείς του ΝΟ (L-NAME) και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης (BQ123, BQ 788), ενώ ακολούθησε η ανίχνευση των συνθετασών του ΝΟ και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης αντίστοιχα. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν προκύπτει ότι η κυκλοσπορίνη ασκεί τοξική δράση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και επάγει τη συσσώρευση της ΕΤ-1,του ΝΟ, των συνθετασών του ΝΟ και των Α και Β υποδοχέων της ΕΤ-1. Η επαγωγή του ΕΤ-Α υποδοχέα είναι ανεξάρτητη από την παρουσία ή μη ΝΟ, σε αντίθεση με τον ΕΤ-Β υποδοχέα η επαγωγή του οποίου καταστέλλεται πλήρως όταν αναστέλλεται το σύστημα του νιτρικού οξειδίου (L-NAME). Η επαγωγή της e-NOS από την κυκλοσπορίνη είναι απόλυτα εξαρτώμενη από το σύστημα της ΕΤ-1, σε αντίθεση με την i-NOS η οποία επάγεται σε σημαντικό βαθμό ακόμη και όταν το σύστημα ενδοθηλίνης αδρανοποιείται πλήρως με ειδικούς αναστολείς (BQ123 και BQ788). / The progression of renal fibrosis is characterized by loss of kidney function and deposition of extracellular matrix components. The mechanism implicated in the development of renal fibrosis involves cytokines and growth factors originating from endothelial, tubular epithelial and interstitial cells. Activated myofibloblasts derive from differentiated tubular epithelial cells trough a process called epithelial to mesenchymal transition. Various kidney injury mediators like cyclosporine-A (CsA) are entering the luminal space of the tubules causing activation of profibrotic factors such as nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1). A cross talk exists between endothelin and NO systems in the regulation of vascular tone and inflammatory process. Aim of this study was to investigate the effect of cyclosporine-A on the expression of Nitric Oxide and endothelin-1 on cultured renal tubular cells. Human tubular epithelial cells (HK-2) were cultured in the presence of CsA at various concentrations (0 -1,000 ng/ml). RT-PCR was used to determine NO synthases (eNOS, iNOS) and endothelin receptors (ETR-A, ETR-B) and Western Blot analysis for the subsequent proteins. Similar experiments were also carried out using specific NO (L-NAME) and endothelin receptor (BQ123, BQ 788) inhibitors. At therapeutic concentrations, CsA exerts a significant cytotoxic effect on tubular epithelial cells. A dose dependent activation of NO synthases eNOS and iNOS and endothelin receptors ET-A and ETR-B was observed, even at therapeutic concentrations of CsA. An interaction between NO and ET-1 systems under the influence of CsA was also observed, since blockage of NO production was followed by down-regulation of ET-B while blocking of endothelin pathway with ET receptor antagonists, was followed by down-regulation of eNOS expression.

Η νεοπλασία των όρχεων, αν και σχετικά αποτελεί μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1- 2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα), είναι ο πιο συχνός όγκος στις ηλικίες 20-40 ετών, αποτελώντας την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Η αλληλεπίδραση των κυττάρων με άλλα κύτταρα ή με συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, καθώς και η μετακίνηση στο ενδοθήλιο των αρτηριών και στο εξωφλεβικό ιστό, είναι εξαρτημένη από την ενεργότητα των μορίων προσκόλλησης όπως οι ιντεγκρίνες, οι σελεκτίνες και μέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, καντχερίνες και ο CD44. Ο CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Η ισομορφή που δεν περιέχει ενδιάμεσα εξώνια ονομάζεται CD44s, ενώ όλες οι υπόλοιπες ισομορφές προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δέκα διαφορετικών εξωνίων, παράγοντας πληθώρα διαφορετικών μορίων του CD44. Πληθώρα μελετών υποστηρίζει ότι ο μεμβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισομορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει με το ΗΑ, ενώ κάποιες ισομορφές όπως η CD44v5, CD44v6, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιθετικότητα μερικών τύπων καρκίνου. Η έκφραση του CD44 έχει μελετηθεί μερικώς στους όγκους όρχεων και έχουν δημοσιευθεί αντικρουόμενα ευρήματα, ενώ δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για την έκφραση των ενζύμων που συνθέτουν το ΗΑ. Στόχος της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν να διερευνηθεί η έκφραση των ισομορφών του CD44 και των συνθασών του ΗΑ σε τρεις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων (Σεμίνωμα, Εμβρυϊκό καρκίνωμα, Τερατοκαρκίνωμα). Η μελέτη του υποδοχέα CD44 πραγματοποιήθηκε με RT-PCR και ανοσοαποτύπωση. Σε επίπεδο mRNA βρέθηκε πως η κύρια ισομορφή του CD44 που εκφράζεται στο σεμίνωμα καθώς και σε μη- σεμινωματώδεις όγκους είναι η ισομορφή CD44s. Ακόμη στην κυτταρική σειρά σεμινώματος όρχεων εκφράζονται και άλλες ισομορφές, κυρίως όμως εκφράζονται οι ισομορφές CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και CD44v10. Στις κυτταρικές σειρές μη σεμινωματωδών όγκων (εμβρυϊκό καρκίνωμα και τερατοκαρκίνωμα) εκτός της CD44s ισομορφής που είναι η κυρίαρχη ισομορφή εκφράζονται και κάποιες άλλες ισομορφές του CD44. Στο εμβρυϊκό καρκίνωμα εκφράζονται οι ισομορφές CD44v5,v8, CD44v9-v10 και CD44v10, ενώ στο τερατοκαρκίνωμα παρατηρείται η έκφραση κυρίως της CD44v5,v8, ενώ εκφράζονται και οι CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και η CD44v10. Η μελέτη του CD44 σε επίπεδο πρωτεΐνης με το αντίσωμα Hermes-3 κατέδειξε πως η κύρια ισομορφή που εκφράζεται στην κυτταρική σειρά σεμινώματος είναι η CD44s με μοριακό βάρος~90kDa. Ακόμα φάνηκε πως υπάρχει έκφραση και κάποιων ισομορφών και θραυσμάτων του CD44 με μικρότερο μοριακό μέγεθος. Αντίθετα στις κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκίνωματος και τερατοκαρκινώματος παρατηρήθηκε η έκφραση μόνο της CD44s ισομορφής. Αντίθετα με την υψηλή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά σεμινώματος, παρατηρήθηκε μικρή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά εμβρυϊκού καρκινώματος και μια ελάχιστη έκφραση στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος. Η μελέτη του υποδοχέα CD44 σε επίπεδο ιστού έδειξε ότι η πρωτεΐνη του CD44 εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου. Η σηματοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήμα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυμα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισομορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α, και HAS-3β. Στα πλαίσια της μεταπτυχιακής διατριβής βρέθηκε πως η κυτταρική σειρά σεμινώματος εκφράζει μόνο την ισομορφή HAS-3α, ενώ οι κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκινώματος και τερατοκαρκινώματος εμφανίζουν ισχυρή έκφραση της ισομορφής HAS-3α και μικρή έκφραση της HAS-2. / Testicular tumors are present in men aged 15-35 years with increasing incidence in the last 40 years. Approximately 95% of these tumors arise from germ cells. The interaction of cells with other cells or with components of the extracellular matrix (ECM), as well as their locomotion on blood vessel endothelium and extravascular tissue, are substantially dependent on the activity of adhesion molecules such as integrins, selectins, members of the immunoglobulin superfamily, addressins, cadherins, and CD44. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The isoform with no variant exons is named CD44s, whereas the other isoforms arise from alternative splicing of the 10 variant exons of the CD44 mRNA, producing a huge variety of diverse CD44 molecules. A lot of studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger fuctions in tumour cells, which conduce to the disease progression. The major isoform is the CD44s which is expressed widely in tissues, whereas is overexpressed in several types of tumours ,coexisting with HA. The expression of CD44 has been partly studied in testicular tumours but controversial findings have been published, whereas no data about the enzymes which synthesize HA are available. The aim of this thesis was to examine the expression of CD44 isoforms and HA synthases in three cell lines (seminoma, embryonic carcinoma, teratocarcinoma). The study of CD44 was conducted by RT-PCR analysis and western blotting. It was found that in mRNA level, the major isoform that is expressed in seminoma and nonseminomas is the CD44s isoform. Moreover, in seminoma cell line, other isoforms are also expressed, namely CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. In nonseminomas cell lines CD44s is expressed as the major isoform , but also other isoforms are expressed. CD44v5,v8, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms are expressed in embryonic carcinoma , whereas in teratocarcinoma the expression mainly of the CD44v5,v8 isoform is observed, together with CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. The study of CD44 in protein level conducted by western blotting using the monoclonal antibody Hermes-3. It was shown that the major isoform expressed in seminoma cell line is CD44s with a molecular mass approximately 90kDa. Moreover it was shown that other CD44 isoforms and CD44 fragments with smaller molecular mass are expressed. On the other hand, in embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines, the expression only of CD44s isoform was observed. The study of CD44 in tissue level revealed that CD44protein is expressed in tumour cells. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and represent three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. The findings of this study revealed that seminoma cell line express only HAS-3a isoform, whereas embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines showed high expression of HAS-3a isoform and low expression of HAS-2 isoform.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-21T14:43:48Z No. of bitstreams: 1 viniciuscariusdesouza.pdf: 3785363 bytes, checksum: 7063d6c5f5cef353643903ad5f125c48 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:09:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 viniciuscariusdesouza.pdf: 3785363 bytes, checksum: 7063d6c5f5cef353643903ad5f125c48 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:09:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 viniciuscariusdesouza.pdf: 3785363 bytes, checksum: 7063d6c5f5cef353643903ad5f125c48 (MD5) Previous issue date: 2016-03-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Lippia alba, popularmente conhecida por erva-cidreira, é uma espécie vegetal amplamente distribuída pelas Américas e encontrada praticamente em todo o território brasileiro. Esta espécie possui importante uso na medicina tradicional para o tratamento de cólicas, indigestão, náuseas, espasmos, diarreia, disenteria, doenças respiratórias, problemas hepáticos e no tratamento de sífilis e gonorreia. As folhas de L. alba, as quais são preparadas sob a forma de infusão ou decocção e ingeridas por via oral, produzem um óleo essencial rico em moléculas iso-prenóides denominadas terpenóides. Estes compostos não são apenas de interesse farmacológico, mas também industrial já que são usados na confecção de fragrâncias. A composição dos óleos essenciais pode variar em função de diferentes fatores abióticos e genotípicos, como por exemplo nível de ploidia. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram caracterizar o transcriptoma de folha da espécie L. alba e buscar sequencias putativas de enzimas envolvidas na produção de metabólitos secundários. O transcriptoma foi sequenciado pela plataforma Miseq (Illumina) com bibliotecas pairedend de 300 bp. O sequenciamento resultou em um total de 47.498.310 reads paired-end (23.749.155 reads para cada end sequenciado) de 35-308 bp, compreendendo 12.148.327.567 nucleotídeos (-12 Gb). A montagem de novo dos transcritos foi processada a partir do software Trinity que gerou 193.532 transcritos, sendo 128.209 unigenes, com o valor de N50 igual a 1.187 bp. Um total de 86.122 ORF (Open Read Frame) foi obtido e a seguir submetido ao algoritmo de alinhamentos BlastP, o qual encontrou 75.533 sequências com referência no banco de dados NR (Non-Redundant) de proteínas. Aproxima-damente, 78,4% dessas sequências foram anotadas funcionalmente a partir do pipeline utiliza-do pelo software Blast2GO. As análises das sequências anotadas revelaram prováveis enzimas para síntese de terpenóides como geraniol e linalol/nerolidol. Para validação da montagem e anotação, foram realizados ensaios de qPCR para amplificação de sequências de 13 genes para controles endógenos e 4 genes de terpeno sintases. Os resultados obtidos aqui corroboram outros estudos de transcriptoma de espécies não modelo usando tecnologias de sequenciamento de alto-desempenho. / Lippia alba, popularly known as erva-cidreira, is a widely distributed specie in Americas and it is found throughout Brazil. This specie has important using in popular medicine for cramp-ing, indigestion, nausea, diarrhea, dysentery, respiratory diseases, liver disorders treatment and infectious diseases such as syphilis and gonorrhea. The leaves of L. alba, which are pre-pared by infusion or decoction and orally ingested, producing an essential oil rich in terpene compounds. These compounds are of pharmacological and industrial interest, due to their use in fragrance preparation. Interestingly, the composition of essential oils change according to different abiotic factors and genetic variations such as ploidy level. In this context, the aims of this work were to characterize the transcriptome of leaves of L. alba (linalool chemotype) and to search putative enzymes sequences involved in production of secondary metabolites. The transcriptome was sequenced by Miseq platform (Illumina) running pair-end libraries 300 bp. The sequencing resulted in 47,498,310 reads (23,749,155 reads for each end sequenced) of 35-308 bp, comprising 12,148,327,567 nucleotides (-12 Gb). The de novo assembly of tran-scripts was processed by Trinity software and generated 193,532 transcripts, in 128,209 uni-genes, with N50 equal to 1,187 bp. 86,122 ORFs (Open Read Frame) were obtained and sub-mitted to BlastP algorithm, finding 75,533 sequences included in NR (Non-Redundant) pro-tein database. Approximately 78.4% of these sequences were functionally annotated using Blast2Go pipeline. Analysis of annotated sequences revealed putative enzymes for synthesis of terpenoids such as geraniol and linalool/nerolidol. For assembly and annotation validation, qPCR assay were realized by amplification of 13 endogenous control genes and 4 terpene synthases genes. The results found here corroborate transcriptome studies in non-model or-ganisms using high-performance sequencing technologies.

Protein nitration is considered as a marker of reactive nitrogen species formation. Heme oxygenases (HOs) are important for the defence against oxidative stress. We evaluated the involvement of the neuronal (nNOS), the endothelial (eNOS), and the inducible (iNOS) in nitrotyrosine formation and localitzation, and both the expression and funcional significance (HO inhibition and contractility studies) of HOs in sepsis-induced muscle contractile dysfunction. Sepsis was elicited by injecting rats and transgenic mice deficient in either nNOS, eNOS, or iNOS isoforms with E.Coli lipolysaccharide (LPS). Nitrotyrosine formation and HO expressions were assessed by immunoblotting. Oxidative stress was assessed measuring protein oxidation, lipid peroxidation, and muscle glutathione. We conclude that protein tyrosine nitration occurs in normal muscles, and sepsis-mediated increase in nitrotyrosine formation is limited to the mitochondria and membrane muscle fractions. The iNOS isoform is mostly involved in nitrotyrosine formation. HOs protect normal and septic muscles from the deleterious effects of oxidants. / En un model de sepsi de disfunció diafragmàtica, s´ha avaluat el paper de les sintetases de l'òxid nítric (NOS) en la formació i localitzacio de 3-nitrotirosina, i l´expressió i significat biològic de les hemo oxigenases (HOs) (inhibidor de les HOs i estudis de contractilitat) davant l' estrès oxidatiu. La sepsi s'induí mitjançant injecció de 20 mg/kg del lipolisacàrid (LPS) d´Escherichia Coli a rates, i a ratolins deficients en les NOS induïble (iNOS), neuronal (nNOS) i endotelial (eNOS). Les proteïnes nitrificades i les HOs es van detectar amb anticossos específics. L' estrès oxidatiu s' avaluà mitjançant l' oxidació proteica, la peroxidació lipídica i el glutation muscular. Concloem que hi han proteïnes nitrificades en el múscul normal i aquestes s'incrementen durant la sepsi en les fraccions mitocondrial i membranar. L'isoforma iNOS és majorment responsable de la formació de nitrotirosina. Les HOs protegirien el múscul normal i sèptic dels efectes deleteris dels oxidants.