Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Silvia Mika Shishido / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T19:46:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_Daisy_M.pdf: 1450123 bytes, checksum: e8dc961f855a7ea88daa10bb8ee00685 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A riboflavina (RF) é uma vitamina hidrossolúvel pertencente ao complexo vitamínico B2 e precursora das coenzimas FMN e FAD. Além da função biológica como componente de coenzimas, a RF apresenta atividade antitumoral e fotossensibilizante. A proposta principal desse estudo se baseou na avaliação da fototoxicidade da RF, bem como na determinação de marcadores moleculares da inflamação, senescência e morte celular, ações deletérias normalmente desencadeadas pela radiação UVA. Os resultados obtidos indicam que a RF tem potencial aplicação na terapia fotodinâmica, levando se em conta os modelos celulares utilizados, fibroblastos (BALB/c 3T3) e queratinócitos humanos (HaCaT). As células BALB/c 3T3 tratadas com RF 6,0 mM e dose de 5 J/cm² de radiação UVA, apresentaram indução de apoptose principalmente pela via intrínseca. A indução de senescência foi evidenciada pelo aumento da p-caveolina e aumento da atividade da MMP-2 (principal protease responsável pela degradação de colágeno). De acordo com os níveis de NFkB e p- IKKa/b, a RF não alterou significativamente o processo de inflamação desencadeado pela radiação UVA. Nas células HaCaT, o tratamento com 5,0 mM de RF e dose de 5 J/cm² de radiação UVA levou a ativação da apoptose induzida tanto pela via extrínseca como pela intrínseca. O aumento nos níveis de p-caveolina, p21 e da atividade das MMPs-2 e -9 sugerem à indução de processo de senescência precoce também nos queratinócitos. Além disto, a diminuição da expressão do NF?B indica que o mesmo esteja se translocando para o núcleo e, portanto, regulando a resposta inflamatória. Outro aspecto avaliado foi a influência do copolímero F-127 na fototoxicidade da RF. A irradiação do hidrogel contendo F-127 e riboflavina manteve a propriedade fototóxica da mesma. Nossos dados sugerem que a RF apresenta potencial para uso em terapia fotodinâmica, uma vez que a mesma se mostrou fototóxica quando irradiada com doses subtóxicas de radiação UVA. / Abstract: Riboflavin (RF) is a water soluble vitamin which belongs to vitamin B2 complex, an essential precursor of FMN and FAD coenzymes. Besides being a component of coenzymes, RF displays antitumoral and photossensitizing activities. The main proposal of this study was to evaluate the RF phototoxicity, as well as to determine molecular markers of inflammation, senescence and cellular death, deleterious actions normally triggered by the UVA radiation. Taking into consideration both cell lines used as models, fibroblasts (BALB/c 3T3) and human keratinocytes (HaCaT), the results obtained indicate that RF has potential application in photodynamic therapy. BALB/c 3T3 cells treated with 6.0 µM RF associate with UVA radiation (5 J/cm²) showed apoptosis induction mainly via intrinsic pathway. An increase of p-caveolin and MMP-2 activity (major protease responsible for degradating collagen) evidenced senescence induction. According to NF?B and p-IKKa/ß levels, RF did not significantly change the process of inflammation triggered by UVA radiation, in fibroblast cells. In HaCaT cells 5.0 µM RF associated with UVA radiation (5 J/cm ²) was observed apoptosis induction thorough extrinsic and intrinsic pathways. Senescence process was also observed in keratinocytes as indicated by an increase of pcaveolin, p21 and MMPs-2 and -9 activities. Besides, the decrease of NF?B expression indicates that this transcription factor translocates into the nucleus and in turn, regulates inflammatory response. Other aspect evaluated in this work was the influence of the F-127 in the RF phototoxicity. The irradiation of hydrogel containing F-127 and RF remained RF phototoxicity property. Our findings suggest that RF displays potential for use in photodynamic therapy, once it was phototoxic when irradiated with subtoxic UVA dose / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AnaCarolinaSantosde_D.pdf: 3901394 bytes, checksum: ef9ac69de23f7f2b15590ee29a931c8f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Produtos naturais têm originado muitos dos compostos biologicamente ativos usados clinicamente, destacando-se como importantes fontes de novos agentes terapêuticos utilizados no tratamento das mais variadas patologias incluindo câncer, HIV/AIDS, Alzheimer e malária. O desenvolvimento de novos fármacos a partir de produtos naturais, especialmente os derivados de plantas, tem desempenhado importante papel na prevenção e tratamento do câncer sendo que, de todos os antitumorais disponíveis entre 1940 e 2002, aproximadamente 40% eram caracterizados como produtos naturais ou derivados destes, com outros 8% sendo considerados agentes mimetizantes de produtos naturais. No presente trabalho, fisetin (flavonóide de origem vegetal) e a vitamina riboflavina foram avaliados como potenciais agentes antitumorais. Para este propósito, as linhagens de células leucêmicas HL60 e de câncer prostático PC3 foram tratadas com riboflavina irradiada ou fisetin por 24 horas e seus efeitos sobre vias de transdução de sinais responsáveis pela sobrevivência e morte celular foram avaliados. Os resultados obtidos demonstram que riboflavina e fisetin apresentam expressiva atividade antiproliferativa, induzindo a morte das células tumorais em concentrações na ordem de µM. A investigação do mecanismo molecular da ação citotóxica da riboflavina demonstrou que o tratamento de HL60 e PC3 com a vitamina irradiada induz morte celular através da via extrínseca de indução de apoptose, mediada pela ativação do sistema Fas/FasL e aumento na síntese de ceramida. Como conseqüência da ativação do receptor de morte Fas, uma seqüência ordenada de eventos leva à modulação de cascatas de sinalização através da alteração da atividade/expressão de moléculas-chave associadas a proliferação, sobrevivência, migração e morte celular. Assim como a riboflavina, fisetin também mostra-se eficiente indutor de morte por apoptose em células HL60, modulando cascatas de proteínas quinases e fosfatases e levando a alterações na expressão de NF?B, atividade de MAPKs, níveis de fosfoproteínas e, também, à inibição de enzimas envolvidas na manutenção do estado redox. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para um maior conhecimento sobre a atividade/função biológica de algumas moléculas envolvidas na sobrevivência e morte de células leucêmicas e prostáticas, sugerindo potenciais alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no combate a doenças neoplásicas. Além disso, os resultados obtidos demonstram que a riboflavina irradiada e fisetin são potentes indutores de apoptose e promissores agentes antitumorais, capazes de modular importantes vias de sinalização intracelular através de ação específica sobre moléculas-chaves relacionadas a proliferação, resistência e invasividade de células tumorais / Abstract: Natural products have been providing numerous clinically used medicines and remain as essential components in the search for new drugs against various pharmacological targets including cancer, HIV/AIDS, Alzheimer¿s, malaria, and pain. Drug discovery from natural products, especially from medicinal plants, has played an important role in the chemoprevention and treatment of cancer and, off all available anticancer drugs between 1940 and 2002, about 40% were natural products per se or natural product-derived, with another 8% considered natural product mimics. In the present work, the plant flavonoid fisetin and the vitamin riboflavin are evaluated as potential anticancer agents. For this purpose, the leukemic cell line HL60 and the human prostate cancer cell PC3 were treated for 24h with irradiated riboflavin or fisetin and their effects on signal transduction pathways related to the cell survival and proliferation were evaluated. The results obtained demonstrated that riboflavin and fisetin have strong anti-proliferative activity, inducing tumoral cell death at µM concentrations. The investigation of the molecular death mechanism triggered by riboflavin demonstrated that the treatment of HL60 and PC3 with the irradiated vitamin induces apoptotic cell death through induction of the extrinsic pathway mediated by the activation of Fas/FasL system via a ceramide-dependent pathway. As a consequence of the activation of the death receptor Fas, an orderly sequence of signaling events leads to the modulation of signaling cascades through alterations in the activity/expression of key targets molecules related to proliferation, survival, migration and cell death. As well as riboflavin, fisetin also showed strong apoptotic activity, inducing HL60 cell death through modulation of protein kinase and phosphatase signaling cascades, leading to alterations in the NF?B expression, MAPKs activities, phosphoprotein levels and also inhibition of enzymes involved in the redox status maintenance. The results obtained in this work bring out information about the biologic activity of some molecules involved in the survival and death of leukemic and prostate cancer cells, indicating among then potential targets for the development of rational therapeutic strategies. Moreover, the data obtained demonstrated that irradiated riboflavin and fisetin have potential proapoptotic activity, pointing out these bioactive compounds as promising antitumoral agents, since they can affect important molecular targets related to proliferation, resistance and invasibility of cancer cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carmen Verissima Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:16:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ChavesNeto_AntonioHernandes_D.pdf: 8240508 bytes, checksum: 293949f75ca619cdc0fa61d29d1703ba (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Riboflavina (Rb - Vitamina B2) é o precursor das flavocoenzimas essenciais flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD). Estas coenzimas participam de processos enzimáticos dependentes das reações de transferências de elétrons, que ocorrem nas vias de produção de energia, biossíntese, desintoxicação e sequestro de elétrons. O aumento dietético da riboflavina e piridoxina foi associado com maiores densidades minerais em mulheres e homens idosos. Fotoderivados da riboflavina demonstraram efeitos citotóxicos em células cancerosas de próstata e leucemias, entretanto, o efeito direto da Rb e seus fotoderivados em osteoblastos não foram examinados. Neste trabalho os efeitos biológicos da Rb e riboflavina irradiada (IRb) foram investigados na linhagem de pré-osteoblastos MC3T3-E1, um modelo bem aceito de osteogênese in vitro caracterizado pela indução de genes específicos associados com o fenótipo osteoblástico quando tratados com ácido ascórbico e ß-glicerofosfato. A viabilidade celular foi avaliada através da redução do MTT, da incorporação do corante vermelho neutro e do conteúdo de ácidos nucléicos. Marcadores de diferenciação osteoblástica foram analisados através do RT-PCR semi-quantitativo (osteopontina e osteocalcina) e através de análises colorimétricas de atividade da fosfatase alcalina (FAL) e síntese de colágeno pela coloração de picrosirius. As atividades das metaloproteinases (MMP) -9 e -2 foram avaliadas pela zimografia de gelatina. Microarranjos de peptídeos com subtratos específicos para quinases e imunoblotting foram usados para identificar os efeitos na sinalização celular. As atividades de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e glutationa S-transferase) foram determinadas em lisados celulares usando métodos espectrofotométricos. As atividades das caspases-8, -9 e -3 foram analisadas através de métodos colorimétricos. Na primeira análise Rb e IRb causaram a parada do ciclo celular na fase G0/G1 e também a inibição da quinase AKT, um mediador da proliferação. Flavinas causaram a diferenciação de pré-osteoblastos, evidenciada pelo aumento da expressão de osteocalcina, osteopontina e BMP-2. Atividades mais elevadas de MMP-9 e MMP-2 também foram observadas. A capacidade das flavinas em engatilhar a diferenciação de osteoblastos foi reforçada pelo aumento da conexina 43, diminuição da caveolina-1 e repressão da sinalização Notch. Na segunda análise, nós encontramos que as interações entre Rb, em sua forma irradiada e não-irradiada, e indutores osteogênicos (ácido ascórbico e ß-glicerofosfato) afetaram significativamente a proliferação de osteoblastos, a atividade de FAL, biossíntese de colágeno, expressão de osteocalcina e osteopontina, a atividade das MMP-2 e MMP-9 e a expressão de fatores osteoclastogênicos (RANKL e osteoprotegerina). Nós também encontramos que os efeitos das flavinas em osteoblastos nesta segunda etapa foram independentes das suas propriedades antioxidantes. A atividade biológica da combinação de indutores osteogênicas com Rb e seus fotoprodutos foi associada com a ativação de diferentes vias de sinalização (AKT, FAK, CaMKII), caspases -8, -9 e -3 e aumento da expressão e/ou estabilização de fatores de transcrição osteoblásticos (Runx2 e ß-catenin). Este estudo nos trouxe fortes evidências que altas concentrações de Rb e IRb geraram um microambiente osteogênico através da modulação de diferentes vias de sinalização, além de promover um efeitos aditivo durante a diferenciação das células pré-osteoblasticas MC3T3 induzida por ácido ascórbico e ß- glicerofosfato. Em resumo, este estudo aponta para uma potencial aplicação da Rb e seus fotoprodutos no desenvolvimento do fenótipo osteoblástico e, consequentemente, uma alternativa terapêutica coadjuvante para osteoporose. / Abstract: Riboflavin (Rb-Vitamin B2) is the precursor of essential flavocoenzymes, flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD). These coenzymes participate in numerous enzymatic processes dependent on electron transfer reactions that occur in energyproducing, biosynthetic, and detoxifying and electron-scavenging pathways. Increase dietary riboflavin and pyridoxine intake has been associated with higher bone mineral density in elderly men and women. Photoderivatives of riboflavin have been shown strong activity in haematological malignancy and prostate cancer cells, however, the direct effect of Rb and its photoderivatives on osteoblast has not been examined. In this work, the biologic effects of Rb and irradiated riboflavin (IRb) were investigated in the MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line, a well-accepted model of osteogenesis in vitro characterized for the induction of specific genes associated with the osteoblastic phenotype when treated with ascorbic acid and ß-glycerophosphate. Cell viability was assessed by MTT reduction, neutral red uptake and nucleic acids content. Osteoblastic differentiation markers were analyzed by semiquantitative RT-PCR (osteopontin and osteocalcin), alkaline phosphatase (ALP) activity measured colorimetrically and collagen synthesis by Sirius red staining. Metalloproteinases (MMP) -9 and -2 activities were assayed by gelatin zymography. Peptide microarray of substrate specificity to kinases and immunoblotting were used to identify the effects on signal transduction pathways. Antioxidant enzyme activities (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione Stransferase) were determined in cellular lysate using spectrophotometric methods. Caspase-8, -9 and -3 activation were measured by a colorimetric assay. In the first analysis Rb and IRb caused cell cycle arrest at G0/G1 phase and accordingly inhibited AKT kinase, a proliferation mediator. Flavins caused differentiation of preosteoblast cells as evidenced by increase of osteocalcin, osteopontin and BMP2 expressions. In addition, higher MMP-9 and -2 activities were observed. Importantly, the capacity of flavins to trigger osteoblasts differentiation was also reinforced by upregulation of connexin 43, down regulation of caveolin-1 and negative modulation of Notch cascade. In the second analysis, we found that the interaction between Rb and IRb and osteogenic inductors (ascorbic acid and ß-glycerophosphate) significantly affected the osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity, collagen biosynthesis, osteopontin and osteocalcin mRNA expression, MMP-2 and MMP-9 activities and the expression of osteoclastogenesis factors (RANKL and OPG). We also showed that the effects of flavins in osteoblasts cells were independent on flavins antioxidant property. The biological activity of the combination of osteogenic medium with riboflavin and its photoderivatives was associated with the activation of different signaling pathways (AKT, FAK, CaMKII), caspases -8, -9 and -3, and up-regulation and/or stabilization of osteoblastic transcription factors (Runx2 and ß-catenin). This study brought out strong evidences that high concentration of Rb and IRb generates an osteogenic microenvironment through modulating different mediators of signaling pathways, besides of the additive effect of riboflavin and its photoproducts during the ascorbate and ß-glycerophosphateinduced osteoblast differentiation of MC3T3-E1 cells. In summary, this study pointed out the potential application of Rb and its photoproducts in osteoblasts phenotype development and, consequently, it is possible use as an alternative therapeutic adjuvant of osteoporosis. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Jose Mauro Granjeiro, Maikel Peppelenbosch / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zambuzzi_WillianFernando_D.pdf: 4779822 bytes, checksum: 33696a8be638dbe16ec5d944f0e3b0d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este trabalho teve como principal objetivo investigar os mecanismos de transdução de sinal disparados durante a diferenciação de células ósseas. Desta forma, vários aspectos moleculares desse processo foram analisados. A modulação da Src kinase pela proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular (LMWPTP) é essencial para a diferenciação dos pré-osteoblastos induzida pelo ácido ascórbico/glicerofosfato. Outro enfoque dado nesse trabalho foi a avaliação, sob o aspecto molecular e morfológico, da diferenciação de pré-osteoblastos em ¿osteocyte-like cells¿, processo esse induzido quando o Matrigel foi utilizado como substrato. De forma inédita demonstramos que nessa condição as células produziram a proteína sonic hedgehog (Shh), a qual também foi essencial para o processo de diferenciação. A análise do perfil quinômico dessas células apontou uma prevalência das quinases envolvidas com a comunicação celular. Este fato é coerente com a super-expressão de conexina 43 observada. Além disso, observamos que RECK e TIMP-1 modulam a atividade do rearranjo da matriz extracelular durante a diferenciação de osteoblastos, bem como o requerimento das proteínas PP2A e p38 MAPK durante a adesão de osteoblastos. Adicionalmente observamos uma modulação refinada das PTPs (LMWPTP, SHP2 e PTPa) bem como do status redox celular. Os resultados em conjunto demonstram que o estudo de transdução de sinal pode fornecer informações importantes para o entendimento do funcionamento celular bem como definir alvos moleculares que podem servir como ferramentas para diferentes aplicações / Abstract: The main goal of this work was to investigate the signal transduction pathways triggered during the bone cells differentiation. In this way, several molecular aspects of this process were analyzed. Src kinase modulation by the low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMWPTP) was essential for the occurrence of the differentiation induced by ascorbic acid and glycerophosphate. We also evaluated, under molecular and morphological patterns, the differentiation of pre-osteoblasts into osteocyte-like cells induced by 3D scaffold (matrigel as substrate). Interestingly, under this condition, the cells produced sonic hedgehog (Shh), which also was essential for stimulating the differentiation signaling pathway. Kinomic profiling of these cells revealed a prevalence of kinases involved in cellular communication, which is in agreement with the overexpression of connexin 43 observed. Besides we observed that RECK and TIMP-1 modulated the extracellular matrix rearrangement and that PP2A and p38 MAPK are required for osteoblasts adhesion. In addition, we observed that during pre-osteoblasts differentiation both PTPs and cellular redox are tightly regulated. Our findings demonstrated that the signal transduction evaluation can provide important information for understanding the cell biology as well as defining molecular targets that can be useful for different applications / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Certos ambientes subterrâneos da Terra possuem acumulados, naturalmente, compostos de radionuclídeos de longa vida, como 238U, 232Th 40K, próximo à presença de água líquida. O mesmo é esperado que aconteça em corpos planetários, no Sistema Solar, que possua quantidades apreciáveis de água. Nestes ambientes radioativos naturais, a radiólise da água produz espécies químicas e desequilíbrios químicos importantes para a vida. Apesar da proposta do decaimento radioativo como fonte alternativa de energia para sistemas vivos existir há mais de trinta anos, isto se mostrou realmente concreto após descoberta de um ecossistema peculiar cuja sobrevivência é dependente de espécies químicas produzidas por radiólise aquosa. Neste trabalho, avaliamos e quantificamos os desequilíbrios químicos gerados localmente pela radiólise aquosa e a possível contribuição destes para a emergência da vida, tendo como referência os estudos em ambientes de fontes hidrotermais alcalinas, consideradas promissores ambientes para esse evento. Também foram avaliados seus efeitos na habitabilidade de possíveis ambientes análogos na lua gelada Europa. Procuramos quantificar a diversidade química formada nessas condições e a associar aos desequilíbrios parâmetros termodinâmicos. As estimativas realizadas para ambientes radioativos na Terra primitiva apontaram para a similaridade entre o desequilíbrio causado por radiólise aquosa e o encontrado em fontes hidrotermais alcalinas. Confirmando e detalhando a análise preliminar que motivou o trabalho. Não obstante, considerando Europa, chegamos a valores de densidade de células do extremófilo Candidatus Desulforudis audaxviator que sobreviveriam em um conjunto de candidatos a análogos geológicos de possível ambiente radioativo na lua gelada. A partir deste estudo pudemos analisar o potencial para a emergência da vida e de protometabolismos nestes ambientes radioativos naturais na Terra primitiva, bem como levantar parâmetros mensuráveis para futuras missões espaciais que buscam vida ou habitabilidade em Europa. / Certain subterranean environments of the Earth has naturally accumulated compounds of longlived radionuclides, such as 238U, 232Th 40K, near the presence of liquid water. The same is estimated in wet planetary bodies in the Solar System. In these natural radioactive environments, water radiolysis produces chemical species and chemical disequilibria, which are important for life. Although the proposal of radioactive decay as an alternative source of energy for deep biospheres has existed for more than thirty years, this proved to be really feasible after the discovery of a peculiar ecosystem whose survivor is dependent on chemical species produced by water radiolysis. In this work, we evaluate and quantify the chemical disequilibria generated locally by water radiolysis and the possible contribution of these to the emergence of life, having as reference the studies alkaline hydrothermal vents, which is considered highly promising environment for this event. It is also evaluated their effects on the habitability of possible analogous environments on the Jupiter icy moon Europa. It was aimed to quantify the chemical diversity formed under these conditions and to calculate disequilibria using thermodynamic parameters. The estimates made for natural radioactive environments in early Earth pointed to the similarity between the disequilibrium caused by water radiolysis and those found in alkaline hydrothermal vents. What confirms and details the preliminary analysis that motivated this work. In addition, it was calculated values for cell density of the Candidatus Desulforudis audaxviator extremophile, that would survive in Europa comparable to the in situ analysis of some terrestrial radioactive environments, using a set of possible scenarios for possible local natural radioactive environments. From this study, we were able to analyze the potential for the emergence of life and protometabolisms in these natural radioactive environments in early Earth, as well as to provide measurable parameters for future space missions that seek for life or habitability in Europa.

O parasita da malária Plasmodium falciparum percebe o ambiente em que se encontra, elaborando respostas celulares adequadas, que envolvem secreção de proteínas, crescimento e diferenciação celular. Fatores relacionados com a geração de segundos-mensageiros e proteínas efetoras da sinalização celular estão descritos na literatura. Porém, a função de receptores responsáveis pela percepção de estímulos extracelulares no parasita é um tema pouco explorado. A identificação in silico de receptores de sete domínios transmembrânicos putativos no genoma de P. falciparum possibilitou a exploração da função dos mesmos. A tese caracteriza funcionalmente dois receptores, PFSR10 e PFSR25. A expressão proteica dos receptores foi demonstrada em fases eritrocíticas de P. falciparum. Os receptores possuem candidatos a parceiros moleculares que executam diversas funções celulares, entre elas invasão do eritrócito, endocitose e exocitose. Os receptores foram transfectados em células de mamíferos e, através de ensaios de dinâmica de cálcio de high-throughput, sugere-se que PFSR10 codifique um receptor que participa na percepção de ATP extracelular e que PFSR25 codifique um sensor de KCl. O trabalho também sugere que KCl modula cálcio citosólico em P. falciparum e que parasitas nocaute para PFSR25 são incapazes de modular cálcio citosólico em resposta a KCl. / The malaria parasite P. falciparum perceives its milieu and elaborates adequate intracellular responses, that involve protein secretion, growth and cell differentiation. Factors related to second messengers generation and effectors of cell signaling are described in the literature. However, the function of receptors responsible for stimulus perception remains elusive. The in silico identification of putative seven transmembrane receptors in the Plasmodium falciparum genome allowed the exploration of their function. In the thesis, two putative receptors were characterized, PFSR10 and PFSR25. The proteic expression of the receptors was demonstrated in erythrocytic stages of P. falciparum. The receptors have putative interaction partners that participate in cellular functions such as invasion, exocytosis and endocytosis.The receptors were transfected in mammalian cells and, through high-throughput calcium dynamics assays, it is suggested that PFSR10 codes for a receptor that participates in extracellular ATP perception and that PFSR25 codes for a KCl sensor. It is also suggested that KCl modulates cytosolic calcium in response to KCl and that knockout parasites for PFSR25 are incapable of modulating cytosolic calcium in response to KCl.

Orientadores: Patrícia Maria Bergamo Favaro, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T08:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JoaoKleberNovais_M.pdf: 3579832 bytes, checksum: 2f21cc28ac6161522a1ab6a958a04389 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As neoplasias linfoides constituem um grupo heterogêneo de doenças originadas por alterações genéticas das células progenitoras hematopoéticas de origem linfoide, levando à proliferação clonal desordenada de células B ou T, e ao desenvolvimento de leucemias linfoides e linfomas. É notória a participação de diferentes vias de sinalização envolvidas tanto no desenvolvimento como na manutenção das neoplasias hematológicas. A ativação constitutiva da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR é bem descrita na leucemia linfoide aguda de células T (LLA-T) e recentemente identificou-se, em modelos animais, que a atividade da PI3K coopera com o desenvolvimento do linfoma de Burkitt (LB). Deste modo, o papel da via PI3K/AKT/mTOR no crescimento e sobrevivência celular, duas características importantes da leucemogênese, transformou-a em um potencial alvo farmacológico. Seguindo essa perspectiva, o presente trabalho procurou avaliar o potencial terapêutico de NVP-BKM120, um pan-inibidor de PI3K de classe I, em linhagens celulares de LLA-T (Jurkat e MOLT-4) e LB (Daudi e NAMALWA). NVP-BKM120 foi capaz de diminuir a viabilidade celular e capacidade clonogênica dessas células. Foi observada uma parada na fase G2/M do ciclo celular, com subsequente diminuição de Ciclina B1 e aumento da apoptose pelas vias intrínseca e extrínseca, nas linhagens Jurkat, MOLT-4 e NAMALWA. Também foi observada diminuição da fosforilação da AKT e dos alvos downstream ao mTORC1, P70S6K e 4EBP1, e aumento da razão BAX:BCL2. Houve um aumento da produção de AVOs nas linhagens celulares após o tratamento com a droga, o que sugere ativação da autofagia. Portanto, este estudo demonstra a capacidade antitumoral de NVP-BKM120 contra linhagens celulares de LLA-T e LB. Nossos resultados sugerem que a diminuição da proliferação celular, após o tratamento com a droga, seja devido à redução da Ciclina B1 e que o aumento da razão BAX:BCL2 seja um dos mecanismos envolvidos na indução da apoptose / Abstract: The lymphoid neoplasms are a heterogeneous group of diseases caused by genetic alterations that were originated from hematopoietic progenitor cells of lymphoid origin, leading to uncontrolled clonal proliferation of B or T cells, and to the development of lymphoid leukemias and lymphomas. These findings emphasize the involvement of different signaling pathways involved in both the development and the maintenance of hematological malignancies. Constitutive activation of the PI3K /AKT/mTOR signaling pathway is well described for acute lymphoblastic leukemia T cells (T-ALL), recently been identified in animal models, that the activity of PI3K cooperates with the development of Burkitt's lymphoma (LB).Thus, the role of the PI3K / AKT / mTOR pathway in cell growth and survival, two important features of leukemogenesis, morphed into a potential drug target. Following this perspective, the present study aimed to evaluate the therapeutic potential of NVP-BKM120, a pan-PI3K inhibitor class I in cell lines of T-ALL (Jurkat and MOLT-4) and LB (Daudi and NAMALWA). NVP-BKM120 was able to decrease cell viability and clonogenic capacity of these cells. A blocked phase was observed in G2/M phase of the cell cycle with subsequent reduction of Cyclin B1 and increased apoptosis by the intrinsic and extrinsic pathways in the lines Jurkat and MOLT-4 NAMALWA. It was also observed, decreased phosphorylation of AKT and of the downstream targets mTORC1, p70S6K and 4EBP1, and an increase of BAX:BCL2 ratio. There was an increase in AVOs production in the cell lines after treatment with the drug, suggesting activation of autophagy. Therefore, this study demonstrates the antitumor ability of NVP-BKM120 against cell lines of T-ALL and LB. Our results suggest that the decrease in cell proliferation after treatment with the drug, is due to the reduction of Cyclin B1 and the increase of the BAX:BCL2 ratio is one of the mechanisms that are involved in the induction of apoptosis / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências

Orientador: Giselle Zenker Justo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RodrigoAugustoda_D.pdf: 6436030 bytes, checksum: 9f8fa7c9b01f00bc5d2d2396d4099a1e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A epiderme é constantemente confrontada por inúmeros agentes estressores. Variações na umidade ou exposição à radiação ultravioleta afetam o balanço osmótico e o estado redox celular alterando, assim, as características fisiológicas da pele. Em resposta aos diferentes estímulos os queratinócitos ativam vias distintas de sinalização. Portanto, o balanço entre as vias de sobrevivência e morte determina o destino celular. A fim de se determinar possíveis alvos moleculares associados a morte e sobrevivência de queratinócitos, vias de sinalização celular disparadas pela exposição ao choque hiperosmótico e estresse oxidativo foram investigadas em células HaCaT tratadas com sorbitol e peróxido de hidrogênio (H2O2) respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que, em ambos os modelos, a redução da viabilidade celular dependeu da dose e do tempo de exposição ao agente extressor, apresentando valores de IC50 de aproximadamente 1 mol/L de sorbitol e 2 mmol/L de H2O2 após 2 e 4 h de exposição respectivamente. Os danos causados foram irreversíveis e estão associados à ativação da via intrínseca de morte celular apoptótica, acompanhada de perda da integridade da membrana lisossomal, extravasamento de catepsina B para o citosol e alterações morfológicas atípicas no citoesqueleto, principalmente no arranjo dos filamentos de actina. A investigação do status de funcionamento de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) e do estado redox celular indicou que esses eventos foram mediados por espécies reativas de oxigênio e pela ação da quinase c-Jun N-terminal (JNK). Adicionalmente, a exposição dos queratinócitos aos diferentes estímulos estressores foi acompanhada de ativação da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular (LMWPTP), cuja relevância nos estudos de biologia celular aumentou nos últimos anos. A LMWPTP atua em importantes vias de sinalização que estão associadas à sobrevivência e morte celular. Cientificamente, este estudo é pioneiro ao demonstrar alterações no citoesqueleto e ação de proteínas quinases e fosfatases nos mecanismos que determinam o destino de queratinócitos expostos ao choque hiperosmótico e ao estresse oxidativo. De fato, o melhor conhecimento da relação entre as vias de sobrevivência e morte celular em queratinócitos é fundamental para promover o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas aplicadas às doenças dermatológicas. Desta maneira, o presente trabalho apresenta resultados inéditos, contribuindo no conhecimento da biologia dos queratinócitos e com sua aplicação no desenvolvimento da terapia dermatológica / Abstract: The epidermis is constantly confronted with multiple environmental stressors. Changes in humidity or exposition to UV radiation affect the redox state and osmotic balance, modifying the physiological characteristics of the skin. In response to different stresses, epidermal keratinocytes can activate distinct signaling pathways and the balance between death and life signals will determine the cell fate, leading to programmed cell death or cell survival. In order to determine the possible molecular targets associated to death and survival of keratinocytes, the signaling pathways activated by the exposition of HaCaT cells to sorbitol (hyperosmotic shock) and H2O2 (oxidative stress) were investigated. The results showed that in both models the reduction in cellular viability was time and dose-dependent, displaying IC50 values of 1 mol/L for sorbitol and 2 mmol/L for H2O2 after 2 and 4 h of exposition to the stressors, respectively. The damages caused by the stressors were irreversible and associated to the induction of the intrinsic apoptotic pathway, accompanied by the loss of lisosomal membrane integrity, release of cathepsin B to cytosol and atypical morphological alterations in cytoskeleton, particularly in the arrangement of actin filaments. Analysis of the functional status of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and the cellular redox state showed that such events were mediated by reactive oxygen species and occurred through c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation. Additionally, exposure of keratinocytes to the different stress inducers was followed by low molecular weight tyrosine protein phosphatase (LMWPTP) activation, which is responsible for the regulation of important signaling pathways associated to cell survival and death. It is important to highlight the novelty of these results showing alterations in the cytoskeleton and the action of protein kinases and phosphatases during exposure of keratinocytes to hyperosmotic and oxidative stresses. In fact, the development of more efficacious therapies against skin diseases depends on the establishment of the relationships between the survival and death signaling pathways in keratinocytes. In this direction, this work contributes to a better understanding of the keratinocyte biology and the improvement of traditional dermatological therapies / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: João Agostinho Machado Neto, Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T20:37:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachadoNeto_JoaoAgostinho_D.pdf: 13204649 bytes, checksum: a00ab26c9097cb10817c14fe2bdb2356 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A identificação de genes/proteínas diferencialmente expressos em neoplasias hematológicas e a investigação funcional destas proteínas no fenótipo neoplásico são essenciais para o entendimento da biologia da doença. ANKHD1 é altamente expressa em células de leucemia aguda e tem potencial para regular vários processos celulares através de seus domínios de repetição de anquirina. Nosso grupo de pesquisa havia previamente identificado a interação entre ANKHD1 e SIVA através de ensaio de duplo híbrido. Outras proteínas potencialmente relacionadas à ANKHD1 que foram de interesse deste trabalho foram a Stathmin 1 que interage com SIVA e a YAP1 que interage com ANKHD1 em células não hematológicas. O objetivo principal do presente trabalho foi investigar a participação funcional de ANKHD1 e proteínas relacionadas em neoplasias hematológicas. Utilizamos modelos de linhagens leucêmicas humanas e células hematopoéticas primárias provenientes de indivíduos normais (n=52) e de pacientes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica (SMD; n=65), neoplasia mieloproliferativa (NMP; n=82), leucemia mieloide aguda (LMA; n=60) e leucemia linfoide aguda (LLA; n=19). Técnicas para avaliação de expressão gênica (qPCR), expressão e interação proteica (western blotting), ensaios funcionais de migração (ensaio transwell), proliferação (MTT e clonogenicidade in vitro, formação de tumor in vivo) e apoptose (Anexina V/IP, TUNEL), e inibição de proteínas de interesse através do uso de inibidores farmacológicos ou ferramentas de terapia gênica foram utilizados. A interação entre ANKHD1 e SIVA foi confirmada por ensaios de coimunoprecipitação. Em linhagens celulares leucêmicas U937 e Jurkat, o silenciamento de ANKHD1 reduziu a proliferação celular, migração e o crescimento tumoral, enquanto que a inibição de SIVA aumentou a migração e o crescimento tumoral e reduziu a sensibilidade à apoptose induzida por radiação UV de células U937. A inibição de ANKHD1 reduziu a atividade de Stathmin 1 e a interação entre SIVA/Stathmin 1. Grande parte das linhagens leucêmicas e amostras primárias de pacientes com neoplasias hematológicas não apresentou a expressão de YAP1, e o silenciamento de ANKHD1 não modulou a atividade de YAP1 em células U937. A expressão de Stathmin 1 foi significativamente elevada em amostras de células hematopoéticas de pacientes com neoplasisa hematológicas (SMD AREB-1/AREB-2, LMA, LLA e mielofibrose primária) quando comparada às amostras de doadores saudáveis. O silenciamento de Stathmin 1 reduziu a proliferação celular e clonogenicidade em células leucêmicas U937, Namalwa e células HEL JAK2V617F. Especificamente em células HEL JAK2V617F, a inibição de Stathmin 1 ou o tratamento com o agente estabilizador de microtúbulos paclitaxel teve um efeito potencializador ao tratamento com ruxolitinib, inibidor de JAK1/2, na indução de apoptose. Em conclusão, propomos que a ANKHD1 participa do fenótipo neoplásico de células leucêmicas através de sua interação com SIVA, inibição de SIVA e ativação de Stathmin 1. Os nossos resultados indicam que a função de ANKHD1 na leucemogênese independe de sua interação com YAP1. Em células humanas com ativação constitutiva da via JAK2/STAT, identificamos a relevância funcional da participação de Stathmin 1 no fenótipo neoplásico / Abstract: The identification of genes/proteins differentially expressed in hematopoietic neoplasms and the functional investigation of these proteins in the neoplastic phenotype are essential for the understanding of disease biology. ANKHD1 is highly expressed in acute leukemia cells and has a potential role in regulating many cellular processes through its ankyrin repeat domains. Our research group has previously identified the interaction between ANKHD1 and SIVA through two-hybrid assay. Other proteins potentially related to ANKHD1 that were of interest of this research are Stathmin 1 that interacts with SIVA, and YAP1 that interacts with ANKHD1 in non hematologic cells. The aim of this study was to investigate the functional role of ANKHD1 and its related-proteins in hematologic malignancies. We used human leukemia cell lines and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=52) and patients with myelodysplastic syndromes (MDS; n=65), myeloproliferative neoplasms (MPN; n=82), acute myeloid leukemia (AML; n=60) and acute lymphoid leukemia (ALL; n=19). Techniques for the evaluation of gene expression (qPCR), protein expression and interaction (western blotting), functional assays of migration (transwell assay), proliferation (in vitro MTT and clonogenicity, in vivo tumor formation) and apoptosis (Annexin V/PI, TUNEL), and inhibition of proteins of interest through pharmacologic agents or gene therapy tools were used. The interaction between ANKHD1 and SIVA was confirmed by co-immunoprecipitation assays. In leukemia cell lines U937 and Jurkat, ANKHD1 silencing reduced cell proliferation, migration and tumor growth, while SIVA inhibition increased migration and tumor growth, and reduced sensitivity to UV-induced apoptosis of U937 cells. Inhibition of ANKHD1 reduced Stathmin 1 activity and the interaction between SIVA/Stathmin 1. A large proportion of leukemia cell lines and primary samples from patients with hematologic malignancies did not present YAP1 expression, and ANKHD1 silencing did not modulate YAP1 activity in U937 cells. Stathmin 1 expression was significantly higher in primary hematopoietic cells from patients with hematological malignancies (MDS RAEB-1/RAEB-2, AML, ALL and primary myelofibrosis) compared to samples from healthy donors. Stathmin 1 silencing reduced cell proliferation and clonogenicity of U937 and Namalwa leukemia cells, and HEL JAK2V617F cells. Specifically in HEL JAK2V617F cells, Stathmin 1 silencing or treatment with the microtubule-stabilizing agent paclitaxel had a potentiating effect to treatment with the JAK1/2 inhibitor ruxolitinib on apoptosis induction. In conclusion, we propose that ANKHD1 participates in the leukemia phenotype through its interaction with SIVA, SIVA inhibition, and Stathmin 1 activation. Our results indicate that ANKHD1 plays a role in leukemogenesis independently of its interaction with YAP1. In human cells with a constitutive activation of the JAK2/STAT pathway, we identified the relevant role of Stathmin 1 in the malignant phenotype / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

A raiva é uma antropozoonose e causa a morte de 55 mil pessoas anualmente no mundo. Neste trabalho foi utilizado um sistema genético derivado do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) carregando RNA para expressão gênica da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) e da proteína verde fluorescente (GFP), a título de controle do experimento. Lotes de partículas virais de SFV-RVGP e SFV-GFP foram obtidos em células BHK-21 e quantificados através de qRT-PCR. Foram realizados ensaios de infecção tanto com vírus ativado e não ativado em duas linhagens de macrófagos murinos IC-21 e J774A-1. A expressão da proteína RVGP foi avaliada pelo teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) e a expressão da proteína GFP analisada por Microscopia de Fluorescência e Citometria de Fluxo em ambas as linhagens. A entrada do vírus SFV em células de mamíferos ocorre após 2 horas da infeção e de acordo com o experimento no qual analisamos a titulação viral do sobrenadante celular, indicaram que até as 72 horas pós infecção a titulação viral se manteve com o mesmo valor inicial, sugerindo que não houve entrada dos vírus na célula por transdução ou por fagocitose. / Rabies is a anthropozoonosis and causes the death of 55,000 people worldwide each year. In this work we used a genetic system derived from the Semliki forest virus (SFV) carrying RNA for gene expression of the rabies virus glycoprotein (RVGP) and green fluorescent protein (GFP), by way of experiment control. Plots of viral particles of SFV-RVGP and SFV-GFP were obtained in BHK-21 cells and quantified by qRT-PCR. Infection assays were performed both with activated and not activated in two virus strains of murine macrophages IC-21 and J774A-1. The expression of RVGP protein was assessed by indirect immunofluorescence test (IFI) and the expression of GFP protein analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry in both strains. The SFV entry of viruses into mammalian cells occurs after 2 hours of infection and according to the experiment in which we analyzed the viral titer of the cell supernatant showed that by 72 hours post-infection viral titer remained at the same initial value, suggesting no entry of virus into the cell by transduction or by phagocytosis.