Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1. / La protéine accessoire U (Vpu) du VIH‐1 cible efficacement BST2/Tetherin, facteur de restriction restreignant la relâche de divers virus enveloppés à même la surface cellulaire. Le récepteur naturel de BST2 récemment découvert est ILT7, une protéine exclusivement exprimée à la surface des cellules produisant l'essentiel de l'interféron de type 1 (IFN-­1) lors d'infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs). L'interaction entre BST2 et ILT7 réprime la production d'IFN‐1 des pDCs. Considérant le potentiel immunorégulateur de BST2 récemment décrit, nous avons entrepris d'évaluer cet aspect de l'antagonisme de Vpu sur BST2. À l'aide d'un système de co­‐culture entre une lignée de cellules T CD4+ infectée avec un virus exprimant ou n'exprimant pas Vpu et les cellules mononucléées du sang périphérique ou de pDCs purifiés, nous avons observé que Vpu est responsable d'une atténuation majeure de la sécrétion d'interféron de type 1 (IFN-­1) produite en réponse aux cellules infectées. La présence de molécules de BST2 de surface libres est essentielle à ce processus, puisque le bloc de toute interaction en trans de BST2 par des anticorps polyclonaux α­‐BST2 abroge l'effet de Vpu. Similairement, Vpu ne peut exercer cet effet lorsque ILT7 est déplété dans les pDCs à l'aide de petits ARN interférents. Enfin, l'introduction de protéines recombinantes solubles d'ILT7 dans le système de co-culture semble prévenir l'effet inhibiteur de Vpu, suggérant que Vpu exploite l'interaction de BST2 avec ILT7 pour moduler la sécrétion d'IFN-­1 des pDCs. En conclusion, nos résultats démontrent que Vpu exerce un contrôle sophistiqué de la production d'IFN‐1 par les pDCs en réponse aux lymphocytes T CD4+ infectés par le VIH-­1. Il semble ainsi que l'action de Vpu favorise, par un mécanisme encore méconnu, l'activation d'ILT7 à travers BST2. En effet, cette fonction de Vpu semble tout aussi dépendante de BST2 que de l'ILT7. En favorisant la relâche virale et en menant à l'inhibition de la réponse antivirale des pDCs, la régulation ciblée de BST2 par Vpu est non seulement cruciale à la dissémination du virus, mais aussi à sa réplication.

Résumé confidentiel / Confidential abstract

La leptospirose, due aux bactéries Leptospira interrogans ou leptospires, est une zoonose ré-émergente de répartition mondiale et susceptible de se répandre en France en raison du réchauffement climatique. Les rongeurs, en particulier les rats, sont le réservoir asymptomatique des leptospires. Chez l’Homme, l’infection conduit soit à un syndrome pseudo-grippal bénin, soit à la maladie de Weil, qui se traduit par des déficiences hépatiques, rénales et pulmonaires sévères pouvant entraîner la mort. Le laboratoire a montré que les leptospires échappent à la détection par certains récepteurs de l’immunité innée de la famille des Toll-like (TLR). En effet, le lipopolysaccharide (LPS) des leptospires – composant majeur de la membrane externe – est atypique et n’est pas reconnu par le TLR4 humain, contrairement au LPS de la plupart des bactéries à Gram négatif. Cependant chez la souris, le LPS des leptospires est reconnu par le TLR4 et permet une élimination de la bactérie. Au cours de cette thèse, nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme d’échappement des leptospires à la reconnaissance par les récepteurs de l’immunité innée Nod1 et Nod2, reconnaissant les fragments de dégradation du peptidoglycane bactérien, appelés muropeptides. Nous avons montré que la liaison au PG d’une lipoprotéine, la LipL21, spécifique de la membrane externe des leptospires, bloque la digestion en muropeptides et permet ainsi l’échappement des leptospires à la reconnaissance par les récepteurs Nods. Ceci constitue une nouvelle stratégie bactérienne d’échappement au système immunitaire inné. En effet, jusqu’alors seules des modifications des sucres ou de la chaîne peptidique du peptidoglycane entraînant le blocage de la reconnaissance par les récepteurs Nods avaient été mis en évidence. Par ailleurs, nous avons développé – grâce à la construction d’une souche de leptospires pathogènes bioluminescents – un nouveau modèle d’étude de la leptospirose aiguë et chronique chez la souris, qui à l’instar des rats et contrairement à ce que l’on pensait, est un porteur asymptomatique et chronique des leptospires dans les reins. Ce modèle biphasique de la leptospirose nous a permis de mettre en évidence que les leptospires sont protégés de l’action des antibiotiques lorsqu’ils sont dans les reins, alors qu’ils y sont sensibles lors de la phase aiguë. Ces résultats suggèrent deux mécanismes différents participant à l’échappement des leptospires au système immunitaire de l’hôte : d’une part, la lipoprotéine LipL21 joue un rôle dans le blocage de la reconnaissance du peptidoglycane par les récepteurs Nods et d’autre part, les leptospires échappent aux défenses de l'hôte par la colonisation rénale chez la souris. / Leptospirosis is a widespread zoonosis caused by the bacterium Leptospira interrogans (L interrogans). In humans, infection with L. interrogans can cause either a mild disease or in more severe cases, multi-organ failure potentially leading to death. Leptospires escape from the innate immune response by evading detection by Toll-like receptors (TLR). Indeed, the lipopolysaccharide (LPS) outer membrane component of Leptospira is atypical as, unlike most Gram-negative bacteria, it is not recognized by human TLR4. However, leptospiral LPS is recognized by murine TLR4, facilitating clearance of leptospires in mice. During my doctoral thesis, we revealed a new mechanism of leptospiral escape from recognition by Nod1 and Nod2 innate immune receptors. We have shown that a specific leptospiral outer membrane lipoprotein, LipL21, impairs muropeptides digestion and therefore avoids activation of Nod1 and Nod2 receptor-mediated pathways. This constitutes a new strategy of bacterial escape from Nod1 and Nod2 receptor recognition. Indeed, until now, only modification of the peptidoglycan sugar or peptide side-chain chemistry was shown to participate in evasion of Nod receptor recognition. Furthermore, through the construction of a bioluminescent pathogenic Leptospira strain, we were able to develop a new murine model to study acute and chronic leptospirosis. We found that, after the acute phase of leptospirosis, infected mice become asymptomatic, but exhibit chronic carriage of Leptospira in the kidneys, as in rat models of leptospirosis. This biphasic leptospirosis model allows us to highlight leptospiral renal colonization as a stealth escape strategy from the blood defenses and antibiotics. Our results reveal two new mechanisms that contribute to leptospiral escape from the host immune system: on one hand, LipL21 lipoprotein plays a role by facilitating evasion of peptidoglycan recognition through Nod1 and Nod2 receptors, and on the other hand, leptospires escape from host defenses by colonising a renal niche in mice. Together, these findings provide novel insight into the ability of Leptospira to cause serious and chronic morbidity in humans.

Le thymus est un organe permettant le développement des lymphocytes T, partie intégrante du système immunitaire. Ces cellules sont communément associées au système immunitaire adaptatif, bien que certaines populations, dont les lymphocytes iNKT et Tγδ, soient associées au système immunitaire inné. De manière générale, ces lymphocytes " innés " sont capables de répondre très rapidement à différents signaux d'activation, par la production rapide et massive d'IL-4, d'IFN-γ et d'IL-17. Notre laboratoire a mis en évidence l'existence de deux sous-populations de lymphocytes iNKT, iNKT conventionnels et iNKT17, ayant deux voies de différenciation thymique bien distinctes, mais dont les mécanismes de détermination sont encore inconnus. Il a été montré que " SLAM-associated protein " (SAP) est indispensable au développement des lymphocytes iNKT, puisqu'ils sont absents chez les souris déficientes en SAP. D'autre part, ces mêmes souris montrent également une déficience de la réponse Th2. Nous avons alors émis l'hypothèse que SAP pourrait être impliqué dans la production d'IL-4 par les lymphocytes iNKT, et dans la détermination des deux sous-populations de lymphocytes iNKT conventionnel ou producteur d'IL-17. Dans une première partie, nous avons utilisé des souris triple mutantes Sap-/- Vα14Tg-ROR(γt)-Egfp, permettant l'étude des sous-populations de lymphocytes iNKT malgré la déficience en SAP. Nous avons ainsi montré que SAP est indispensable à l'acquisition thymique de la capacité de production d'IL-4 par les lymphocytes iNKT conventionnels. Chez ces souris déficientes en SAP, nous avons observé une augmentation de la fréquence des lymphocytes iNKT17 RORγtpos producteurs d'IL-17, ce qui montre clairement que SAP n'est pas nécessaire pour l'acquisition des propriétés fonctionnelles des lymphocytes iNKT17. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction de SAP dans le développement thymique des cellules iNKT productrices d'IL-4. De plus, nos résultats montrent que SAP est un point de contrôle obligatoire déterminant l'orientation de la différenciation thymique des cellules iNKT vers les cellules iNKT17 ou vers les cellules iNKT conventionnelles. En parallèle des lymphocytes iNKT17 présents dans le thymus, nous avons également analysé une autre population T particulière : des thymocytes TCRαβposCD4pos matures et producteurs d'IL-17, les lymphocytes Th17 naturels. Nous avons mis en évidence que ces lymphocytes expriment le facteur de transcription RORγt. Ces lymphocytes T CD4posCD8negCD44hiRORγtpos sont capables de produire rapidement et massivement de l'IL-17, mais requièrent l'IL-23 pour co-produire l'IL-22. De plus, ils se distinguent des lymphocytes Th17 induits, ou conventionnels, par l'expression du facteur de transcription PLZF et par leur capacité à répondre très rapidement à des stimuli pro-inflammatoires, nommément l'IL-23 associé à l'IL-1β et un agoniste TLR4. Les résultats obtenus durant cette thèse ouvrent donc de nombreuses perspectives de recherches fondamentale et thérapeutique, domaine dans lequel l'IL-17 est devenu une cible privilégiée pour le traitement des maladies auto-immunes.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (PDC) représentent une nouvelle entité distincte de cellules dendritiques. Elles peuvent sécréter de grandes quantités d'interféron de type I après stimulation par un virus ou des produits bactériens tels que les CpG ODN grâce à leur expression sélective des Toll-like récepteurs (TLR)7 et 9.<br />Notre laboratoire a récemment développé une lignée de PDC (GEN2.2) à partir de leucémies à PDC (LPDC), qui résistent aux thérapies conventionnelles. Les GEN2.2 partagent la plupart des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des PDC normales. Nous avons d'abord utilisé cette lignée comme modèle de LPDC et nous montrons qu'elles sont sensibles à l'apoptose induite par TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) via l'expression du récepteur DR5, comme la plupart des LPDC, alors que les PDC normales ne le sont pas, ce qui permettrait la mise en place de thérapies des leucémies à PDC utilisant des agonistes de TRAIL.<br />Les PDC normales sont difficiles à isoler ou générer. Nous avons donc ensuite utilisé la lignée GEN2.2 comme modèle de PDC normales. Nous avons ainsi découvert que ces cellules, une fois activées par des ligands des TLR7 et 9, acquièrent une fonction cytotoxique via l'expression de TRAIL et peuvent tuer des cellules tumorales. Les PDC pourraient donc jouer un rôle crucial dans l'éradication des cancers après activation.<br />Enfin, nous avons cherché à préciser les mécanismes moléculaires d'induction de TRAIL dans les PDC après activation par des ligands des TLR7 et 9.<br />L'ensemble des travaux suggère que les PDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques anti-tumorales.

Influenza virus infects the human population worldwide and causes acute respiratory disease. Currently, the primary strategy for preventing influenza is seasonal vaccination which is capable of providing protection in most populations. However, seasonal vaccines are less efficacious to immunize the elderly and poorly induce cross-protective immunity against the reassorted pandemic virus in the recipients. Neuraminidase (NA) inhibitors have also been widely utilized to limit disease outcome. The currently used NA inhibitors, nonetheless, generate the drug-resistant progeny viruses; moreover, they are unable to directly target the host immune responses which cause immunopathology in severe cases. Therefore, new strategies that provide more effective immunogenicity, cross-protection and therapies against influenza infection must be developed. In this thesis, the adjuvanticity of CpG oligodeoxynucleotide (ODN), type I interferon (IFN) and Complete Freund’s adjuvant (CFA) when coadministered with seasonal influenza vaccines in ferrets is presented. It has been found that the adjuvanted vaccines are efficacious to induce neutralizing antibody responses. Several common and distinguished signaling pathways leading to dendritic cell (DC) maturation and B cell activation have been discovered from their adjuvanticity. Furthermore, it was determined that seasonal H1N1 prior infection more effectively induces cross-protection against the newly emerged 2009 pandemic H1N1 (H1N1pdm) virus in ferrets and mice than the seasonal vaccines. The prior infection-induced cross-reactive but non-neutralizing antibodies are capable of providing substantial protection in the H1N1pdm infected mice when CD8 T cells are absent. Lastly, function of different vaccine adjuvants for controlling H1N1pdm infection in mice has been investigated. Unlike other adjuvants, CFA is capable of protecting the mice from infection through enhancement of Treg cell suppressive molecules galectin-1 and CTLA-4 which downregulated DC costimulation and effector T cell responses. Overall, this thesis has provided novel mechanistic insights for developing protective strategies against influenza infection.

Influenza virus infects the human population worldwide and causes acute respiratory disease. Currently, the primary strategy for preventing influenza is seasonal vaccination which is capable of providing protection in most populations. However, seasonal vaccines are less efficacious to immunize the elderly and poorly induce cross-protective immunity against the reassorted pandemic virus in the recipients. Neuraminidase (NA) inhibitors have also been widely utilized to limit disease outcome. The currently used NA inhibitors, nonetheless, generate the drug-resistant progeny viruses; moreover, they are unable to directly target the host immune responses which cause immunopathology in severe cases. Therefore, new strategies that provide more effective immunogenicity, cross-protection and therapies against influenza infection must be developed. In this thesis, the adjuvanticity of CpG oligodeoxynucleotide (ODN), type I interferon (IFN) and Complete Freund’s adjuvant (CFA) when coadministered with seasonal influenza vaccines in ferrets is presented. It has been found that the adjuvanted vaccines are efficacious to induce neutralizing antibody responses. Several common and distinguished signaling pathways leading to dendritic cell (DC) maturation and B cell activation have been discovered from their adjuvanticity. Furthermore, it was determined that seasonal H1N1 prior infection more effectively induces cross-protection against the newly emerged 2009 pandemic H1N1 (H1N1pdm) virus in ferrets and mice than the seasonal vaccines. The prior infection-induced cross-reactive but non-neutralizing antibodies are capable of providing substantial protection in the H1N1pdm infected mice when CD8 T cells are absent. Lastly, function of different vaccine adjuvants for controlling H1N1pdm infection in mice has been investigated. Unlike other adjuvants, CFA is capable of protecting the mice from infection through enhancement of Treg cell suppressive molecules galectin-1 and CTLA-4 which downregulated DC costimulation and effector T cell responses. Overall, this thesis has provided novel mechanistic insights for developing protective strategies against influenza infection.

The prevention and treatment of cancer and infectious diseases requires vaccines that can mediate cytotoxic T lymphocyte-based immunity. A promising strategy is protein subunit vaccines composed of purified protein antigens and immunostimulatory adjuvants, such as Toll-like receptor (TLR) agonists. In this research, we developed two new biodegradable polymeric delivery vehicles for protein antigens and TLR agonists, as model vaccine delivery systems. This work was guided by the central hypothesis that an effective vaccine delivery system would have stimulus-responsive degradation and release, biodegradability into excretable non-acidic degradation products, and the ability to incorporate various TLR-inducing adjuvants. The first vaccine delivery system is a cross-linked polyion complex micelle which efficiently encapsulates proteins, DNA, and RNA. The micelle-based delivery system consists of a block copolymer of poly(ethylene glycol) (PEG) and poly(L-lysine), cross-linked by dithiopyridyl side groups to provide transport stability and intracellular release. The second delivery system consists of solid biodegradable microparticles encapsulating proteins, nucleic acids, and hydrophobic compounds. The microparticles are composed of pH-sensitive polyketals, which are a new family of hydrophobic, linear polymers containing backbone ketal linkages. Polyketals are synthesized via a new polymerization method based on the acetal exchange reaction and degrade into non-acidic, excretable degradation products. In addition, the technique of hydrophobic ion pairing was utilized to enhance the encapsulation of ovalbumin, DNA, and RNA in polyketal microparticles via a single emulsion method. Using in vitro and in vivo immunological models, we demonstrated that the micelle- and polyketal-based vaccine delivery systems enhanced the cross-priming of cytotoxic T lymphocytes. The model vaccines were composed of ovalbumin antigen and various TLR-inducing adjuvants including CpG-DNA, monophosphoryl lipid A, and dsRNA. The results demonstrate that the cross-linked micelles and polyketal microparticles have considerable potential as delivery systems for protein-based vaccines.

Microscopic colitis (MC), comprising collagenous colitis (CC) and lymphocytic colitis (LC) is a common cause of chronic watery diarrhea. The diagnosis relies on typical histopathological changes observed upon microscopic examination. The studies in this thesis investigated innate and adaptive immune responses in the colonic mucosa of MC patients, also comparing patients with active disease (CC and LC) and histopathologically in remission (CC/LC-HR). We first analyzed expression of interleukin-1/Toll-like receptor (IL-1/TLR) signaling regulators in MC patients (Paper I). Our results showed enhanced IRAK-M, microRNA-146a, -155 and -21 expressions, whereas IL-37 gene expression was reduced in CC and LC patients as compared to non-inflamed controls. These results suggest different pathophysiological mechanisms in MC patients. The mixed inflammatory cell infiltrations seen in the lamina propria of MC patients might be a result of dysregulated expression of chemotactic mediators. In Paper II, we showed that MC patients display mainly an increased expression of chemokines and chemokine receptors in active disease as compared to noninflamed controls. In Paper III, we examined if the decreased IL-37 expression seen in Paper I could mediate the upregulation of chemokines seen in Paper II. We showed that a relatively small reduction in the ability of epithelial cells to produce IL-37 results in mainly increased chemokine expressions in a pattern similar to the findings in Paper II. In order to understand the nature of infiltrating T cells commonly observed in MC patients, we analyzed the T cell receptor (TCR) β chains in colonic biopsies of MC patients (Paper IV). Our results showed significant differences in TCRβ repertoire, which suggests selectively expanded T cell clones in active MC and histopathologically in remission patients. Altogether, these results i) increase the knowledge of MC pathogenesis by showing changes in TLR signaling regulators, enhanced chemokine and their receptor expressions involved in a mixed immune cell infiltrations and selectively expanded T cell clones in CC and LC patients, as well as in histopathological remission ii) might potentially increase the possibility of more target-specific therapies based on IL-37 induction, chemokines or chemokine receptor inhibitions, or hindering T cell infiltration according to TCR clonality.

Les plaquettes sanguines sont des cellules anucléées qui jouent un rôle majeur dans l’hémostase. Au-delà de cette fonction, elles possèdent une composante inflammatoire multifacette ; recouvrant la détection du signal de danger, la libération de cytokines et la migration leucocytaire. Dans ce contexte, la première partie de ces travaux met en avant la capacité des plaquettes à mettre en place une activation de type inflammatoire en réponse à un pathogène. En effet, lors de l’infection à HIV les plaquettes sont dans un état d’hyperréactivité et libèrent des facteurs immunomodulateurs pouvant participer à l’inflammation observée chez les patients infectées. D’une manière parallèle, les plaquettes présentent une sensibilité aux bactéries, faisant intervenir les TLR2 et 4 mais aussi les exotoxines, voire les bactéries entières. Le profil de la réponse inflammatoire induite est assez conséquent et diversifié pour participer à la physiopathologie du sepsis. La participation des plaquettes à l’inflammation concerne également leur interconnexion avec les neutrophiles. La seconde partie des travaux traite d’ailleurs de cette coopération qui ne semble pas s’arrêter à la barrière endothéliale, car lors de leur extravasation les neutrophiles transportent avec eux les plaquettes ; qui sont encore capables d’entretenir l’inflammation au niveau du site inflammatoire (ici, modèle de l’alvéole pulmonaire). La diversité du répertoire moléculaire plaquettaire, mis en avant au cours de cette thèse, qui participe à l’inflammation ouvre plusieurs possibilités quant à l’élaboration d’anti-plaquettaires qui pourraient moduler une réponse inflammatoire exacerbée / Blood platelets are anucleate cells which play an key role in haemostasis. In addition to this function, they participate in a number of other functions related to the inflammatory response including danger detection, cytokine release, and leukocyte transmigration. In the first part of the study, we highlight the ability of platelets to undergo an inflammatory activation response to a pathogen. Indeed during HIV infection, platelets are hyperresponsive and release immunomodulatory factors that can be involved in the inflammatory state seen in the patients. In a parallel way, platelets are also sensitive to bacteria, involving TLRs 2 and 4, exotoxins, as well as whole live bacteria. The inflammatory profile induced is sufficient, and quite diversified to participate in sepsis physiopathology. Platelet inflammatory functions also apply to their ability to crosstalk with neutrophils. Thus in the second part of our study, we focus on this interconnection, which does not appear to be stopping at the endothelial barrier, and can be seen during extravasation where neutrophils carry surface bound platelets in order to maintain inflammation directly onsite (alveolar inflammation model here).The diversity of platelet inflammatory activities highlighted in our work leads to several possibilities for the development of an antiplatelet therapeutic target which could modulate an exacerbated inflammatory response