Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Trichosporon tem sido descrito como patogeno oportunista emergente relacionado as infeccoes disseminadas em pacientes imunocomprometidos, sobretudo em individuos apresentando neutropenia intensa. E bastante evidente que ha poucas informacoes disponiveis sobre as caracteristicas das infeccoes por este patogeno principalmente nos hospitais brasileiros, sendo necessaria a realizacao de estudos que permitam a caracterizacao do seu perfil epidemiologico. Objetivos: 1) Identificar por metodos fenotipicos e genotipicos as especies de Trichosporon isoladas de hemoculturas obtidas de pacientes hospitalizados; 2) Adaptar a metodologia do CLSI para a avaliacao da sensibilidade a antifungicos de isolados de Trichosporon spp.; 3) Avaliar Etest® para predizer a sensibilidade a anfotericina B; 4) Avaliar o perfil de sensibilidade de diferentes especies do genero Trichosporon, em relacao a seis antifungicos. Material e Metodos: Foram utilizadas 23 cepas de Trichosporon spp. isoladas de hemoculturas provenientes de dois hospitais terciarios da cidade de São Paulo e coletadas entre os anos de 1995 e 2004. As leveduras foram identificadas em nivel de especie atraves de caracteristicas morfologicas e bioquimicas, sendo esta identificacao confirmada por estudos moleculares. Para tanto, foi amplificada a regiao 18S do rDNA para a confirmacao da identificacao do genero e realizado o sequenciamento da regiao IGS 1 para confirmacao da identificacao de especie. A avaliacao da sensibilidade aos antifungicos foi realizada por dois diferentes metodos: microdiluicao em caldo e difusao em agar por Etest®. Resultados: A identificacao fenotipica foi comparada com a genotipica demonstrando algumas incongruencias quanto as duas metodologias. Tres isolados foram erroneamente identificados como: T asteroides (identificacao molecular: T asahii varo asahil); T inkin (identificacao molecular: Tasahii var. asahii) e T asahii (identificacao molecular: T asteroides), enquanto que quatro isolados nao foram identificados em nivel de especie pelo metodo fenotipico. Houve 61 por cento de concordancia entre as duas metodologias, sendo T asahii a especie mais frequentemente identificada na presente serie. Anfotericina B foi o unico antifungico testado pelas duas metodologias. As CIMs da microdiluicao em caldo apresentaram-se distribuidas em menor espectro de diluicoes, enquanto que no Etest@ as CIMs apresentaram-se num largo espectro. Os isolados de T asahii apresentaram CIMs mais elevadas e menores indices de sensibilidade a anfotericina B, por ambos os metodos, quando comparados com isolados de T nao-asahii. Houve elevada sensibilidade aos azolicos. Em contrapartida, 5-fluorocitosina e caspofungina nao apresentaram atividade in vitro contra estes isolados. Conclusao: O sequenciamento da regiao IGS1 foi suficiente para a identificacao de todos os isolados clinicos incluindo especies geneticamente relacionadas. Mesmo utilizando numero limitado de cepas, observamos que os triazolicos apresentaram melhor padrao de atividade antifungica contra os isolados de Trichosporon spp / Introduction: The genus Trichosporon has been described as an emergent opportunistic pathogen related to disseminated infections in immunocompromised patients, specifically those individuals with intense neutropenia. It is highly evident that there is not enough information available about the characteristics of the infection caused by this pathogen, mainly in Brazilian hospitals. Therefore, it is important to investigate trichosporonosis epidemiology. Objectives: 1) To identify strains isolated from blood cultures using phenotypic and genotypic methods. 2) To adapt CLSI methodology for the evaluation of Trichosporon spp. sensitivity to antifungal drugs. 3) To evaluate Etest® for predicting sensitivity to Amphotericin B. To evaluate the sensitivity profile of different Trichosporon species to 6 antifungal drugs. Material and methods: We analyzed 23 strains of Trichosporon spp. recovered from blood cultures of two tertiary hospitals in São Paulo and collected between 1995 and 2004. The yeasts were identified to species level based on their morphological and biochemical characteristics and subsequently by molecular biology. For those purposes, we amplified the18S rDNA region to confirm genus identification and sequenced the IGS1 region of rDNA to confirm species phenotypic identification. We used two different methods to investigate sensitivity to antifungal drugs: broth microdilution and agar-diffusion disk test using Etest®. Results: We observed some incongruences between the phenotypic and genotypic methods used for identification. Three isolates were misidentified as T. asteroids (molecular identification: T. asahii var. asahii). T. inkin (molecular identification: T. asteroids), while four isolates could not be identified to species level using phenotypic methods. The two different methods agreed on 61% of the cases. T. asahii was the most commonly isolated species in the present study. Amphotericin B was the only antifungal drug tested with both methodologies. Broth microdilution MICs were less variable within different dilutions, while Etest® MICS showed broader variation. T. asahii isolates had higher MICs values and were less susceptible to Amphotericin B for both methods than Non-Asahii Trichosporon. The isolates were highly sensitive to azoles. Nevertheless, 5-fluorocitosin and caspofungin had no in vitro activity against the clinical isolates analyzed. Conclusion: The IGS1 region sequencing was enough to identify all the clinical isolates, including closely related species. Although the number of strains tested was small, we observed that triazoles had better antifungal activity against Trichosporon spp. isolates. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Com o aumento de pacientes imunocomprometidos nas últimas décadas, os fungos têm emergido como uma das causas de doenças humanas. Leveduras ubíquas e/ou comensais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. estão sendo descritas como importantes causadoras de infecções. Com o objetivo de avaliar clinicamente os casos de infecções por leveduras emergentes, foi realizado um estudo de 101 casos diagnosticados da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre nos últimos anos, revisando a apresentação clínica, condição predisponente, terapia utilizada e evolução dos pacientes. A doença de base mais frequente foi insuficiência renal. A manifestação clínica principal foi febre. Os fatores de risco mais frequentes foram uso de cateter venoso central e internação em unidade de terapia intensiva. O antifúngico mais utilizado no tratamento das infecções por S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri e Trichosporon sp. foi o fluconazol e no tratamento das infecções por Rhodotorula sp. foi a anfotericina B. Aproximadamente 32% dos pacientes apresentaram melhora clínica após o tratamento com antifúngico e 26% foram a óbito. O diagnóstico rápido e específico destas leveduras é importante para a decisão terapêutica e o melhor prognóstico. / With the increase of immunocompromised patients in recent decades, fungi have emerged as a major cause of human diseases. Ubiquitous yeast and/or commensal as Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. are described as important causative agents of infections. Faced with this, the identification of yeast is important for therapeutic decisions and for epidemiological studies. In order to clinically evaluate the cases of yeast infections emerging, a study of the major cases diagnosed at Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre in recent years, reviewing the clinical presentation, predisposing condition, therapy and patients’s progress. The underlying disease frequently was renal failure. The major clinical manifestation was fever. The most frequent risk factors were: use of central venous catheter and intensive care unit stay. The most used antifungal in the treatment of infections caused by S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri and Trichosporon sp. was fluconazole and in the cases of infections by Rhodotorula sp. was amphotericin B. Most patients showed clinical improvement after treatment with antifungal. Approximately 32% of patients showed clinical improvement after treatment with antifungal and 26% died.The rapid and specific diagnosis of these yeasts is important for the therapeutic decision and a better prognosis.

Com o aumento de pacientes imunocomprometidos nas últimas décadas, os fungos têm emergido como uma das causas de doenças humanas. Leveduras ubíquas e/ou comensais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. estão sendo descritas como importantes causadoras de infecções. Com o objetivo de avaliar clinicamente os casos de infecções por leveduras emergentes, foi realizado um estudo de 101 casos diagnosticados da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre nos últimos anos, revisando a apresentação clínica, condição predisponente, terapia utilizada e evolução dos pacientes. A doença de base mais frequente foi insuficiência renal. A manifestação clínica principal foi febre. Os fatores de risco mais frequentes foram uso de cateter venoso central e internação em unidade de terapia intensiva. O antifúngico mais utilizado no tratamento das infecções por S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri e Trichosporon sp. foi o fluconazol e no tratamento das infecções por Rhodotorula sp. foi a anfotericina B. Aproximadamente 32% dos pacientes apresentaram melhora clínica após o tratamento com antifúngico e 26% foram a óbito. O diagnóstico rápido e específico destas leveduras é importante para a decisão terapêutica e o melhor prognóstico. / With the increase of immunocompromised patients in recent decades, fungi have emerged as a major cause of human diseases. Ubiquitous yeast and/or commensal as Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. are described as important causative agents of infections. Faced with this, the identification of yeast is important for therapeutic decisions and for epidemiological studies. In order to clinically evaluate the cases of yeast infections emerging, a study of the major cases diagnosed at Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre in recent years, reviewing the clinical presentation, predisposing condition, therapy and patients’s progress. The underlying disease frequently was renal failure. The major clinical manifestation was fever. The most frequent risk factors were: use of central venous catheter and intensive care unit stay. The most used antifungal in the treatment of infections caused by S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri and Trichosporon sp. was fluconazole and in the cases of infections by Rhodotorula sp. was amphotericin B. Most patients showed clinical improvement after treatment with antifungal. Approximately 32% of patients showed clinical improvement after treatment with antifungal and 26% died.The rapid and specific diagnosis of these yeasts is important for the therapeutic decision and a better prognosis.

Com o aumento de pacientes imunocomprometidos nas últimas décadas, os fungos têm emergido como uma das causas de doenças humanas. Leveduras ubíquas e/ou comensais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. estão sendo descritas como importantes causadoras de infecções. Com o objetivo de avaliar clinicamente os casos de infecções por leveduras emergentes, foi realizado um estudo de 101 casos diagnosticados da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre nos últimos anos, revisando a apresentação clínica, condição predisponente, terapia utilizada e evolução dos pacientes. A doença de base mais frequente foi insuficiência renal. A manifestação clínica principal foi febre. Os fatores de risco mais frequentes foram uso de cateter venoso central e internação em unidade de terapia intensiva. O antifúngico mais utilizado no tratamento das infecções por S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri e Trichosporon sp. foi o fluconazol e no tratamento das infecções por Rhodotorula sp. foi a anfotericina B. Aproximadamente 32% dos pacientes apresentaram melhora clínica após o tratamento com antifúngico e 26% foram a óbito. O diagnóstico rápido e específico destas leveduras é importante para a decisão terapêutica e o melhor prognóstico. / With the increase of immunocompromised patients in recent decades, fungi have emerged as a major cause of human diseases. Ubiquitous yeast and/or commensal as Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. are described as important causative agents of infections. Faced with this, the identification of yeast is important for therapeutic decisions and for epidemiological studies. In order to clinically evaluate the cases of yeast infections emerging, a study of the major cases diagnosed at Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre in recent years, reviewing the clinical presentation, predisposing condition, therapy and patients’s progress. The underlying disease frequently was renal failure. The major clinical manifestation was fever. The most frequent risk factors were: use of central venous catheter and intensive care unit stay. The most used antifungal in the treatment of infections caused by S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri and Trichosporon sp. was fluconazole and in the cases of infections by Rhodotorula sp. was amphotericin B. Most patients showed clinical improvement after treatment with antifungal. Approximately 32% of patients showed clinical improvement after treatment with antifungal and 26% died.The rapid and specific diagnosis of these yeasts is important for the therapeutic decision and a better prognosis.

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-06-10T14:43:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T18:36:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T18:39:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-11T18:39:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Alessandra Alves Drumond Siqueira.pdf: 694552 bytes, checksum: 063f14c557446b37809da884d1b0d0a9 (MD5) Previous issue date: 2004-03-29 / Não Informada / The proteases are enzymes which occupy a pivotal position with respect to their application in medical and commercial fields. Collagenases are detached among several kind of proteases, used in pharmaceutical and cosmetician industry, in processes such as smooth the skin, oral hygiene, disinfect suppurative wounds, cicatrizing processes, burning and as a trombolytic agent. In order to select protease producing yeasts, this study had as objectives to partially characterize the enzyme as for pH and stability temperature and to verify the effect of the enzyme in the degradation of collagen. 50 samples of yeasts isolated from different substrates, obtained from the culture collection DPUA, were analysed. Samples were cultured in Malte extract supplemented with 1,0 % gelatin at 30 ºC in shaking conditions (140 rpm). The qualitative proteolytic activity was determined in agar gelatin-milk medium and the quantitative activity was determined using azocasein 1,0 % as substrate. The best culture conditions to protease production were established for a species, being studied the following parameters: characteristics of pathogenicity, size and age of inoculate, best growth temperature, coal and nitrogen sources. The best stability conditions of protease were assessed for pH (6-12) and temperature (25 º, 37 º, 40 º, 50 º, 60 º, 70 º and 80 ºC) and the effect of the enzyme in the degradation of collagen. Among the identified species, Trichosporon pullulans was selected, because it showed the highest levels of proteolytic activity in qualitative (halo = 27 mm) and quantitative (420 U/mL) assays. The assays to determine the characteristics of pathogenicity of this species showed positive growth at 37ºC, weak positive ureasic activity and there was no phospholipasic activity, the highest proteolytic activity (246,66 U/mL) detected with inoculate corresponded to 10% of the volume of medium and stock of culture growth for 24 hours. Trials to verify the effect of temperature (25 ºC to 50 ºC) on growth and protease production demonstrated that the higher biomass (3,46 mg/mL) and proteolytic activity (513,33 U/mL) were obtained at 30 ºC. Sucrose 1,0 % was the best coal source yielding higher biomass (6,18 mg/mL) and proteasic activity (580 U/mL) and as nitrogen source detached peptone 0,5 % showing the higher values of proteolytic activity (755,55 U/mL) and biomass (7,55 mg/mL). The collagenolytic activity was determined in solid medium using dissolvable collagen as the only coal source. T. pullulans degraded collagen, producing a 28 mm halo. This work demonstrated that protease, with collagenolytic activity; produced by T. pullulans, can be used as therapeutic agent further detailed studies. / As proteases são enzimas que ocupam uma posição central com respeito à aplicação na área médico e industrial. Entre os vários tipos de proteases, utilizadas na indústria farmacêutica e de cosméticos, destacam-se as colagenases utilizadas para amaciamento da pele, higiene oral, na limpeza de feridas purulentas, em processos de cicatrização, queimaduras e como agente anti-trombolítico. Realizou-se este estudo com o objetivo de selecionar leveduras produtoras de proteases, avaliar as melhores condições de crescimento da espécie produtora de protease, caracterizar parcialmente a enzima quanto o pH e temperatura na estabilidade e verificar o efeito desta enzima na degradação do colágeno. Foram analisadas 50 amostras de leveduras isoladas de diferentes substratos, provenientes da coleção de cultura DPUA. As amostras foram cultivadas em extrato de Malte suplementado com gelatina 1,0 % a 30 ºC, sob agitação (140 rpm) por 72 horas. A atividade proteolítica qualitativa foi determinada em meio sólido ágar gelatina-leite e a quantitativa utilizando como substrato azocaseína 1 % p/v. Foram estabelecidas, para a espécie selecionada, as melhores condições de cultivo para produção da protease, foram estudados: características de patogenicidade, tamanho e idade do inóculo, temperatura ótima de crescimento, fontes de carbono e nitrogênio. Foram avaliadas as melhores condições de estabilidade da protease pH (6-12) e temperatura (25 º, 37 º, 40 º, 50 º, 60 º, 70 º e 80 ºC) e também, o efeito da enzima na degradação do colágeno. A determinação da atividade colagenolítica foi realizada em meio sólido utilizando colágeno solúvel como única fonte de carbono. Selecionou-se, entre as espécies identificadas, Trichosporon pullulans (DPUA), por apresentar o maior valor de atividade proteolítica em ensaio qualitativo (halo = 27 mm) e em ensaio quantitativo (420 U/mL). Os experimentos realizados para detectar as características de patogenicidade desta espécie demonstraram crescimento positivo a 37 ºC, atividade ureásica positiva e não foi detectada atividade fosfolipásica; a maior atividade proteolítica (246,66 U/mL) foi detectada com inóculo que correspondeu a 10 % do volume de meio e cultura estoque de 24 horas de crescimento. Os ensaios realizados para verificar o efeito da temperatura no crescimento e na produção da protease demonstraram que a maior biomassa (3,46 mg/mL) e atividade proteolítica (513,33 U/mL) foram obtidas a 30 ºC. A melhor fonte de carbono foi sacarose 1,0 % produzindo maior crescimento (6,18 mg/mL) e maior atividade proteásica (580 U/mL) e como fonte de nitrogênio destacou-se a peptona 0,5 % expressando os maiores valores de atividade proteolítica (755,55 U/mL) e biomassa de 7,55 mg/mL. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a protease produzida por T. pullulans classifica-se como protease alcalina (pH ótimo 8,0). E maior estabilidade térmica da protease foi observada a 37 ºC onde a enzima manteve 100 % de sua atividade durante 40 minutos de incubação. T. pullulans degradou o colágeno produzindo halo de 28 mm. Esse estudo demonstrou que a protease apresenta atividade colagenolítica e poderá ser utilizada como agente terapêutico

SERPA, R. Biofilmes de Trichosporon asahii e Trichosporon inkin: aspectos morfofisiológicos, sensibilidade a antifúngicos e inibição mediada por ritonavir. 2016. 118 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:21:57Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / In recent years, several studies have considered Trichosporon genus as emerging opportunistic pathogens in immunocompromised patients. Although the dynamics are not well understood, it is known that events associated with biofilm formation on these fungi play an important role in the infectious process. Thus, the present study analyzed morphophysiological aspects of biofilms produced by Trichosporon spp., as well as the role of a protease inhibitor on T. asahii and T. inkin cells and biofilms. In the first part of the study, we investigated the biofilm formation of T. inkin (n=7) in RPMI broth, CLED broth and Sabouraud broth at pH 5.5 and pH 7.0, with initial inoculum of 1x104, 1x105 and 1x106 cells/ml, incubated at 28°C and 35°C in static or shaking at 80 rpm. Biofilms were evaluated for their biomass and metabolic viability, viable cell counts, quantification of nucleic acids and proteinase activity. It was also investigated the sensitivity of the biofilm front of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole and voriconazole. To evaluate the inhibitory activity of ritonavir on the structure and functioning of T. asahii and T. inkin biofilms, biofilms were formed in the presence of ritonavir and evaluated for cell adhesion, structural development and proteinase activity. Additionally, ritonavir was assessed on mature biofilms, matrix composition and structural changes. Planktonic cells of T. asahii and T. inkin (n=2 each) were also investigated for sensitivity to ritonavir alone and in combination with antifungals. Finally, planktonic cells were pre-exposed to ritonavir and evaluated for biofilm formation capacity, susceptibility to antifungal agents, and changes in their surface hydrophobicity. Maximum biofilms growth in RPMI pH 7.0 for inoculation of 1x106 cells/ml and incubation at 35°C under stirring. Biofilms produced under these conditions are formed by dynamic communities associated with an extracellular matrix, and show increased viability and biomass over time, reaching stability after 48 hours of cultivation. During the development of biofilms occurs release of viable cells and nucleic acids into the surrounding environment. T. inkin biofilms produce more proteases and tolerate higher concentrations of antifungals that planktonic cells related. Due to the presence of proteases in the development of T. inkin biofilm, it was hypothesized that these enzymes could be considered important targets in controlling biofilms. The results showed that ritonavir decreased cell adhesion and formation of mature biofilms, and reduce protease activity and change the structure of biofilms. Ritonavir did not affect the viability of mature biofilms, but changed the composition of the extracellular matrix of biofilms, which showed different protein spectra compared to the control group. Ritonavir was able to inhibit planktonic growth of T. asahii and T. inkin approximately 50%. However, there was no synergism between ritonavir and tested antifungals. In planktonic cells, pre-exposure to ritonavir significantly reduced values of minimum inhibitory concentration of Amphotericin B in T. asahii and T. inkin, although not change the response to azoles. Preincubation with ritonavir reduced cell adhesion, but not the formation of mature biofilms, in addition to changing the hydrophobicity of the cell surface. The article detailed characteristics of T. inkin biofilms and showed the potential use of a protease inhibitor in controlling these biofilms. / Nos últimos anos, diversos estudos têm considerado os fungos do gênero Trichosporon como patógenos oportunistas emergentes em pacientes imunocomprometidos. Embora a dinâmica não seja bem compreendida, sabe-se que eventos associados à formação de biofilme nestes fungos têm papel importante no processo infeccioso. Desta forma, o presente estudo analisou aspectos morfofisiológicos dos biofilmes produzidos por T. inkin, bem como o papel de um inibidor de proteases sobre as células e biofilmes de T. asahii e T. inkin. Na primeira parte da pesquisa, foi investigada a formação de biofilmes de T. inkin (n=7) nos meios RPMI, Caldo CLED e Caldo Sabouraud, em pH 5,5 e pH 7,0, com inóculos iniciais de 1x104, 1x105 e 1x106 células/mL, incubados a 28°C e 35°C, de forma estática ou agitação a 80 rpm, por 48h. Os biofilmes formados foram avaliados quanto à biomassa e atividade metabólica, contagem de células viáveis, quantificação de ácidos nucléicos e atividade proteásica. Investigou-se ainda a sensibilidade dos biofilmes frente à anfotericina B, caspofungina, fluconazol, itraconazol e voriconazol. Para avaliação da atividade inibitória do ritonavir sobre a estrutura e o funcionamento dos biofilmes de T. asahii e T. inkin, biofilmes foram formados na presença de ritonavir e avaliados quanto à adesão celular, desenvolvimento estrutural e atividade proteásica. Adicionalmente, o ritonavir foi avaliado sobre biofilmes maduros, composição de matriz e alterações estruturais. Células planctônicas de T. asahii e T. inkin (n=2 cada) também foram investigadas quanto à sensibilidade ao ritonavir isolado e em combinação com antifúngicos. Por fim, células planctônicas foram pré-expostas ao ritonavir e avaliadas quanto à capacidade de formação de biofilmes, sensibilidade a antifúngicos e alteração na hidrofobicidade de suas superfícies. A produção de biofilmes foi máxima em RPMI pH 7,0, em inóculo de 1x106 células/mL, e incubação a 35°C, sob agitação. Os biofilmes produzidos nessas condições são formados por comunidades dinâmicas, associadas a uma matriz extracelular, e mostram aumento da atividade metabólica e biomassa ao longo do tempo, atingindo estabilidade após 48 h de cultivo. Durante o desenvolvimento dos biofilmes, ocorre liberação de células viáveis e ácidos nucléicos para o ambiente circundante. Os biofilmes de T. inkin produzem mais proteases e toleram maiores concentrações de antifúngicos que as células planctônicas relacionadas. Dada à presença de proteases durante o desenvolvimento do biofilme de T. inkin, foi hipotetizado que essas enzimas poderiam ser consideradas alvos importantes no controle dos biofilmes. Os resultados mostraram que o ritonavir diminuiu a adesão celular e formação de biofilmes maduros, além de reduzir a atividade proteásica e alterar a estrutura dos biofilmes. O ritonavir não interferiu na atividade metabólica de biofilmes maduros, mas alterou a composição da matriz extracelular dos biofilmes, as quais apresentaram diferentes espectros protéicos em comparação com o grupo controle. O ritonavir inibiu o crescimento planctônico de T. asahii e T. inkin a 100 μg/mL. Entretanto, não foi observado sinergismo entre o ritonavir e os antifúngicos testados. Em células planctônicas, a pré-exposição ao ritonavir reduziu significativamente os valores de concentração inibitória mínima da anfotericina B em T. asahii e T. inkin, embora não tenha alterado a resposta aos azólicos. A pré-incubação com ritonavir reduziu a adesão das células, mas não a formação de biofilmes maduros, além de alterar a hidrofobicidade da superfície celular. O presente artigo detalhou características dos biofilmes de T. inkin e mostrou o potencial do uso de um inibidor de proteases no controle dos biofilmes de T. asahii e T. inkin.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-05Bitstream added on 2014-06-13T19:14:42Z : No. of bitstreams: 1 shinya_ty_me_sjrp.pdf: 938343 bytes, checksum: c5a013f3a467162e18061087abbec274 (MD5) / Devido à necessidade de obtenção de novas moléculas com ação antimicrobiana, o presente trabalho visou investigar a capacidade antagônica do extrato produzido pelo fungo Trichosporon asahii. O extrato foi obtido pela fermentação do fungo em fermentador de bancada 7L, a 28°C por 72 horas. O caldo fermentado foi centrifugado a 2500 rpm por 20 minutos, sendo o sobrenadante a fração denominada extrato bruto, que foi seco em estufa (37°C) e ressuspendido em água destilada, para testes de ação antimicrobiana contra os micro-organismos Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e ATCC 27853, Xanthomonas campestris pv campestris. O teste de sensibilidade foi o de Concentração Bactericida e Fungicida Mínima (CBM e CFM), através da macrodiluição em tubos e plaqueamento. Numa segunda etapa, o extrato bruto foi submetido a uma separação líquido-líquido utilizando os solventes hexano e diclorometano, obtendo-se frações aquosa e orgânica. Numa última etapa de purificação, o extrato diclorometânico passou por uma cromatografia de troca-iônica, cromatografia em sílica gel e precipitação com sulfato de amônio. Foram calculados alguns parâmetros de fermentação do T. asahii, através dos métodos de quantificação de açúcares redutores, pH, viabilidade e brotamento das leveduras e quantidade total de células. O teste de sensibilidade do extrato bruto demonstrou apenas atividade antibacteriana (30000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 9027, 33000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 27853 e 75000 µg/mL sobre X. campestris). Observou-se uma diminuição da CBM para a fração diclorometânica (17500 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 9027, 20000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 27853 e 60000 µg/mL sobre X. campestris). Na pré-purificação, o método que demonstrou maior eficácia para o propósito... / Nowadays there is a demand for new natural molecules that may contribute to the control of pathogenic microorganisms. In this study it was aimed to investigate the antimicrobial ability of the broth produced by the culture of the fungus Trichosporon asahii. The extract was obtained by fermentation of T. asahii bench 7 L fermenter at 28° C for 72 hours. The fermented broth was centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction termed crude extract, which was dried in oven (37° C) and resuspended in distilled water for testing antimicrobial activity against the microorganisms Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 and ATCC 27853 and Xanthomonas campestris pv campestris. The method used for quantification of antibiotic was the Minimum Bactericidal and Fungicidal Concentration (MBC and MFC) by macrodilution tubes and plating. In a second stage, the crude extract was subjected to liquid-liquid separation using dichloromethane and hexane solvents to yield aqueous and organic fractions. A new purification step from the dichloromethanic fraction passed through an ion exchange chromatography, silica gel chromatography and by precipitation with ammonium sulfate. It was also calculated some fermentation parameters of T. asahii by analytical methods for quantifying reducing sugars, pH, cell viability, budding yeasts and total cells. The MBC test showed only antibacterial activity (33,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 27853, 30,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 9027 and 75,000 µg/mL for X. campestris). There was a decrease in the MBC for the dichloromethanic fraction (20,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 27853, 17,500 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 9027 and 60,000 µg/mL for X. campestris). In the pre-purification step, the ion exchange chromatography was the more effective method... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Ary Fernandes Júnior / Banca: Valéria Marta Gomes Lima / Resumo: Devido à necessidade de obtenção de novas moléculas com ação antimicrobiana, o presente trabalho visou investigar a capacidade antagônica do extrato produzido pelo fungo Trichosporon asahii. O extrato foi obtido pela fermentação do fungo em fermentador de bancada 7L, a 28°C por 72 horas. O caldo fermentado foi centrifugado a 2500 rpm por 20 minutos, sendo o sobrenadante a fração denominada extrato bruto, que foi seco em estufa (37°C) e ressuspendido em água destilada, para testes de ação antimicrobiana contra os micro-organismos Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e ATCC 27853, Xanthomonas campestris pv campestris. O teste de sensibilidade foi o de Concentração Bactericida e Fungicida Mínima (CBM e CFM), através da macrodiluição em tubos e plaqueamento. Numa segunda etapa, o extrato bruto foi submetido a uma separação líquido-líquido utilizando os solventes hexano e diclorometano, obtendo-se frações aquosa e orgânica. Numa última etapa de purificação, o extrato diclorometânico passou por uma cromatografia de troca-iônica, cromatografia em sílica gel e precipitação com sulfato de amônio. Foram calculados alguns parâmetros de fermentação do T. asahii, através dos métodos de quantificação de açúcares redutores, pH, viabilidade e brotamento das leveduras e quantidade total de células. O teste de sensibilidade do extrato bruto demonstrou apenas atividade antibacteriana (30000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 9027, 33000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 27853 e 75000 µg/mL sobre X. campestris). Observou-se uma diminuição da CBM para a fração diclorometânica (17500 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 9027, 20000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 27853 e 60000 µg/mL sobre X. campestris). Na pré-purificação, o método que demonstrou maior eficácia para o propósito... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays there is a demand for new natural molecules that may contribute to the control of pathogenic microorganisms. In this study it was aimed to investigate the antimicrobial ability of the broth produced by the culture of the fungus Trichosporon asahii. The extract was obtained by fermentation of T. asahii bench 7 L fermenter at 28° C for 72 hours. The fermented broth was centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction termed crude extract, which was dried in oven (37° C) and resuspended in distilled water for testing antimicrobial activity against the microorganisms Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 and ATCC 27853 and Xanthomonas campestris pv campestris. The method used for quantification of antibiotic was the Minimum Bactericidal and Fungicidal Concentration (MBC and MFC) by macrodilution tubes and plating. In a second stage, the crude extract was subjected to liquid-liquid separation using dichloromethane and hexane solvents to yield aqueous and organic fractions. A new purification step from the dichloromethanic fraction passed through an ion exchange chromatography, silica gel chromatography and by precipitation with ammonium sulfate. It was also calculated some fermentation parameters of T. asahii by analytical methods for quantifying reducing sugars, pH, cell viability, budding yeasts and total cells. The MBC test showed only antibacterial activity (33,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 27853, 30,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 9027 and 75,000 µg/mL for X. campestris). There was a decrease in the MBC for the dichloromethanic fraction (20,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 27853, 17,500 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 9027 and 60,000 µg/mL for X. campestris). In the pre-purification step, the ion exchange chromatography was the more effective method... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3025_1.pdf: 1641923 bytes, checksum: eebfd9fe41f05ee2cb2a6c66f3c18bd4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trichosporon são leveduras pertencentes ao filo Basidiomycota, algumas espécies são destacadas na atividade proteolítica, xilanolítica dentre outras enzimas. Os objetivos deste estudo foram verificar a viabilidade, autenticar a taxonomia, caracterizar quanto à capacidade queratinolítica e/ou queratinofílica em meio sólido e cultivo submerso, selecionar isolados em meio sólido e em fermentação por cultura submersa para a produção de xilanases e otimizar as condições de produção de xilanases em culturas de Trichosporon preservados sob óleo mineral na Micoteca URM. Foram realizadas a reativação e autenticação das culturas através das características morfofisiológicas. Para caracterização queratinolítica e/ou queratinofílica e xilanolítica foram utilizados como substratos penas de aves e xilana em meio sólido e no cultivo submerso foram utilizados como fontes de carbono penas de aves e xilose respectivamente. Para determinação das melhores condições de produção de xilanases foi realizado planejamento fatorial completo (24). Das 22 amostras mantidas na Micoteca URM, 91% permaneceram viáveis e foram autenticadas confirmando a espécie depositada. Os vinte isolados viáveis foram capazes de colonizar as penas, apresentando atividade queratinofílica. Em meio sólido, todas as culturas apresentaram crescimento, sem presença de halo de degradação, contudo em cultivo submerso, todas as culturas apresentaram atividade queratinolítica, sendo T. aquatile URM4440 com 2,65 U/mL o melhor produtor que apresentou atividade ótima em pH 8,6 a 40°C. Na detecção da atividade xilanolítica, 12 culturas apresentaram halo de degradação, sendo selecionadas para teste em cultivo submerso. Em meio líquido, o isolado T. cutaneum URM4789 com 24,25 U/mL foi o melhor produtor, o qual apresentou atividade ótima em pH 6,0 a 60°C, sendo selecionado para otimização das condições de produção de xilanases. O melhor resultado das condições de produção da atividade xilanolítica foi obtido no ensaio 13, nas seguintes condições: tempo de 96 horas; concentração de xilose 1,5%; ausência de extrato de levedura; pH 7,0 e temperatura 27°C, nessas condições 65,15 U/mL de atividade enzimática foi obtida. As variáveis, concentração de xilose, temperatura e o pH mostraram efeito significativo sobre a produção de xilanases. Dentre as espécies avaliadas, T. aquatile URM4440 e T. cutaneum URM4789 apresentaram os melhores resultados quanto às atividades queratinolíticas e xilanolíticas respectivamente

Trichosporon spp. são patógenos oportunistas emergentes que causam alta mortalidade entre pacientes imunocomprometidos. A presente investigação teve como objetivos avaliar aspectos ecológicos relacionados à colonização humana e animal; testar 28 amostras de Trichosporon através de métodos de caracterização laboratorial clássica, detectar a atividade enzimática extracelular e avaliar a suscetibilidade desses isolados contra os antifúngicos. A expressão de melanina e glucuronoxylomanana (GXM) em parede celular foi estudada em T. asahii., Trichosporon inkin e T. asahii foram isolados da região perigenital de duas mulheres e dois tamanduás, respectivamente. Microbiologicamente, as amostras investigadas (28) apresentaram características morfológicas e fisiológicas compatíveis com as descritas na literatura. Pouca especificidade na identificação de Trichosporon spp. foi verificada em CHROMagar Candida® e API ID 32C®. O estudo da atividade de exoenzimas demonstra a relevância na produção de lipase. Não foi possível detectar a expressão de melanina em T. asahii. No entanto, GXM foi expressa por amostra-padrão e isolado clínico da mesma espécie. Embora os pontos de corte não estejam, ainda, bem estabelecidos para Trichosporon spp., os testes sugerem valores elevados de concentração inibitória mínima (CIM) para anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Voriconazol demonstrou maior eficácia contra Trichosporon spp. A maior parte das amostras apresentou resistência a caspofungina. / Trichosporon spp. are emergent opportunistic pathogens that cause high mortality among immunocompromised patients. The aim of the study was to evaluate ecological aspects related to human and animal colonization; to test 28 samples of Trichosporon spp. on classic laboratorial characterization, detection of the extracellular enzymatic activity and antifungal susceptibility (E-test®). Melanin and glucuronoxylomanan (GXM) wall expression was studied in T. asahii. Trichosporon inkin and T. asahii were isolated from perigenital area of two women and from the haircoat of two anteaters, respectively. Microbiologically, the samples studied (28) have presented morphological and physiological characteristics according to descriptions of the literature. Few specificity on identification of Trichosporon spp. was verified at CHROMagar Candida® and API ID 32C® commercial tests. The extracellular enzymatic activity showed the relevance of lipase production. The melanin wall expression was not verified in T. asahii.. On the other hand, GXM was expressed by the control and the clinical sample, both of the same specie. Though the sensibility break points were still not established for Trichosporon spp., the tests indicate high values of minimal inhibitory concentration (MIC) for amphotericin B, fluconazole, itraconazole and cetoconazole. Voriconazole showed the best results against Trichosporon spp. The most part of the samples was resistant to caspofungin.