Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La chaîne invariante (Ii ; CD74) est une protéine membranaire de type II qui joue un rôle majeur dans la présentation antigénique. Dans le réticulum endoplasmique (RE), Ii favorise l’assemblage du CMH II et prévient la liaison indésirable de polypeptides. Grâce à son motif di-leucine, la chaîne invariante cible le CMH II dans les endosomes. Une fois dans ces compartiments acides, Ii est dégradé, permettant la liaison de peptides de forte affinité qui seront ensuite présentés aux cellules T CD4+. Chez les souris déficientes en Ii murin (mIi), le CMH II présente une conformation non compacte typique des molécules vides ou liées faiblement à un peptide. Le transport du CMH II est aberrant ce qui conduit à une réduction de son expression en surface ainsi qu’à un défaut de présentation antigénique. De plus, Ii diversifie le répertoire de peptides et assure la sélection thymique des cellules T CD4+. Enfin, il a un rôle dans la maturation des cellules B et les souris déficientes en Ii présentent des nombres réduits de cellules B matures folliculaires (FO). L’isoforme mineure humaine p35 (Iip35) n’existe pas chez la souris et possède une extension cytoplasmique de 16 acides aminés contenant un motif R-x-R de rétention dans le RE. La sortie du RE est conditionnelle à la liaison du CMH II qui permet de masquer le motif de rétention. Iip35 agit comme dominant et impose la rétention aux autres isoformes d’Ii. Cependant, le rôle physiologique du motif R-x-R et, plus globalement, celui d’Iip35, demeurent nébuleux. Pour mieux cerner la fonction d’Iip35, nous avons généré des souris transgéniques (Tg) exprimant l’isoforme humaine Iip35 et avons analysé la conformation et le trafic du CMH II, la sélection thymique et la maturation des cellules B ainsi que la présentation antigénique. Nos résultats ont démontré qu’Iip35 favorise l’assemblage du CMH II dans le RE. Il induit également une conformation compacte du CMH II et augmente l’expression du CMH II en surface. De plus, Iip35 cible le CMH II dans les endosomes où un peptide de forte affinité se lie dans la niche peptidique. Par ailleurs, Iip35 diversifie le répertoire de peptides et rétablit totalement la sélection des cellules T CD4+ ainsi que le niveau d’expression du TCR de ces dernières. Iip35 restaure également la présentation antigénique de l’ovalbumine dont la présentation requiert l’expression d’Ii. Par contre, Iip35 rétablit la présentation des superantigènes mais à un niveau moindre que celui des souris sauvages. Ensuite, Iip35 permet le rétablissement de la sélection des cellules iNKT démontrant qu’il assiste la présentation des lipides par les molécules CD1d. Enfin, les résultats ont démontré qu’Iip35 restaure le développement des cellules B matures folliculaires (FO) mais pas celui des cellules B de la zone marginale. Ceci suggère qu’Iip35 est capable d’induire le développement des cellules FO sans stimulation préalable par le MIF (macrophage migration inhibitory factor). Ainsi, l’ensemble de ces résultats démontre qu’Iip35 est fonctionnel et assure la majorité des fonctions d’Ii. Cependant, Iip35 ne remplace pas mIi endogène concernant la maturation des cellules B MZ suggérant qu’il pourrait avoir un rôle de régulateur. / The invariant chain (Ii; CD74) is a type II membrane protein which plays a key role in antigen presentation as well as acting as a receptor for the cytokine MIF (macrophage migration inhibitory factor). In the endoplasmic reticulum (ER), Ii assists the folding of MHC II and prevents the loading of nascent polypeptides in the peptide-binding groove. Di-leucine-like motifs contained in the Ii cytoplasmic tail target the MHC II-Ii complexes in the endocytic pathway. Once in low pH-endosomes, Ii is degraded allowing the binding of a high affinity peptide which is then presented on cell surface to CD4+ T cells. In Ii deficient mice, MHC II displays a “floppy” conformation typical of empty molecules or is loosely bound with peptides. The transport is aberrant leading to decreased surface expression of MHC II and defective antigenic presentation. Also, the lack of Ii restricts the peptide repertoire and impairs thymic selection of CD4+ T cells. Moreover, Ii regulates B cells maturation and Ii deficient mice display reduced numbers of mature follicular B cells (FO). The human minor p35 isoform (Iip35) does not exist in mice and displays a 16 amino acids N-terminal cytoplasmic extension containing a di-arginine (R-x-R) motif causing ER retention and acting as dominant in heterotrimeric complexes with Iip33. Upon binding to MHC II, the retention motif is masked, which allows the complexes to egress from the ER. The physiological role of the R-x-R motif is poorly understood. To shed light on Iip35 function, we generated transgenic mice expressing Iip35 and analyzed the conformation and traffic of MHC II, the thymic selection and the development of B cells as well as the antigenic presentation. Our results showed that Iip35 generates an MHC II in the right conformation and increases MHC II surface expression. Also, Iip35 targets MHC II into endosomes where high affinity peptides bind to the groove. We also showed that Iip35 diversifies the peptide repertoire and fully restores thymic selection of CD4+ T cells as well as the TCR levels on these cells. Then, Iip35 ensures presentation of the Ii-dependent antigen ovalbumin but does not totally rescue the presentation of superantigens. Interestingly, thymic selection of the iNKT cells is fully restored showing that Iip35 assists with lipids presentation by CD1d. Finally, Iip35 allows B cells to develope into FO B cells but does not support marginal zone (MZ) B cells maturation. This result suggests that MIF stimulation is not a prerequisite for FO B cells development. Altogether, these results showed that Iip35 is functional and has most of the CD74 functions. However, it cannot replace the endogenous Ii regarding the MZ B cells maturation suggesting that Iip35 could have regulatory functions by modulating the development of some cells.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les ganglions de la base (GB) sont un ensemble de structures sous-corticales interconnectées impliquées dans l'apprentissage et le contrôle moteur mais aussi dans des processus motivationnels. Le fonctionnement des GB est fortement dépendant de l'équilibre d'activité entre les voies directe (striatonigrale) et indirecte (striatopallidale) par lesquelles le striatum, la principale structure d'entrée du réseau, contrôle les structures de sortie. L'objectif de ce travail était de développer et caractériser un modèle d'ablation sélective des neurones de la voie directe pour appréhender leur rôle dans les comportements impliquant les GB. Ce modèle repose sur l'expression, par transgénèse additive, du récepteur humain à la toxine diphtérique (DT) couplé à la GFP sous le contrôle du promoteur du gène slc35d3 exprimé dans les neurones striatonigraux et pas dans les striatopallidaux. La caractérisation cellulaire a été réalisée 15 jours après injection unilatérale de DT dans le striatum dorsal. La spécificité de l'atteinte est vérifiée par la diminution sélective (70%) de l'expression génique du précurseur de la substance P, marqueur de la voie directe, sans changement de celle du précurseur des enképhalines, marqueur de la voie indirecte. Les populations d'interneurones sont préservées à l'exception des interneurones cholinergiques dont le nombre est réduit de 50%. Un faisceau d'arguments démontre que cette baisse ne serait pas due à un effet direct de la DT sur les interneurones cholinergiques mais serait secondaire à la perte des neurones striatonigraux, mettant en évidence un lien étroit entre ces deux populations. / The basal ganglia (BG) are a set of subcortical structures implicated in motor learning and motor function as well as in motivational processes. BG functioning is thought to be highly dependent on the balanced activity between the direct (striatonigral) and indirect (striatopallidal) pathways by which the striatum, the main input station of the network, controls the output structures. This study aimed at developing and characterizing a model of selective ablation of the direct pathway to decipher its specific role in BG-related functions and disorders. The promoter of the slc35d3 gene, which is enriched in the striatonigral neurons, has been used to drive expression of the human diphtheria toxin (DT) receptor coupled to GFP selectively in these neurons by additive transgenesis. The cellular characterization has been performed 15 days after unilateral DT injection in the dorsal striatum. The ablation specificity is demonstrated by the selective decrease (70%) in substance P precursor mRNA levels, a marker of the direct pathway, with no change in enkephalin precursor gene expression, a marker of the indirect pathway. Striatal interneuron populations are spared, except the cholinergic population, which is reduced by about 50%. Evidence is provided that this loss may not be a direct effect of DT but a consequence of striatonigral neuron loss, revealing their crucial role for cholinergic interneuron viability. Then, we analyzed the functional consequences of the bilateral lesion of the striatonigral pathway (50-60% neuronal loss) either in the dorsal striatum or in the nucleus accumbens (NAc).

No description available.

La progression tumorale est un processus multi-étapes dépendant notamment des interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma environnant. Le développement du cancer du sein implique une communication étroite entre les cellules épithéliales mammaires, les cellules inflammatoires, les myofibroblastes et les cellules endothéliales. Ainsi, le microenvironnement tumoral apparaît comme une cible de choix dans le traitement anti-tumoral. L’utilisation de modèles précliniques est une étape clé dans le développement et la validation de nouvelles thérapies. Néanmoins, peu d’études sont disponibles sur le rôle du stroma péri-tumoral dans ces modèles.Dans le but d’étudier le stroma péri-tumoral des modèles précliniques de cancers du sein, nous avons combiné une analyse par cytométrie en flux à une analyse par immunohistochimie afin d’identifier, puis de quantifier, les différentes populations stromales hématopoïétiques (lymphocytes, monocytes/macrophages, polynucléaires) et non hématopoïétiques (myofibroblastes, cellules endothéliales). Vingt et un modèles de xénogreffe de tumeurs humaines de cancers du sein ainsi que 2 modèles transgéniques (MMTV-PyMT et MMTV-ErbB2), ainsi que leurs allogreffes respectives, furent utilisés lors de ce travail.Les analyses des tumeurs humaines et murines ont montré un infiltrat stromal très hétérogène d’une tumeur à l’autre, avec pour composante majoritaire les macrophages. Un infiltrat important en polynucléaires a également été détecté dans les modèles de PDX, caractéristique d’une inflammation locale importante dans ces modèles. L’analyse phénotypique de macrophages a montré une expression variable de marqueurs M1 et M2 dans les modèles de PDX. Les macrophages issus de tumeurs murines transgéniques, spontanées ou allogreffées, présentaient quant à eux un profil majoritairement M1. L’étude transcriptomique de macrophages triés, a permis à la fois de valider les résultats obtenus au niveau protéique mais a également mis en évidence des différences majeures dans l’expression de nombreux gènes, impliqués dans des voies de signalisation variées telles que la croissance tumorale, l’invasion et la métastase.Cette étude nous a permis de mettre en évidence le rôle de la tumeur sur son microenvironnement. En effet, celle-ci est à la fois capable d’attirer un panel de cellules stromales qui lui et propre et ensuite de l’activer de façon spécifique. / Tumor development is a multi-step process influencing by interactions between tumor cells and surrounding stroma. Breast cancer development involves a high level of communication between mammary epithelial cells, inflammatory cells, myofibroblasts and endothelial cells. So, the tumoral microenvironment appears as a prime target for anti-tumoral treatment. The use of preclinical models is a critical step in development and validation processes of new therapies. Nevertheless, the role of stroma in these models is poorly understood.In order to evaluate stromal cell populations in breast cancer preclinical models, we combined flow cytometry analysis and immunohistochemistry to identify, and then quantify, various stromal populations as hematopoietic cells (lymphocytes, monocytes/macrophages, polymorphonuclear leukocytes) and non-hematopoietic cells (myofibroblasts, endothelial cells). Twenty-one breast cancer patient-derived xenografts as well as 2 transgenic mouse models (MMTV-PyMT and MMTV-ErbB2), and their respective allografts, were studied.Analysis of human and murine tumors showed a strong heterogeneity between tumors regarding infiltrating stroma-cells, with a high proportion of macrophages. A significant amount of polymorphonuclear leukocytes was also detected in PDXs, indicating a local inflammation in these models. The phenotypic analysis of macrophages showed a variable expression of M1 and M2 markers in PDXs. Macrophages infiltrating transgenic mouse tumors, spontaneous or allografted, were mainly M1. Transcriptomic analyses of sorted macrophages, allowed us to validate previous results but also highlighted major differences in the expression of numerous genes implicated in various pathways as tumor growth, invasion and metastasis.Finally, this study highlighted the impact of tumor cells on their surrounding stroma. Indeed, we demonstrate that cancer cells are able to attract a specific panel of stromal cells and activate them in a specific way.

Différentes stratégies associant des cellules médullaires et/ou des biomatériaux ont été étudiées pour la réparation du tissu osseux dans des modèles murins. Nous avons montré que H2O2 et NaOH, produits utilisés dans les procédés de purification industriels de greffons osseux allogéniques, induisent une détérioration matricielle de surface, diminuant l'adhésion, la prolifération et l'activité de cellules ostéoblastiques. NaHCO3 est apparu comme un agent nettoyant efficace, sans conséquences sur la qualité des greffons et leur cytocompatibilité. Des matrices osseuses ainsi purifiées ont été utilisées comme support pour la réparation par ingénierie tissulaire d'un défaut crânien de taille critique chez la souris. La construction cellules médullaires/matrice, élaborée in vitro, a induit in vivo une régénération osseuse rapide jusqu'au centre du déficit. L'induction de la différenciation ostéoblastique des cellules avant leur implantation n'a pas amélioré nos résultats. Une autre thérapie cellulaire ayant été étudiée est la transplantation systémique de cellules médullaires. L'irradiation corporelle totale et la transplantation ont induit une perte osseuse trabéculaire dramatique. Les cellules transplantées n'ont pas permis la restauration de la masse osseuse mais ont reconstitué un microenvironnement ayant modifié la microarchitecture des receveurs vers un phénotype donneur. Pour ces deux dernières études les cellules médullaires sont issues de souris transgéniques pour la GFP, permettant le suivi des cellules après implantation. L'immunodéplétion des cellules médullaires possédant le CD11b a permis d'enrichir fortement la population cellulaire en ostéoprogéniteurs.

La régulation de l'adressage dendritique de la tyrosine hydroxylase (TH), l'enzyme limitante de la biosynthèse des catécholamines, permettrait de moduler avec précision l'étendue du territoire cérébral soumis à l'influence catécholaminergique et ainsi de moduler de nombreuses fonctions neurovégétatives et centrales. Ce type de régulation a notamment été observé au niveau des neurones catécholaminergiques du noyau du faisceau solitaire (NTS) et du locus coeruleus (LC), sans pour autant que les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués n'aient été élucidés in vivo. Nous avons recherché si les angiotensines cérébrales pouvaient être potentiellement impliquées dans cette régulation, en utilisant le modèle du rat TGR(ASrAOGEN)680 (TGR), caractérisé par une inhibition de la synthèse du seul précurseur connu des angiotensines cérébrales, l'angiotensinogène astrocytaire. Nous avons mis en évidence une très forte diminution de la quantité de protéine TH dans le NTS et le LC chez ces rats, spécifiquement au cours de la 4ème semaine postnatale. Ce phénomène est notamment caractérisé par une accumulation de la protéine TH dans le corps cellulaire des neurones de ces deux structures et un blocage de son adressage dendritique, alors que le transport vers les aires de terminaisons est maintenu. Le blocage de l'adressage dendritique est associé à l'invalidation du processus de phosphorylation de la protéine MARCKS, voie de signalisation notamment induite par la stimulation du récepteur AT1 aux angiotensines qui avait été clairement impliquée in vitro dans le transport neuritique de la TH. L'étude de la répartition de la TH dans les aires de terminaison du LC à l'âge adulte a permis de montrer l'existence d'une hyper-innervation catécholaminergique du gyrus dentelé et des cortex frontal et cingulaire chez les rats TGR, vraisemblablement impliquée dans les altérations que nous avons observées de l'alternance des cycles d'éveil et de sommeil et de la réactivité à un stress de nouveauté. Ainsi, nos travaux révèlent que les angiotensines cérébrales sont impliquées à 4 semaines dans l'initiation de l'adressage dendritique de la protéine TH dans les neurones noradrénergiques, et de ce fait, dans la mise en place fonctionnelle du rétrocontrôle inhibiteur exercé par la noradrénaline libérée localement par les dendrites de ces neurones

L'extinction post-transcriptionnelle de gènes ou PTGS (Posttranscriptional Gene Silencing) est un phénomène hautement conservé à travers l'évolution. Retrouvé chez des organismes allant des champignons aux vertébrés, ce système reconnaît spécifiquement les molécules de RNA double brin (db) et les dégrade en fragments de 21-23 nt. Chez les plantes, le PTGS pourrait défendre l'organisme contre les infections virales. En réponse à ce mécanisme de défense, un certain nombre de virus codent pour des protéines capables de supprimer le PTGS. Ces protéines dites "suppresseurs" de PTGS, comme les protéines HCPro des potyvirus et 2b des cucumovirus, ne partagent aucune homologie de séquence ni de structure et jouent des rôles différents dans le cycle de multiplication virale. Les résultats obtenus et décrits dans ce mémoire ont permis l'identification et la caractérisation de nouvelles protéines virales impliquées dans la suppression du PTGS, ceci afin de mieux cerner les mécanismes de suppression. Ainsi, nous avons montré que les protéines P15 et P14 de deux virus apparentés, le PCV (Peanut Clump Virus) et le BNYVV (Beet Necrotic Yellow Vein Virus) sont des suppresseurs de PTGS aux propriétés distinctes. En effet, la protéine P15 se localise dans les peroxysomes et semble être active sous une forme multimérique ; quant à la protéine P14, elle se localise dans le cytoplasme et le nucléole et supprime plus faiblement le PTGS. Par ailleurs, nous avons également découvert que la protéine P0 du BWYV (Beet Western Yellows Virus) est un suppresseur de PTGS très efficace hors de son contexte viral. De manière surprenante, son expression est fortement régulée par le virus au cours de l'infection. Enfin, nous avons confirmé que la protéine P0 jouait un rôle de protection du virus contre le PTGS grâce à l'utilisation de plantes transgéniques exprimant la protéine mineure de capside du BWYV. Ce virus déclenche sur ces plantes un PTGS dirigé contre le transgène, sans être affecté.

Relax chez le rat ou Neurogénine 3 (ngn3) chez la souris est un facteur de transcription de la famille basique Hélice Boucle Hélice (bHLH). Le profil d'expression de ce gène au cours du développement embryonnaire indique qu'il pourrait jouer un rôle fondamental dans la détermination du devenir nerveux ou endocrine des précurseurs neuronaux et pancréatiques respectivement. Le premier objectif de mon projet vise à élucider, les mécanismes moléculaires permettant de rendre compte de la mise en place et du contrôle de l'expression tissulaire restreinte du gène ngn3. Cette étude réalisée par transgenèse, a été possible grâce à l'installation au laboratoire d'une plate-forme de transgenèse, qui m'a permis de générer des modèles de souris transgéniques de façon autonome. J'ai donc réalisé différentes constructions permettant d'exprimer le gène β-galactosidase sous le contrôle d'éléments potentiellement « enhancer » du promoteur ngn3. J'ai caractérisé un élément de 3,85kb permettant de diriger l'expression du gène rapporteur exclusivement dans les territoires d'expression du gène endogène ngn3. L'étude de fragment plus restreints se poursuit actuellement mais nous disposons l'un fragment de 2,2kb dirigeant en transgenèse l'expression du gène LacZ dans l'hypothalamus ventral et les épithéliums pancréatiques et intestinaux. Le second objectif de cette thèse est d'obtenir un marquage in vivo, par transfert de gène, de la population des cellules souches du pancréas endocrine exprimant ngn3 dans des explants de pancréas embryonnaires murins puis humains. En effet, nous disposons d'un système in vivo unique capable de récapituler le développement du pancréas endocrine par xénogreffe d'ébauches pancréatiques. Jai démontré, dans ce modèle expérimental, la capacité de lentivirus recombinants à infecter efficacement des cellules progénitrices du pancréas, en ciblant à l'aide de promoteurs spécifiques l'expression du gène rapporteur dans les différentes populations cellulaires qui se sont différenciées. La construction et la production d'un vecteur lentiviral assurant l'expression du gène rapporteur de la GFP (Green Fluorescent protein) sous le contrôle de l'élément de 2,2kb du promoteur du gène ngn3, permet actuellement de transduire des explants de pancréas embryonnaires murins. La transposition de ces modèles à du tissu embryonnaire humain est actuellement validée. Ce travail nous donne accès, chez l'homme, au réservoir des cellules souches du pancréas endocrine. L'amplification et la sélection de telles cellules souches constituent un défi majeur pour le développement de nouvelles thérapies du diabète de type I. La fonction proendocrine de ngn3 étant déjà clairement établie au niveau du pancréas, le troisième objectif consiste à démontrer la fonction de détermination neuronale de ce facteur dans la moelle épinière. Dans le cadre d'une fonction de détermination, l'absence de différenciation d'une population de neurones est attendue suite à l'inactivation du gène ngn3. Nous avons pu démontrer que la mutation nulle ngn3 induit l'expression ectopique du facteur de détermination Mash1 dans la région ventrale de la moelle épinière exprimant normalement ngn3, assurant ainsi, une compensation fonctionnelle. Afin d'appréhender directement la fonction de détermination de ngn3 et cela en absence de compensation, nous avons généré des souris doubles mutant nulles Mash1-Ngn3. L'analyse phénotypique des mutants perte de fonction ngn3 et Mash1/ngn3 dans la moelle épinière ventral nous a permis de démontrer la fonction de ngn3 dans la détermination du devenir neuronal. De plus nous avons, pour la première fois, établi que les neurones matures dont la différenciation est déterminée par ngn3 présentent un phénotype glutamatergique. Mots clés : Ngn3, bHLH, expression tissu-spécifique, régions régulatrices, embryons transgéniques et fondateurs, ciblage progéniteurs/souches, transfert de gène, fonctions proneurale et proendocrine