Submitted by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-08-10T13:24:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AvaliacaoExpressaoProteina.pdf: 2071475 bytes, checksum: 42ca1ff520667de26639359994ccf4fe (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-08-10T13:25:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AvaliacaoExpressaoProteina.pdf: 2071475 bytes, checksum: 42ca1ff520667de26639359994ccf4fe (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-10T13:25:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AvaliacaoExpressaoProteina.pdf: 2071475 bytes, checksum: 42ca1ff520667de26639359994ccf4fe (MD5) Previous issue date: 2014-08-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Entre as neoplasias malignas que ocorrem na boca, 95% são representadas pelo carcinoma epidermóide de boca (ceb). no brasil, as estimativas para o ano de 2014, segundo o inca, apontam mais de 15.290 novos casos. esses dados mostram que o ceb representa um problema de saúde pública em razão de a morbidade afastar, na maioria dos casos, grande número de cidadãos do mercado de trabalho, além de onerar os custos com a saúde no estado, fruto dos dias de internação e do tratamento aplicado. a patogênese do ceb está relacionada a fatores genéticos além de agentes químicos, como o consumo de tabaco e álcool, físicos e biológicos, considerados carcinogênicos. o fator de transcrição twist foi recentemente apontado como um importante regulador da tem durante a progressão tumoral e metástase e vem se tornando um importante marcador diagnóstico e prognóstico para pacientes devido ao fato de sua sobre-regulação positiva e metilação do gene estarem sendo implicados em vários tipos de câncer. apesar de muitos estudos fornecerem importantes insights sobre a compreensão da biologia dos tumores malignos bem como dos genes envolvidos na tem, os mecanismos de twist na tumorigênese e na transição epitelial-mesenquimal do carcinoma epidermóide bucal ainda precisam ser elucidados. neste estudo nós investigamos o padrão de expressão da proteína twist através da técnica de imuno-histoquímica em 59 amostras carcinoma epidermóide bucal (ceb) provenientes de pacientes usuários do sistema único de saúde do estado do pará e avaliamos a existência de associação dos resultados com características clínico-patológicas dos tumores estudados e com a sobrevida dos pacientes. os resultados mostraram uma associação estatisticamente significante entre o consumo de álcool e os sítios mais afetados pelo ceb, sugerindo que o etanol pode desempenhar um papel potencializador dos agentes do tabaco nos sítios que recebem maior exposição dessas substâncias. a expressão da proteína twist também mostrou uma diminuição na média de sobrevida dos indivíduos. apesar dessa diminuição não ter apresentado significância estatística em nossos estudos, acreditamos que ela deve ser mais amplamente estudada, visando o melhor entendimento do papel desta no carcinoma epidermóide bucal. a positividade de marcação da proteína demonstrou relação com o tabagismo, onde 87,8% dos pacientes fumantes, apresentaram marcação positiva para a proteína, corroborarando o fato de que o fumo pode modular a expressão de marcadores tem incluindo twist. em síntese, os resultados deste estudo evidenciam algumas correlações intrigantes, que no nosso entender merecem especial atenção, no intuito de serem esclarecidas. assim como a localização intracelular da proteína observada neste estudo, que possivelmente está relacionada a algum processo oncogênico ainda não descrito. / Among the malignant neoplasms that occur in the mouth, 95% are represented by oral squamous cell carcinoma (oscc). in brazil, the estimates for the 2014, according to the inca point more than 15,290 new cases. these data show that the oscc represents a public health problem because of the morbidity away a large numbers of patients from de work, and weigh the cost of health care in the state, due the days of hospitalization and the treatment applied. the pathogenesis of the oscc is related to genetic factors as well as chemical agents, such as tobacco and alcohol, physical and biological agents considered carcinogenic. the transcription factor twist was recently appointed as an important regulator of emt during tumor progression and metastasis and has become an important diagnostic and prognostic marker for patients due to the fact its positive upregulation and methylation of the gene are being implicated in several cancers. although many studies provide important insights into understanding the biology of malignant tumors as well as genes involved in emt, twist mechanisms in tumorigenesis and epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma remain to be elucidated. in this study we investigated the pattern of expression of twist protein by immunohistochemical technique in 59 oscc samples from patients from the national health system of the state of pará and evaluated the possible association of the results with clinical and pathologic features survival of patients.the results showed a statistically significant association between alcohol consumption and the most sites affected by the oscc, suggesting that ethanol may play a potentiating role of tobacco agents in sites that receive greater exposure of these substances. the expression of twist protein also showed a decrease in average survival of individuals. despite this decline have not shown statistical significance in our studies, we believe that it should be more widely studied, aiming at a better understanding of its role in oral squamous cell carcinoma. the positivity of protein labeling demonstrated relationship to smoking, where 87.8% of smoking patients showed positive staining for protein, corroborating the fact that smoking can modulate the expression of emt markers including twist. in summary, the results of this study show some intriguing correlations, which in our opinion deserve special attention in order to be clarified. as the intracellular localization of the protein observed in this study, is probably related to some oncogenic process is not described

INTRODUÇÃO: A Síndrome de Rubinstein-Taybi (RTS) é uma doença genética rara, caracterizada por dismorfismos craniofaciais típicos, polegares e háluces alargados, deficiência mental e baixa estatura. A incidência estimada é de 1: 125 000 a 1: 330000 nativivos. A SRT geralmente ocorre esporadicamente, mas pode ser herdada com um padrão de herança autossômico dominante. O diagnóstico da SRT é essencialmente clínico. OBJETIVOS: Realizar o estudo genético-clínico e citogenético em 30 pacientes brasileiros com SRT, e descrever de forma sistematizada a freqüência de dismorfismos faciais e malformações múltiplas encontradas. MÉTODOS: Neste estudo observacional retrospectivo e prospectivo, os pacientes foram seguidos no período de agosto de 2005 a junho de 2009. O cariótipo com bandeamento G foi realizado em todos os pacientes. RESULTADOS: A maioria dos pacientes avaliados foi do sexo feminino (60%). As seguintes características foram observadas em todos os pacientes da nossa casuística: atraso de desenvolvimento neuropsicomotor, ponta nasal voltada para baixo, columela proeminente, sorriso característico, dificuldades alimentares na infância, persistência dos coxins fetais, falanges distais dos polegares alargadas e pés planos. A baixa estatura e a microcefalia foi observada em 80% e 76% dos casos, respectivamente. As principais características craniofaciais observadas foram: fronte proeminente (86%), ponte nasal larga (60%), hipertelorismo (70%), sobrancelhas espessas e arqueadas (96%) cílios longos em 93%, prega epicântica (76%), fissura palpebral infra vertidas (76%), abertura bucal estreita (93%), retrognatismo (76 %), sorriso característico em 100%, palato alto e estreito (93%), anomalias dentárias (83%). Outras anomalias identificadas foram: estrabismo, erros de refração, obstrução do canal lacrimal, háluces e polegares alargados, angulação de polegares, anomalias do pavilhão auricular (rotação/posição/tamanho/forma), angulação do hálux, clinodactilia, sobreposição dos pododáctilos, falanges distais alargadas de outros dedos, marcha rígida, hipotonia, sopro cardíaco, cardiopatia congênita, criptoquidia, hemangioma plano e hipertricose. Uma paciente apresentou translocação recíproca de novo 46, XX, t (2; 16)(q36.3; p13.3). CONCLUSÕES: A raridade da SRT e o amplo espectro das manifestações clínicas pode atrasar o diagnóstico clínico. A média da idade ao diagnóstico dos nossos pacientes com SRT foi de três anos e oito meses. Todas as crianças devem receber avaliação por geneticista pediátrico, cardiologista, oftalmologista, neuropediatra, e odontopediatra / INTRODUCTION: Rubinstein-Taybi syndrome (RTS) is a rare genetic disorder characterized by distinctive craniofacial dysmorphisms, broad thumbs and toes and mental and statural deficiency. The prevalence of RTS has been estimated to be 1 in 125000 to 1: 330000 live births. RTS usually occurs sporadically although it can be inherited as an autosomal dominant disorder. The diagnosis of RTS is primarily based on clinical features. OBJECTIVES: We performed a clinical and cytogenetic assay in a group of 30 Brazilian RTS patients. We also decribed the frequencies of facial dysmorphisms and multiple malformations. METHODS: In this observational retrospective and prospective study, the patients were followed from August 2005 to June 2009. Chromosomal analysis was performed by G-banding karyotype. RESULTS: Most of the patients were female (60%).The following abnormalities were present in all of the patients: delayed psychomotor development, beaked nose, proeminent collumel, typical facies, broad thumbs and toes, flat feet, joint laxity, feeding problems during the childhood, and finger pads. Short stature was present in 80%, and microcephalia in 76% of the cases, respectively. Main craniofacial characteristics are frontal bossing (86%), wide nasal bridge (60%), ocular hyperthelorism (70%), high arched eyebrows (96%), long eyelashes (93%), epicathal folds (76%), downslanting palpebral fissures (76%), small opening of the mouth (93%), retrognathism (76%), grimacing smile (100%), high arched palate (93%), and dental anomalies (83%). Other findings were: strabism, refractive error, lacrimal obstruction, wide thumb and halux, angulated thumbs, external ears anomalies (rotation, implantation and morfology), angulated halux, clinodactyly, crowded toes, broad distal falanges of other fingers, stiff gait, hipotonia, cardiac murmur, congenital heart defect, undescendent testis, hypertrichosis, and hemangioma. One female patient has found to have a reciprocal de novo translocation t(2;16)(q36.3;p13.3) on G-banding karyotype CONCLUSIONS: The rarity of RTS and the wide spectrum of clinical manifestations, may delay the clinical diagnosis of RTS. The average age at the diagnosis of our patients was 3 years and 8 months. All children of RTS should receive an evaluation by a pediatric geneticist, cardiologist, ophthalmologist, pediatric neurologist, and pediatric dentist

The transcription initiation is the first step in gene expression and an important regulation step in all living organisms. In bacteria, it has been proposed that DNA bending and its wrapping on the surface of E. coli RNAP might facilitate the opening of the transcription bubble, which is necessary for the initiation of gene transcription. In this work, it is shown the first structural study to evaluate a DNA wrapping model, including its length and the relative position in the bacterial transcription initiation complex (RP complex), assembled between RNA polymerase-σ70 holoenzyme (RNAP) and a λPR promoter (-100 to +30 wild type). RP complex was prepared and negatively stained with 2% uranyl acetate on a thin-carbon coated grid and the data acquisition of 500 images was performed in a JEM-2100 (JEOL, Japan) microscope equipped with an F-416 CMOS camera (TVIPS, Germany). Single particle analysis of 16,015 particles, grouped in 666 class-averages, was conducted using IMAGIC 4D software (Image Science, Germany) to obtain a three-dimensional model of the RP complex at 20Å resolution. After the rigid-body fitting of the RNAP crystallographic structure (PDB 4YG2) and the modeled DNA promoter, it was observed that the regions 1.2 and 4.2 of the σ70 subunit interacts with the consensus zones, -10 and -35 hexamers of the promoter. Furthermore, it was possible to observe that αCTDs (C-terminal domain) in both alpha subunits would be oriented to facilitate the interaction with the first and second UP-elements regions, respectively (centered around –50 and -75 positions in the promoter). These was enabled by the presence of the characteristics motifs helix-hairpin-helix in these domains. In addition, the downstream DNA, from the transcription bubble, appears to be inside the protein main channel, oriented in a way to enable interactions with the RNAP clamp and jaws. Finally, it was observed that the DNA wrapping has ~32 nm of total length and involves a promoter bent of ~255° around the RNAP surface. The 3D-model obtained in this study is the very first direct structural confirmation of the DNA promoter wrapping in a bacterial transcription initiation complex. / A iniciação da transcrição é o primeiro passo na expressão gênica e importante ponto de regulação em todos os organismos vivos. Em bactérias, foi proposto que o enovelamento do DNA na superfície da RNAP de E. coli pode facilitar a abertura da bolha de transcrição, necessária para o início da transcrição gênica. Neste trabalho, é apresentado o primeiro estudo estrutural direto para avaliar o comprimento do enovelamento do DNA e sua posição no complexo de iniciação da transcrição bacteriana (complexo RP), montado entre a holoenzima RNA polimerase-σ70 (RNAP) e um promotor λPR (-100 para +30, tipo selvagem). Amostras do complexo RP foram preparadas e contrastadas negativamente com 2% de acetato de uranila em uma grade com filme fino de carbono e a aquisição de 500 imagens foi realizada em um microscópio JEM-2100 (Jeol, Japão) equipado com uma câmera CMOS F-416 (TVIPS, Alemanha). A análise de partículas isoladas de 16.015 partículas, agrupadas em 666 médias de classe, foi conduzida usando o software IMAGIC 4D (Image Science, Alemanha) para obter um modelo tridimensional do complexo RP, a 20Å de resolução, estimado pelo critério de ½ bit. Após o ajuste de corpo rígido da estrutura cristalográfica da RNAP (PDB 4YG2) e do promotor de DNA modelado, observou-se que as regiões 1.2 e 4.2 da subunidade σ70 interagem com as zonas de consenso, hexâmeros -10 e -35, do promotor. Além disso, foi possível observar que os αCTDs (domínio C-terminal) em ambas as subunidades alfa estariam orientados para facilitar uma possível interação com a primeira e segundas regiões dos elementos UP, respectivamente (centradas em torno das posições –50 e -75 do promotor). Estas seriam possíveis devido à presença de alguns motivos de características hélice-grampo-hélice nesses domínios. Além disso, a região do promotor, downstream da bolha de transcrição, parece estar dentro do canal principal da proteína, orientado de forma a possibilitar interações com o clamp e jaw da RNAP. Finalmente, foi observado que o comprimento total do enovelamento de DNA envolve cerca de 32 nm e 255° de rotação do DNA ao redor da superfície da RNAP. Portanto, este modelo 3D é a primeira confirmação estrutural direta do enovelamento de DNA em um complexo bacteriano de iniciação da transcrição.

No genoma de camundongo existem por volta de 1000 genes que codificam para receptores olfatórios (ORs) e 150 genes que codificam para receptores de feromônios do tipo 1 (V1Rs) distribuídos em vários cromossomos. Cada neurônio olfatório e vomeronasal seleciona um único alelo de um único gene de receptor OR ou de V1R, respectivamente, para expressar enquanto que o restante do repertório é mantido silenciado. Os mecanismos que regulam esse padrão de expressão não são conhecidos. As similaridades no padrão de expressão dos genes de ORs e de V1Rs sugerem que o mecanismo de regulação possa ser comum. Até então poucas regiões promotoras de genes de ORs e de genes de V1Rs haviam sido experimentalmente determinadas e pesquisadas. Realizamos uma análise na qual regiões a montante de um grande número de diferentes genes de ORs e de genes de V1Rs foram comparadas. Primeiro, utilizando a técnica de RLMRACE, combinada com o uso de oligonucleotídeos capazes de reconhecer regiões conservadas entre diversos membros das famílias de genes de ORs e de V1Rs, geramos centenas de cDNAs contendo a região 5UTR completa para um total de 198 genes de ORs e 39 genes de V1Rs diferentes. Então, alinhamos as sequências desses cDNAs contra o genoma de camundongo e localizamos a posição exata dos sítios de início da transcrição (TSSs) de cada gene. Extraímos seqüências a 5 dos TSSs dos 198 genes de ORs e dos 39 genes de V1Rs e buscamos por motivos de DNA comuns, presentes em várias dessas regiões promotoras, que pudessem ser 6 candidatos a elementos cis-atuantes envolvidos na regulação geral desses genes de receptores sensoriais. Identificamos, na grande maioria das regiões promotoras dos genes de ORs e dos genes de V1Rs analisadas, a presença de motivos semelhantes a sítios de ligação para os fatores de transcrição O/E que são fatores de transcrição já caracterizados e envolvidos com a expressão de genes específicos do sistema olfatório. Ensaios de EMSA mostraram que os motivos semelhantes aos sítios de ligação de O/E identificados interagem com proteínas nucleares de epitélio olfatório, mas não interagem com proteínas nucleares de cérebro e fígado. Identificamos também nas regiões promotoras de genes de V1Rs a presença de um sítio de ligação que não se assemelha a nenhum sítio de ligação de fatores de transcrição conhecido. Esse motivo de DNA, além de estar presente na maioria dos promotores de genes de V1Rs analisados (77% do total de 39 genes pesquisados), também aparece, com alta frequência, em promotores de genes de ORs (52% do total de 198 genes analisados), preferencialmente próximo aos TSSs. Ensaios de interação in vitro indicam que este novo motivo de DNA interage com proteínas nucleares extraídas de órgão vomeronasal e também de epitélio olfatório, mas não interage com proteínas nucleares de cérebro, fígado e pulmão. Nosso trabalho mostra que genes de ORs e de V1Rs compartilham elementos comuns em suas regiões promotoras os quais podem ser sítios de ligação de fatores de transcrição específicos do sistema olfatório envolvidos no mecanismo de regulação da expressão desses genes. / In the mouse genome there are approximately 1000 genes that encode olfactory receptors (ORs) and 150 genes that encode type 1 vomeronasal receptors (V1Rs) dispersed in various chromosomes. Each olfactory or vomeronasal neuron selects one single allele from one single receptor gene (OR or V1R) for expression while the rest of the repertoire remains silenced. The mechanisms underlying OR and V1R gene expression are still unknown. The similarities of the pattern of expression in both types of olfactory sensory neurons suggest that the regulation of OR and V1R gene expression may be under the control of a common mechanism. Until now, promoter regions of different OR and V1R genes had not been extensively analyzed. We carried out a comprehensive analysis in which the upstream regions of a large number of different OR and V1R genes were compared. First, using the RLM-RACE strategy, combined with degenerate PCR we generated hundreds of complete 5UTR cDNAs for a total of 198 OR genes and 39 V1R genes. Then, these cDNAs were aligned against the mouse genome sequence and the transcription start sites (TSSs) were precisely determined. Sequences upstream of the TSSs were retrieved and searched for common DNA motifs that may play a role as cis-acting elements involved in the general regulation of OR and V1R gene expression. The analysis revealed the presence of motifs that resemble O/E-like sites overrepresented in the OR and V1R promoter regions. These O/E-like motifs specifically interact with nuclear protein prepared from olfactory epithelium, but not from brain and liver. 8 We also identified a new motif that does not resemble any known transcription factor binding site. Besides, this new motif is present in 77% of the 39 V1R promoter regions and in 52% of the 198 OR promoter regions analyzed, preferentially concentrated near the TSSs. Interestingly, binding assays indicate that this new motif interacts with nuclear proteins prepared from the vomeronasal and the olfactory epithelia, but not from brain, liver and lung. Our results indicate that OR and V1R genes share common promoter elements that may be binding sites for specific olfactory transcription factors and may play a role in a common mechanism of olfactory and vomeronasal gene regulation

As células glias de Müller são capazes de gerar novos neurônios retinianos em resposta a lesões, atuando como uma possível fonte para regeneração retiniana. Nesse contexto, as GTPases Rho podem ter um papel interessante, visto que regulam múltiplas vias de sinalização que controlam, por exemplo, a transcrição gênica, sobrevivência e proliferação celular. No presente estudo analisamos a participação de um dos membros dessa família (Rac1) na proliferação de células gliais de Müller da retina de galinhas após lesão excitotóxica com N-Metil-D-Aspartato (NMDA). A injeção intraocular de NMDA promoveu extensa proliferação de células gliais de Müller. A inibição de Rac1 com NSC23766 não alterou a quantidade de células que entraram no ciclo celular, mas, provocou um retardo em sua progressão. Esses resultados sugerem um importante papel para a GTPase Rac1 na regulação da proliferação de células gliais de Müller em resposta a lesões retinianas. / Müller glial cells may generate new neurons in response to retinal injury, acting as a potential source for retinal regeneration. In this context, Rho GTPases may have an interesting role, since they regulate multiple signaling pathways that control, for example, gene transcription, cell proliferation and survival. This study analyzed the involvement of a member of this family (Rac1) in the proliferation of Müller glial cells of chick retina after excitotoxic injury with N-methyl-D-aspartate (NMDA). Intraocular injection of NMDA promoted extensive Müller glia proliferation. Rac1 inhibition with NSC23766 did not affect the cell cycle entry, but a delay in cell cycle progression was observed. These results suggest an important role for Rac1 in the regulation of Müller glial cells proliferation in response to retinal injury.

Os projetos genoma têm fornecido uma grande quantidade de informação sobre a arquitetura gênica e sobre a configuração física de suas respectivas regiões flanqueadoras (RF). Estas RF contêm informações com o potencial de auxiliar na elucidação de vários processos biológicos, como os mecanismos de expressão gênica e de sua regulação. Estes mecanismos são de extrema importância para a compreensão do correto funcionamento dos organismos e das patologias que os afetam. Uma parte significativa dos mecanismos de controle de expressão gênica atuam na fase transcricional. Na base destes mecanismos está o recrutamento de proteínas que se ligam às regiões promotoras da transcrição, as quais são segmentos específicos de DNA que podem estar localizados tanto próximos à região de início da transcrição (TSS) quanto a centenas ou até a milhares de pares de bases dela. Essas proteínas compõem a maquinaria transcricional e podem ativar ou inibir o processo de transcrição. Experimentalmente, os segmentos regulatórios podem ser identificadas utilizando métodos complexos de biologia molecular, tais como SELEX, ChiP-ChiP, ChIP-Seq, dentre outros. Uma estratégia alternativa aos métodos experimentais é a utilização de metodologias computacionais. Análises computacionais tendem a ser mais rápidas, baratas e flexíveis do que protocolos experimentais, além de poderem ser utilizadas em larga escala. Atualmente, os métodos computacionais disponíveis necessitam de informações experimentais para a definição de padrões globais de preferências de sequências de DNA para a ligação de fatores de transcrição (TFBS, em inglês transcription factor binding sites). Entretanto, esses métodos apresentam uma elevada taxa de falso positivos e, por vezes, apresentam também taxas significativas de falso negativos, além de serem limitados ao estudo de fatores de transcrição de espécies bem conhecidas, o que diminui a área de aplicação dos mesmos. Diante deste cenário, o uso de métodos computacionais que não necessitem da informação referente aos sítios de ligação, bem como os que utilizem parâmetros mais robustos de detecção dos resultados, em detrimento dos escores de pontuação provindos de alinhamentos, podem acrescentar uma sensível melhoria ao processos de predição de regiões regulatórias. Neste projeto, foi desenvolvido um novo modelo computacional (TFBSAnalyzer) para análise e identificação de TFBS em elementos regulatórios, que utiliza técnicas de modelagem molecular para a construção de complexos entre um fator de transcrição ancorado a estruturas de DNA com sequências variáveis de bases e, através de cálculos termodinâmicos de entalpia de ligação, determina uma função de pontuação baseada na energia de ligação e realiza a predição de sítios de ligação ao DNA para o fator de transcrição em análise. Esta abordagem foi testada com três fatores de transcrição como sistemas-modelo, pertencentes à família dos receptores nucleares, a saber: o receptor de estrógeno ER-alfa (Estrogen Receptor Alpha), o receptor de ácido retinoico RAR-beta (Retinoid Acid Receptor Beta) e o receptor X retinóico RXR (Retinoid X Receptor). Os modelos previstos computacionalmente foram comparados aos dados experimentais disponíveis para estes receptores nucleares, os quais apresentaram as seguintes taxas de FP/FN: 10%/0 para RAR-beta e RXR, 21%/6% para ER-alfa. Também simulamos um experimento de ChIP-seq do ER-alfa no genoma humano, cujos genes selecionados foram submetidos a uma análise de enriquecimento de fatores de transcrição curados experimentalmente, que fazem sua regulação, revelando que o receptor de estrógeno está realmente envolvido no processo. Para mostrar a aplicabilidade geral de nosso método, nós modelamos a distribuição de energia de ligação para o receptor NHR-28 isoforma a de Caenorhabditis elegans com DNA . Obtivemos distribuições de energia semelhantes àquelas encontradas para os NRs modelos, portanto seria possível aplicar o método para buscar possíveis TFBSs para este receptor no genoma de C. elegans. Os dados gerados e as metodologias desenvolvidas neste projeto devem acrescentar uma sensível melhoria aos processos de predição de regiões regulatórias e consequentemente auxiliar no entendimento dos mecanismos envolvidos no processo de expressão gênica e de sua regulação. / The genome projects have provided a lot of information about the genetic architecture, as well as on the physical configuration of their flanking regions (FR). These FR have the potential to aid in the elucidation of many biological processes, such as the mechanisms involved in gene expression and its regulation. These mechanisms are extremely important for undeerstanfind the correct functioning of organisms as well as the pathologies that affect them. A significant part of the control mechanisms of gene expression act during transcription. On the basis of this mechanisms is the recruitment of proteins that bind to promoter regions of transcription, which are specific segments of DNA that can be located either near the transcription start site or at hundreds or even thousands of base pairs away. These proteins form the transcription machinery, which can activate or inhibit the transcription process. The regulatory segments can be identified experimentally using complex methods of molecular biology, such as SELEX, ChIP-chip, ChIP-seq, among others. An alternative strategy to these experimental methods is the use of computational methodologies for predicting regulatory regions. Computational analysis tend to be faster, cheaper and more flexible than the experimental protocols, and can be used on a larger scale. Currently, the available computational methods require information previously obtained from experiments in order to define global standards of preference of DNA-Binding sequences for transcription factors (TFBS - Transcription Factor Binding Sites). However, these methods have a high rate of false positives and sometimes also have significant rates of false negatives, besides being limited to the study of transcription factors of well-known species, which decreases their application area. In this scenario, the use of computational methods that do not require previous information concerning the binding sites and use more robust parameters of results detection, instead of alignment scores, may add significant improvement to the processes of predicting regulatory regions. In this project, we developed a new computational model TFBSAnalyzer) for analysis and identification of regulatory elements using molecular modeling techniques for the construction of complexes between a transcription factor bound to specific DNA structures with variable sequences of bases and, by means of thermodynamic calculations of bond enthalpy, provides a scoring function based on the binding energy and predicts the DNA binding sites for the transcription factor in analysis. This approach was tested initially with three transcription factors as models, belonging to the nuclear receptor family, namely estrogen receptor ER-alpha (Estrogen Receptor Alpha), the retinoic acid receptor RAR-beta (Retinoid Acid Receptor Beta) and the retinoic X receptor RXR (Retinoid X Receptor). The computationally predicted models were compared to experimental data available for these nuclear receptors, and presented the following rates of FP/FN: 10%/0 for RAR-beta and RXR, 21%/6% for ER-alpha. We also simulated an experiment of ChIP-seq with ER-alpha with the human genome, where the selected genes were subjected to a transcription factor enrichment analysis, with curated information, revealing that the estrogen receptor is indeed involved in their regulation. To show that our method has a general applicability, we modeled the binding energy distribution for the NHR-28 receptor, isoform a, from Caenorhabditis elegans. The energy distributions obtained were similar to the ones obtained for the model NR, so it would be possible to use the method and search for possible TFBS in the C. elegans genome. The data generated and the methodologies developed in this project should add a significant improvement to the prediction processes of regulatory regions and, consequently, help to understand the mechanisms involved in the gene expression process and its regulation.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-19T13:29:29Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina(jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2013-11-26T11:00:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2014-09-26T10:49:49Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-03-10T13:27:33Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As células-tronco (CTs) têm potencial de se diferenciar em vários tipos celulares servindo como um sistema de reparação de tecidos. Quando uma CT se divide mantém o mesmo potencial da célula que a originou em um mecanismo chamado de autorrenovação. O entendimento desse mecanismo ajudará a compreender a senescência e a perda do potencial de diferenciação das CTs. Em nível de regulação pós-transcricional, as proteínas DZIP1 e PUM2 estão envolvidas na autorrenovação de CT embrionárias e germinativas de diversos organismos, incluindo humanos. Contudo, o trabalho visou o estudo do envolvimento de PUM2 e DZIP1 nos mecanismos de autorrenovação e diferenciação em CTs mesenquimais humanas (CTMs). Por RT-PCR, foi observada a expressão dos transcritos de dzip1 e pum2 em CTMs derivadas de medula óssea (MO), sangue de cordão umbilical e placentário (SCU) e tecido adiposo (TA). A expressão dos transcritos também foram analisada durante a adipogênese das CTMs por qRT-PCR. Os resultados demonstram que o perfil de expressão dos dois transcritos sofre redução durante o processo, enquanto o transcrito de fabp4 (marcador adipogênico) aumenta. Por citometria de fluxo foi verificada a porcentagem de CTMs de TA que expressam DZIP1 (mais de 90% da população) e PUM2 (cerca de 50% da população). A expressão das proteínas PUM2 e DZIP1 foi confirmada por western blot em extratos totais de CTMs. Durante a diferenciação celular, a expressão da proteína DZIP1 se manteve constante enquanto PUM2 sofreu redução após induzida da diferenciação. A discrepância entre os níveis de mRNA e da proteína DZIP1 sugere regulação pós-transcricional. As imunofluorescências de DZIP1 e PUM2 nas CTMs indicaram que essas proteínas são nucleares em células de culturas recém sub-cultivadas e a localização dessas são translocadas para o citoplasma ao longo do tempo da cultura. As células diferenciadas expressam as duas proteínas no citoplasma e/ou núcleo. Análise dos transcritos de dzip1 e pum2 também foi verificada em culturas com proliferação celular intensa e reduzida. Dzip1 não apresentou mudanças significativas de expressão nas duas situações. No entanto, a expressão de pum2 aumentou nas CTMs com proliferação intensa, sugerindo uma possível participação nesse processo. Ensaios futuros serão realizados para confirmar a participação de PUM2 na proliferação celular. Além disso, a interferência de dzip1 e pum2 por RNA será providenciada para análise funcional desses genes. / Stem Cells (SCs) have the potential of differentiating into several cellular types, serving as a repair system for the organism. The ability of stem cells to replicate themselves by dividing into the same non-specialized cell type over long periods is a mechanism knows as self-renewal. The understanding of this mechanism will also help to understand the senescence and hence, the loss of SCs differentiation potential. PUMILIO2 and DZIP1 RNA binding proteins regulate the translation of specific mRNAs during self-renewal and differentiation of germ-line and embryonic stem cells of diverse organisms, including humans. In this work, we aimed to study the relevance of PUM2 and DZIP1 in self-renewal and differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We have found that dzip1 and pum2 transcripts are expressed in hMSCs derived from bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and umbilical cord blood (UC) by using RT-PCR analysis. We have found that more than 90% of the MSCs population express DZIP1 and about 50% express PUM2 by flow cytometry. The expression pattern of pum2 and dzip1 transcripts was followed during differentiation of adipose derived MSCs into adipocytes. Quantitative PCR analysis showed that mRNA levels of both genes drop during differentiation, showing an opposite pattern to the fabp4 adipocyte marker. The presence of the PUM2 and DZIP1 proteins was confirmed by western blot of total protein extracts of AT derived hMSCs. During cell differentiation, the expression of the protein DZIP1 was constant while PUM2 decreased. The discrepancy between the levels of the dzip1 mRNA and protein suggests a regulated transcriptional and post-transcriptional expression of these genes. DZIP1 and PUM2 in immunofluorescence assays in hMSCs indicated that they are nuclear in freshly plated cells and translocate to the cytoplasm over time. The differentiated cells present the two proteins in the cytoplasm and nucleus. The expression pattern of the dzip1 and pum2 transcripts was also followed in cultures of MSCs derived from AT undergoing intense and reduced cell proliferation. Dzip1 showed no significant changes of expression in both situations. However, the expression of pum2 is higher in hMSCs with intensive proliferation than with reduced proliferation suggesting a possible participation in this process. To pave the way to a better understanding of DZIP1 and PUM2 function in hMSCs, RNA interference experiment are in progress.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-30T11:59:08Z No. of bitstreams: 1 fabio_p_m_santos_ioc_bcm_0037_2011.pdf: 10305796 bytes, checksum: 74de5b830c8354cd532f74bd40993c6a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T11:59:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabio_p_m_santos_ioc_bcm_0037_2011.pdf: 10305796 bytes, checksum: 74de5b830c8354cd532f74bd40993c6a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Durante a resposta alérgica, dentre os vários mediadores inflamatórios de natureza lipídica, a prostaglandina D2 (PGD2) é considerada um mediador-chave. Em adição aos seus conhecidos efeitos quimiotáticos para eosinófilos, recentemente, foi descrito que a PGD2 é também capaz de promover a ativação dos eosinófilos, induzindo a biogênese de corpúsculos lipídicos e a síntese de leucotrieno C4 (LTC4) nessas organelas recém-formadas. Esses efeitos são atribuídos a ação da PGD2 sobre seus 2 receptores – DP1 e DP2 – os quais encontram-se expressos de maneira constitutiva na membrana dos eosinófilos. Então, o objetivo principal do estudo foi identificar o receptor específico da PGD2 envolvido no mecanismo de síntese de LTC4 por eosinófilos estimulados com PGD2. In vivo, num modelo murino de pleurisia alérgica e induzida por PGD2, a utilização dos antagonistas seletivos do receptor DP1 (BW A868c) ou do receptor DP2 (CAY10471) inibiu a síntese de LTC4 nessas respostas inflamatórias. No entanto, somente BWA868C foi capaz de inibir a biogênese de corpúsculos lipídicos nos eosinófilos recrutados para o sítio inflamatório; enquanto que o tratamento com o CAY10471, diminuiu o número de eosinófilos infiltrantes na cavidade pleural, mas não inibiu a biogênese de corpúsculos lipídicos nessas poucas células recrutadas. In vitro, eosinófilos humanos purificados estimulados com PGD2 tiveram a síntese de LTC4 inibida tanto pelo pré-tratamento com BWA868c, quanto pelo prétratamento com CAY10471. Além disso, a ativação do receptor DP1, com seu agonista seletivo (BW245c) e a ativação do receptor DP2 com o agonista seletivo do receptor DP2 (DK-PGD2) corroborou a observação de que no processo de síntese de LTC4 nos eosinófilos, ambos os receptores são necessáior, pois somente quando ambos os receptores foram ativados simultaneamente foi observada síntese de LTC4 nos corpúsculos lipídicos recém-formados (Eicosacell). Além disso, caracterizamos que uma das vias de sinalização intracelular envolvida na formação de corpúsculos lipídicos é depende da ativação de proteína quinase A (PKA). Em um outro grupo de ensaios, investigamos a PGD2 como potencial alvo terapêutico em doenças alérgicas. Recentemente, foi descrito que o extrato aquoso de C. sympodialis e a warafteína (alcalóide isolado) têm propriedades antialérgicas, visto que não somente reduzem a eosinofilia, mas também, a biogênese de corpúsculos lipídicos, assim como a produção de leucotrienos cisteinados. Dessa forma, aqui demonstramos que os pré-tratamentos tanto com o extrato quanto com o alcalóide isolado, foram capazes de inibir a produção de PGD2 ocorrida durante a resposta alérgica. In vitro, embora a warafteína não tenha inibido a biogênese de corpúsculos lipídicos em eosinófilos induzida por PGD2, observamos que é capaz de bloquear a liberação de PGD2 por mastócitos ativados – mas, não a produção de PGE2 por macrófagos ativados com A23187 – demonstrando que o mecanismo de ação dos seus efeitos antiinflamatórios não parecem envolver antagonismo de receptores em eosinófilos, e sim inibição da síntese da PGD2 em sítios alérgicos. / During allergic response, among several lipid mediators produced, prostaglandin D2 (PGD2) has emerged as key mediator. In addition to its known eosinophilotatics effects, recently PGD2 was described to be able to promote eosinophil activation, inducing lipid bodies biogenesis and LTC4 synthesis within these newly formed organelles. These effects are attributed to the action of PGD2 on its 2 receptors – DP1 e DP2 – which are expressed constituvely on eosinophil cell membranes. So, the main objective of this study was to identify the PGD2 specific receptor involved in LTC4 synthesis mechanism by stimulated eosinophils with PGD2. In vivo, in a murine allergic model of pleurisy and in a pleurisy induced by PGD2, the use of selective DP1 receptor (BWA868c) and DP2 receptor (CAY10471) antagonists showed us that both treatments inhibited LTC4 synthesis during these inflammatory responses. However, only BWA868C treatment was able to inhibit lipid bodies biogenesis within recruited eosinophils to the inflammatory sites, while CAY10471, decreased the number of infiltrated eosinophils in the pleural cavity, but did not inhibit lipid bodies biogenesis within these low number of recruited cells. In vitro, pre-treatment with BWA868c or CAY10471 inhibited LTC4 synthesis by human eosinophils stimulated with PGD2. Moreover, the activation of DP1 receptor with its selective agonist (BW245c) and DP2 activation with DP2 selective agonist (DK-PGD2) reinforced the observation that during LTC4 synthesis within eosinophils, activation of both receptors are necessary, because only simultaneous activation of DP1 and DP2, induced LTC4 synthesis within eosinophilic lipid bodies (Eicosacell). Moreover, we observed that the pathway of cellular signaling involved on lipid bodies biogenesis induced by DP1 activation is dependent on protein kinase A (PKA). In another set of experiments, we investigated PGD2 as a therapeutical target of allergic diseases. Recently, it was described that aqueous extract of C.sympodialis and warafteine (isolated alkaloid) have antiallergic properties, because of its effects on the reduction of eosinophils recruitment, lipid bodies biogenesis and cysteinyl leukotrienes synthesis. Here, we demonstrated that pre-treatments with extract and its alkaloid were able to inhibit PGD2 production during allergic response. In vitro, warafteine did not inhibit eosinophil lipid bodies biogenesis induced by PGD2, but it was capable to inhibit PGD2 release by activated mast cells – otherwise fail to blockade PGE2 production by A23187- activated macrophages – suggesting that the action mechanism of its antiinflammatory effects could occur through PGD2 synthesis inhibition in allergic sites.

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: Introdução: A pré-eclâmpsia (PE) é uma patologia obstétrica e uma das principais causas de morbimortalidade materna e fetal. Na PE ocorre um estado de má adaptação da tolerância imunológica, caracterizada por ativação anormal do sistema imune inato e adaptativo. As células T reguladoras (Treg) representam uma população de linfócitos T responsáveis pela manutenção da tolerância e controle da inflamação, enquanto células Th17 medeiam diferentes tipos de reações inflamatórias. Portanto, o balanço entre células Treg e Th17 pode ser crítico para a tolerância ao feto e prevenção da PE. Objetivo: Avaliar as subpopulações de células T CD4+ (Th1, Th2, Th17 e Treg) e o perfil de citocinas produzido por essas células, em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia, classificadas em PE precoce e PE tardia. Métodos: Foram estudadas 60 gestantes, sendo 20 normotensas e 40 portadoras de PE, pareadas pela idade gestacional. As gestantes com PE foram classificadas de acordo com o aparecimento das manifestações clínicas em PE precoce (< 34 semanas de gestação; n=20) e PE tardia (≥ 34 semanas de gestação; n=20). Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), obtidas das gestantes foram avaliadas quanto à produção de citocinas pró e anti-inflamatórias e à expressão de fatores de transcrição envolvidos na caracterização das subpopulações de células T CD4+. A expressão dos fatores de transcrição intracitoplasmáticos de células Th1 (T-bet), Th2 (GATA-3), Th17 (RORc) e Treg (FoxP3) foi avaliada por c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-30Bitstream added on 2014-06-13T19:26:31Z : No. of bitstreams: 1 souza_jac_me_arafo.pdf: 631355 bytes, checksum: 9371a4a7027469c6d4a66de2870a71ed (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A expressão de citocinas inflamatórias é um processo estritamente regulado por mecanismos variados, incluindo o controle da sinalização intracelular e da atividade transcricional por inibidores endógenos, os quais são pouco estudados e compreendidos. Três grupos de proteínas: SHP, PIAS e SOCS inibem de maneira distinta e específica a transdução de sinais pela via JAK/STAT, bem como a atividade dos fatores de transcrição, eventos que modulam a expressão de diversas citocinas. As doenças periodontais estão associadas à inflamação persistente, com elevados níveis de citocinas proinflamatórias, no entanto praticamente não existem informações sobre a participação destes mecanismos de regulação nas diferentes condições clínicas periodontais. Os objetivos deste projeto incluíram avaliar a cinética de expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 e suas proteínas-alvo, STAT1 e STAT3, respectivamente, durante a evolução da doença periodontal. Foram utilizados 36 ratos Wistar divididos em 2 grupos: DP - doença periodontal induzida por 2 métodos: ligaduras ao redor dos 1os molares inferiores e injeções de 60 μg de LPS de E. coli no tecido gengival palatino dos molares superiores, 3x/semana; Grupo controle negativo - recebeu apenas injeções de PBS (veículo). Os ratos foram sacrificados 7, 15 e 30 dias após a indução da doença periodontal para avaliação histológica e análise macroscópica da perda óssea alveolar. A expressão de SOCS1 e SOCS3 e a ativação de STAT1 e STAT3 foram avaliadas nas biópsias gengivais por PCR em tempo real e Western blot. Ambos os modelos apresentaram significante e progressiva perda óssea dos 7 aos 30 dias. A inflamação foi evidente já no período de 7 dias em ambos os modelos, porém enquanto manteve-se similar nos demais períodos no modelo de indução por LPS, apresentou uma diminuição na severidade da inflamação... / Inflammatory cytokine gene expression is a process strictly regulated by various mechanisms, including the negative regulation of signaling of cytokine receptors and of the activity of transcription factors such as STATs. These mechanisms involve endogenous proteins and are largely unknown, especially in periodontal diseases. Three groups of proteins, SHP, PIAS and SOCS modulate in a fairly specific manner JAK/STAT signaling and/or STAT activity. Periodontal diseases are infectious-inflammatory conditions of the supporting tissues of the teeth associated with increased levels of proinflammatory cytokines, but there are no information regarding the role of these endogenous mediators of JAK/STAT during its course. The aims of this study included the evaluation of the expression kinetics of inducible negative regulators and their target proteins during the course of experimentally induced periodontal disease. 36 Wistar rats were divided into two groups: PD - experimental periodontal disease induced by two methods: ligature placement around the first mandibular molars and E. coli lipopolysaccharide (LPS) injections into the palatal gingival tissues of the maxillary molars, 3x/week, and Negative Control group. Rats were sacrificed 07, 15 and 30 days after disease induction for histological evaluation of periodontal inflammation and macroscopic analysis of alveolar bone loss. SOCS expression and the activation status of STAT1 and STAT3 were evaluated in gingival biopsies by real time PCR and Western Blot. Both disease models presented significant progressive bone loss from 7 to 30 days. Inflammation was evident and similar for all the periods in LPS injected sites; however, a decrease on severity at the end of the experimental period was observed in the ligature model. There was a significant (p<0.05) increase on SOCS1 and SOCS3 gene expression in PD compared to control... (Complete abstract click electronic access below)