Breast cancer has the highest incidence rate in women, accounting for more than 22% of all cancers and possessing a strong disposition to metastasize to bone. These skeletal metastases become a significant cause of morbidity and mortality in patients with the primary symptom being pain. Pain is a major concern in determining a patient’s quality of life and there have been many attempts to understand and control bone pain with little success. Previous studies have shown that glutamate plays a role in bone cancer pain, with an excess in free glutamate able to cause pain either directly through excitotoxic pathways or indirectly though the dysregulation of osteoclasts and osteoblasts, causing bone dysregulation. TRPV-1 receptors have also has been implicated in the mechanisms of bone cancer pain, as osteoclasts release protons during bone remodeling which can elicit a TRPV-1-related nociceptive response from neurons in the surrounding periosteum. Capsazepine was identified during a high throughput screen of 30,000 compounds to be a potent inhibitor of breast cancer cell-mediated glutamate release, a neurotransmitter with known associations in neural signaling, bone homeostasis, and pain. Capsazepine also has antagonistic effects on transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV-1) receptors which act as key players in both heat and vanilloid-induced nociception. These findings suggest that Capsazepine may provide a multi-site effect for the treatment of cancer-induced bone pain. An animal model of breast cancer-induced bone pain involved intrafemorally injecting MDA-MB-231 cancer cells to measure pain. Behavioural tests are then performed measuring dynamic weight bearing and paw withdrawal thresholds. These measurements are used to demonstrate both movement-evoked and spontaneous pain-related behaviour of the affected limb. Using Capsazepine, we demonstrate a dose-dependent attenuation of pain behaviour in vivo, while confirming tumour presence using immunohistochemistry (IHC). We show that TRPV-1 and glutamate play an important role in the onset and severity of bone cancer pain and blocking these pain pathways provide relief from pain commonly associated with cancer in the bone. / Thesis / Master of Health Sciences (MSc)

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Os endocanabinóides (ECs) são neuromoduladores lipídicos que são produzidos por demanda tendo ação retrógrada. Existem duas moléculas que são atualmente reconhecidos como os principais ECs, a anandamida (AEA) e 2-araquidonoilglicerol (2-AG). O hipocampo sintetiza endocanabinóides e expressa seus receptores (CB1, CB2, TRPV1).Existe uma discrepância de efeitos dos 2 endocanabinóides na potenciação á longo prazo (LTP) hipocampal que pode ser um resultado da AEA agir tanto em receptores CB1 quanto em receptores TRPV1.Tendo em vista que a ativação dos receptores TRPV1 potenciam a LTP hipocampal, e não a inibem como é observado com a AEA, então qual seria o mecanismo de ação da AEA em inibir a LTP? Seria possível que a AEA estivesse preferencialmente inibindo a produção de 2-AG e assim inibindo a LTP? Para testar essa hipótese usamos inibidores farmacológicos da degradação hidrolítica do 2-AG e da AEA e também usamos antagonistas dos receptores TRPV1 e um animal knock-out para o receptor TRPV1. Camundongos machos BlackC57 e knockout(KO) para TRPV1 com idade entre 35 a 49 dias foram utilizados para obtenção de fatias do hipocampo (400µm), e a potenciação a longo prazo na via Schaffer-CA1 estudada. Não observamos efeito dos inibidores da degradação hidrolítica e oxidative dos endocanabinóides na LTP. A LTP do camundongo knock-out era inibida, porem o antagonismo farmacológico dos receptores TRPV1 não minetizou esse efeito. Já o agonista dos receptors canabinóides WIN55212-2 inibiu a indução da LTP. Concluimos que o aumento dos endocanabinóides pela inibição da sua degradação não foi eficiente em alterar a LTP hippocampal em nosso modelo experimental. Aprovação do CONCEA-FMRP- nº008/2017 / Endocannabinoids (ECs) are lipid neuromodulators that are produced on demand having retrograde action. There are two molecules that are currently recognized as the major ECs, anandamide (AEA) and 2-arachidonoylglycerol (2-AG). The hippocampus synthesizes endocannabinoids and expresses their receptors (CB1, CB2, TRPV1). There is a discrepancy of endocannabinoid effects on hippocampal long term potentiation (LTP) which may be a result of AEA acting on both CB1 and TRPV1 receptors. Given that the activation of TRPV1 receptors potentiate hippocampal LTP, and do not inhibit it as observed with AEA, then what would be the mechanism of action of AEA in inhibiting LTP? Was it possible that AEA was preferentially inhibiting 2-AG production and thus inhibiting LTP? To test this hypothesis, we used pharmacological inhibitors of the hydrolytic degradation of 2-AG and AEA and also used TRPV1 receptor antagonists and a knock-out animal for the TRPV1 receptor. Male BlackC57 mice and TRPV1 knockout (KO) aged 35 to 49 days were used to obtain hippocampal slices (400 ?m), and the long-term potentiation in the Schaffer-CA1 pathway studied). The LTP of the knock-out mouse was inhibited, but the pharmacological antagonism of TRPV1 receptors did not mimic this effect, whereas the WIN55212-2 cannabinoid receptor agonist inhibited the induction of LTP. We conclude that increasing the levels of endocannabinoids by inhibiting their degradation was not efficient in altering hippocampal LTP in our experimental model Approval of CONCEA-FMRP- nº 008/2017

L'infarctus du myocarde, une des causes majeures de mortalité à travers le monde, engendre une mort irréversible du muscle cardiaque suite à une ischémie. Cette ischémie, c'est-à-dire une privation de dioxygène et de nutriments, déclencher un stress réticulaire qui perturbe l'équilibre calcique de la cellule cardiaque. Plusieurs pompes et canaux calciques situés à la membrane plasmique ou réticulaire sont des intervenants clés dans le maintien de l'homéostasie calcique. Parmi eux, il existe des canaux de fuites calciques passives, comme les TRPs, et peu d'informations sont actuellement connus à propos de leur rôle précis au cours de l'infarctus du myocarde.TRPV1 est un canal cationique non sélectif qui est activé par la capsaïcine, le pH et la chaleur nocive (>42°C). Dans le muscle squelettique, nous avions démontré que TRPV1 est situé dans la partie longitudinale du réticulum sarcoplasmique et qu'il répond à différentes stimulations physiologiques et pharmacologiques (Lotteau et al., 2013). Ici, nous nous interrogeons sur un éventuel rôle similaire de TRPV1 dans la physiologie cardiaque. Des analyses biochimiques et des mesures de calcium intracellulaire furent réalisées sur des cardiomyocytes issus de souris WT et KO TRPV1. Nos résultats in vitro montrent que: (a) TRPV1 est exprimé dans les cellules cardiaques; (b) une activation de TRPV1 engendre une réduction de la concentration calcique réticulaire et que (c) TRPV1 pourrait être une cible directe de l'isoflurane.Dans la mesure où TRPV1 peut être modulé par de nombreuses molécules pharmacologiques, il pourrait constituer une cible thérapeutique pour réduire la taille d'infarctus. De nombreuses études antérieures ont déjà mis en évidence un rôle cardioprotecteur de TRPV1 dans le système nerveux entourant le cœur. Le but de cette étude est de décrire le fonctionnement des canaux TRPV1 dans des cardiomyocytes adultes / Acute myocardial infarction (MI), a leading cause of morbidity and mortality worldwide, is the irreversible death of heart muscle secondary to ischemia. This ischemia, i.e. oxygen and nutrients deprivation, triggers a reticular stress disrupting the Ca2+ balance of the cardiac cell. Several Ca2+ pumps and channels located at the sarcolemma or at the reticulum membrane are key players in this maintenance of Ca2+ homeostasis. Among them, we find passive leak channels, such as TRPs and little is known about their precise role in MI.TRPV1 represents a non-selective cation channel that is activated by capsaicin, pH and noxious heat. In skeletal muscle, we previously demonstrated that TRPV1 is located in the longitudinal part of the SR and respond to pharmacological and physiological activations (Lotteau et al., 2013). We questioned here whether TRPV1 might have a similar role in heart physiology. Biochemical analysis and intracellular Ca2+ measurements were performed on cardiomyocytes from wild-type and TRPV1-KO mice. Our in vitro results show that: (i) TRPV1 is expressed in cardiac cells; (ii) an increase in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) is elicited under TRPV1 activation; (iii) TRPV1 could be a direct target of isoflurane. In parallel, our in vivo results indicate that a pharmacological preconditioning by isoflurane decrease the infarct size, probably though activation of TRPV1. According to the fact that TRPV1 activity can be modulated by a lot of pharmacological molecules, TRPV1 may serve as therapeutic target to reduce the infarct size. Most of published data have already evidenced this TRPV1 cardioprotective role in the peripheral heart system. The aim of the present work is to describe how TRPV1 channels behave in adult cardiomyocytes

A técnica de Mobilização Neural (MOB) é um método não invasivo que demonstrou tanto na pesquisa básica, como na pesquisa clinica ser eficaz na redução da sensibilidade à dor. O presente, estudo visa examinar os efeitos da MOB na disfunção locomotora, na força muscular, nas alterações morfológicas no nervo isquiático e nas alterações moleculares induzida pela constrição crônica (CCI) do nervo isquiático de ratos Wistar. Para analisar a disfunção locomotora utilizamos o índice funcional do nervo Isquiático (IFC). Para analisar a força muscular, o sistema Biopac System. A ultraestrutura do nervo foi analisada pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão e as alterações moleculares por meio de ensaios de Western blot. Ao finalizarmos os tratamentos com MOB os animais foram eutanasiados e os tecidos como, nervo isquiático, gânglios das raizes posteriores (DRG L4-L6) e Susbtância Cinzenta Periaquedutal (PAG) foram retirados. Os DRG´s foram processados pela técnica de Western Blot para a detecção da substância P (SP), receptor de potencial transitório vanilóide tipo I (TRPV1) e receptores opióides dos tipos µ (MOR), δ (DOR) e k (KOR). Com relação a PAG, analisamos somente os receptores opióides por Western Blot. Nossos resultados demonstraram uma reverção da disfunção locomotora induzida pela CCI após a MOB e aumentou 172% a força do músculo tibial anterior nos animais tratados quando comparado com os animais do grupo CCI. Nossos estudos sobre a ultraestrutura do nervo isquiático demonstraram intenso processo de degeneração Waleriana após a CCI e regeneração após a MOB. Podemos sugerir um papel importante da MOB na modulação da expressão da SP e do TRPV 1. Sobre os receptores DOR e KOR no DRG, não encontramos alterações estatísticas entre os grupos, mas observamos um aumento da expressão de MOR após a MOB. Na PAG, nós observamos uma diminuição de DOR e KOR no grupo CCI e aumento após a MOB. Por outro lado, não encontramos alterações estatíticas para o receptor MOR. Baseado nestes achados, podemos sugerir que a MOB reverte a disfunção locomotora, aumenta a força muscular, induz a regeneração do nervo isquiático, modula a SP e TRPV 1 e aumentou a expressão de MOR no DRG´s. Sugerimos ainda que, a analsegia induzida pela técnica de MOB possa ter um envolvimento também com o sistema inibitório descendente de dor resultando na inibição da transmissão do estímulo nociceptivo aferente e assim, diminuindo a dor neuropática devido influência da MOB sobre os opióides na PAG. / Neural mobilization technique (MOB) is a noninvasive method that demonstrated to be effective in reducing pain sensitivity in both clinical and research study. The present study aims to examine the effects of MOB in locomotors dysfunction, muscle strength, morphological changes in sciatic nerve and molecular changes induced by chronic constriction (CCI) of the sciatic nerve in Wistar rats. To analyze locomotors dysfunction we used the Sciatic nerve functional index (SFI). To analyze muscle strength, was used Biopac System. The nerve morphology was analyzed using electron microscopy and molecular changes through western blot assays. After MOB treatments, animals were euthanized and tissues such as, sciatic nerve, the posterior root ganglions (DRG L4-L6) and substance periaqueductal gray (PAG) were removed. The DRG were processed by western blot for detection of substance P (SP), transient receptor potential vanilloid type I (TRPV1) and opioids receptors (MOR, DOR, KOR). Regarding PAG, we analyze only opioids receptors. Our results demonstrated a full reversal of locomotors dysfunction-induced by CCI after MOB treatment and an increase of 172% on maximal tetanic muscle strength in animals treated with MOB when compared to the CCI group. Our studies on photomicrography of sciatic nerve showed an intense Wallerian degeneration process in CCI animals and an intense regeneration of myelinated fibers. In western blot assays, we identified, in DRG, an increase of SP and TRPV1 expression after CCI and a decrease of optical density after MOB treatment. Regarding opioid receptor, we did not identify statistical changes on DOR and KOR in DRG, but we observed an increased expression of MOR in CCI after MOB treatment group. In PAG analyses, we observed a decrease in DOR and KOR expression after MOB treatment when compare with CCI animals. On the other hand, we did not identify any changes on MOR receptor. Based on our findings, we suggest that treatment with neural mobilization technique it is able to reverses the locomotors dysfunction and increases maximum tetanic force of the tibialis anterior muscle after CCI. Furthermore, the same treatment was also able to induce a severe regeneration in the sciatic nerve after treatment. Still, we can suggest an important role of MOB in modulating SP and TRPV 1 expression. We suggest that antinociceptive effect induced by MOB technique can also be involved with descending pain inhibitory system resulting in inhibition of the transmission of afferent nociceptive stimulus and thereby reducing neuropathic pain because of the influence of MOB opioids in the PAG.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) is relevant to the perception of noxious information and has been studied as a therapeutic target for the development of new analgesics. The goal of this study was to perform in vivo and in vitro screens to identify novel, efficacious, and safe TRPV1 antagonists isolated from leaves of the medicinal plant Vernonia tweedieana Baker. All of the fractions and the hydroalcoholic extract produced antinociception in mice during the capsaicin test, but the dichloromethane fraction (Dcm) also had antioedematogenic effect. Among the compounds isolated from the Dcm fraction, only α-spinasterol reduced the nociception and oedema induced by capsaicin injection. Moreover, α-spinasterol demonstrated good oral absorption and high penetration into the brain and spinal cord of mice. Besides, α-spinasterol was able to displace [3H]-resiniferatoxin (RTX) binding and diminish calcium (Ca2+) influx mediated by capsaicin. Orally administration of the Dcm fraction and α-spinasterol also produced antinociceptive effect in the noxious heat-induced nociception test; however, they did not change the mechanical threshold of naive mice. The treatment with α-spinasterol did not produce antinociceptive effect in mice systemically pre-treated with RTX. In addition, α- spinasterol and the Dcm fraction also reduced the oedema, mechanical and heat hyperalgesia elicited by complete Freund s adjuvant (CFA) paw injection. The Dcm fraction and α-spinasterol did not affect body temperature or locomotor activity. In conclusion, α-spinasterol is an efficacious and safe antagonist of the TRPV1 receptor with antinociceptive effect. / O receptor de potencial transitório vanilóide 1 (TRPV1) é relevante para a percepção de estímulos nocivos e tem sido estudado como um alvo terapêutico para o desenvolvimento de novos analgésicos. O objetivo deste estudo foi desenvolver uma triagem in vivo e in vitro para caracterizar novos antagonistas do receptor TRPV1 isolados das folhas de Vernonia Tweedieana Baker, uma planta medicinal, com atividade antinociceptiva em camundongos. Todas as frações e o extrato hidroalcólico apresentaram efeito antinociceptivo no teste da capsaicina, sendo que a fração diclorometano (Dcm) também mostrou efeito antiedematogênico. Entre os compostos isolados da fração Dcm, apenas o α-espinasterol reduziu a nocicepção e o edema induzidos pela injeção intraplantar de capsaicina. Além disso, o α- espinasterol foi capaz de deslocar o radioligante [3H]-resiniferatoxina, e também de diminuir o influxo de cálcio estimulado pela capsaicina. A fração Dcm e o composto α-espinasterol apresentaram efeito anti-hiperalgésico na nocicepção induzida por estímulo térmico, mas não induzida por estímulo mecânico em animais sem injúria. Porém, o composto α-espinasterol não apresentou atividade antinociceptiva em animais pré-tratados sistemicamente com resiniferatoxina. Este composto e a fração Dcm foram capazes de reduzir a hiperalgesia mecânica e térmica, e também o edema induzidos por adjuvante completo de Freund. A fração Dcm e o α- espinasterol não foram capazes de induzir alteração na temperatura corporal ou atividade locomotora. Também, o α-espinasterol mostrou boa absorção por via oral, e alta penetração no cérebro e na medula espinhal de camundongos. Assim, o α- espinasterol, isolado da fração Dcm, age como um antagonista do receptor TRPV1 com eficaz efeito antinociceptivo, sem indução de efeitos adversos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The medicinal plant Condalia buxifolia has been traditionally used to treat inflammatory processes. The present study aimed to evaluate the phytochemical profile and the analgesic effect of the methanolic extract from the root bark of Condalia buxifolia (MECb) in models of acute pain as well as to investigate the possible adjacente mechanism of its effect in mice. The phytochemical analysis of the extract showed the presence of large amounts of alkaloids. The MECb administered intragastrically 1 hour before the experiments (100 and 300 mg/kg, ig), mimicking the route used in humans (oral), promoted reduction of the nociceptive inflammatory pain (2nd phase) and paw oedema induced by intraplantar (i.pl.) injection of formalin, and its antiedematogenic and analgesic effect lasted until 4 and 6 h after MECb pretreatment. MECb (10-300) also prevented nociception induced by intraperitoneal injection of acetic acid. Furthermore, MECb (100 mg/kg, i.g.) prevented paw oedema and nociception induced by i.pl. injection of capsaicin, acidified saline, and nociception glutamate-induced by i.pl. injection. Centrally, MECb increased the latency to nociceptive stimulation in the hot plate model. Moreover, the opioid system is involved in the mechanism of action of MECb, since its effect (at the dose of 300 mg/kg, i.g.) was reversed by naloxone (an antagonist of opioid receptor). Acute (prolonged) treatment with MECb (100 mg/kg, i.g.) reduced the mechanical and thermal (heat) hyperalgesia caused by plantar incision (PI), a model of postoperative pain; and prevented the increase of the concentration of inflammatory cytokines [interleukin-1 β (IL-1 β), tumor necrosis factor-α (TNF-α)] and neurotrophin [nerve growth factor (NGF)]. Additionally, MECb was able to prevent nociception induced by PLC/PKC and cAMP/PKA pathway activators, PMA, forskolin and PGE2. Furthermore, MECb was also able to reduce PKA activation, demonstrated by western blotting analysis, suggesting that the MECb can act by interaction with this signaling pathway. Intrathecal treatment with capsaicin (for desensitization of C fibers) does not alter the mechanical hyperalgesia induced by IP and ablation did not influence the analgesic effect of MECb. Finally, MECb caused no sedative effects or alterations on motor activity of the animals in the open field test and the prolonged treatment did not promote macroscopic changes in important organs (liver, heart, spleen, kidneys and lungs), or changes in hematological and biochemical parameters (glucose, urea, creatinine, uric acid, AST, ALT, GGT, total cholesterol, HDL and LDL), and did not change the profile of food and water intake. Taken together, the results show that the antinociceptive effect of MECb is due, in part, by activation of the opioid system and inhibition of glutamatergic system, pro-inflammatory cytokines and TRPV1 and ASICs channels, as well as the PLC/PKC and/or cAMP/PKA signaling-dependent inhibition. Thus, the results of this study support that Condalia buxifolia has potential effect on pain control, and the continuity of extensive preclinical and clinical studies for the development of an analgesic phytoterapic. / A planta medicinal Condalia buxifolia tem sido tradicionalmente utilizada para o tratamento de processos inflamatórios. O presente estudo tem como objetivo avaliar o perfil fitoquímico e o efeito antinociceptivo do extrato metanólico da casca da raiz de Condalia buxifolia (EBMCb) em modelos de dor aguda, bem como investigar o possível mecanismo adjacente a este efeito em camundongos. A análise fitoquímica do extrato evidenciou a presença de grande quantidade de alcaloides. O EBMCb administrado 1 hora antes dos experimentos por via intragástrica (100 e 300 mg/kg, i.g.), reproduzindo a via utilizada em seres humanos (oral), promoveu redução da nocicepção de origem inflamatória (2ª fase) induzida pela injeção intraplantar (i.pl.) de formalina e do edema de pata, sendo que seu efeito antiedematogênico e antinociceptivo perdurou por até 4 e 6 h após a sua administração. O EBMCb (10-300) também preveniu a nocicepção induzida pela injeção intraperitoneal de ácido acético. Ademais, o EBMCb (100 mg/kg, i.g.) preveniu a nocicepção e edema de pata induzido pela injeção i.pl. de capsaicina, salina ácida e a nocicepção induzida pela injeção i.pl. de glutamato. Centralmente, o EBMCb atuou aumentando a latência ao estimulo nociceptivo no modelo de placa quente. Aliado a este resultado foi demonstrado que o sistema opióide está envolvido no mecanismo de ação do EBMCb, uma vez que seu efeito (na dose de 300 mg/kg, i.g.) foi revertido pela naloxona (antagonista de receptores opióides). O tratamento agudo (prolongado) com o EBMCb (100 mg/kg, i.g.) preveniu a hiperalgesia mecânica e térmica (calor) causada pela incisão plantar (IP), um modelo de dor pós-operatória; bem como preveniu o aumento das concentrações de citocinas inflamatórias [interleucina 1-β (IL-1 β), fator de necrose tumoral-α (TNF- α)] e do fator de crescimento do nervo (NGF). Adicionalmente, o EBMCb foi capaz de prevenir a nocicepção induzida pelos ativadores da via PLC/PKC e AMPc/PKA, como o PMA e a forscolina e PGE2. Além disso, o EBMCb também foi capaz de reduzir a ativação da PKA, demonstrada por análise do conteúdo da proteína fosforilada, sugerindo que o EBMCb possa agir por interação com essa via de sinalização. Também foi demonstrado que o tratamento intratecal com capsaicina (para dessensibilização das fibras C), não alterou a hiperalgesia mecânica induzida pela IP e que a ablação não influenciou no efeito antinociceptivo do EBMCb. Finalmente, o EBMCb não causou efeitos sedativos ou alteração na atividade locomotora dos animais no teste do campo aberto e o tratamento prolongado não promoveu alterações macroscópicas nos órgãos vitais (fígado, coração, rins e pulmões), nem alterações no hemograma e de parâmetros de bioquímica sanguínea (glicemia, ureia, creatinina, ácido úrico, AST, ALT, GGT, colesterol total, HDL e LDL), bem como não mudou o perfil de ingesta de água e ração. Tomados em conjunto, os resultados demonstram que o efeito antinociceptivo do EBMCb se deve, em parte, pela ativação do sistema opióide e inibição do sistema glutamatérgico, de citocinas pró-inflamatórias e de canais TRPV1 e ASICs, bem como da inibição da sinalização dependente da PLC/PKC e/ou AMPc/PKA. Assim, os resultados do presente estudo evidenciam o potencial efeito de Condalia buxifolia no controle da dor, bem como a continuidade de estudos pré-clínicos aprofundados, e futuramente clínicos, visando o desenvolvimento de um fitoterápico analgésico.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Riparina IV, uma alcamida sintetizada de Aniba riparia, foi testada em modelos animais padronizados de dor, bem como os possÃveis mecanismos de aÃÃo envolvidos. Foram utilizados camundongos Swiss (20-30g), e a Riparina IV foi administrada de forma aguda em todos os testes, nas doses de 25 e 50 mg/kg, por via oral. Foram utilizados os testes de contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico; placa quente; teste da formalina; hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida pela carragenina; teste da nocicepÃÃo induzida por capsaicina, cinamaldeÃdo, mentol; teste da nocicepÃÃo induzida por glutamato, bem como em modelos comportamentais que permitam excluir a possibilidade de uma atividade relaxante muscular ou induzir resultados falso-positivos nos modelos anteriores, tais como testes do campo aberto e rota Rod. Os resultados demonstraram que a Riparina IV possui uma atividade antinociceptiva no modelo de nocicepÃÃo visceral induzida por Ãcido acÃtico. A Riparina IV nÃo demonstrou atividade no modelo de nocicepÃÃo tÃrmica da placa quente. O prÃ-tratamento com a Riparina IV reduziu significativamente a nocicepÃÃo inflamatÃria induzida pela segunda fase da formalina, porÃm nÃo alterou a nocicepÃÃo neurogÃnica induzida pela primeira fase do teste da formalina. Os animais prÃ-tratados com a Riparina IV tambÃm exibiram uma reduÃÃo significativa na hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida pela carragenina. Em relaÃÃo à participaÃÃo dos receptores de potencial transitÃrio (TRP), a Riparina IV demonstrou atividade nos modelos de nocicepÃÃo induzida pela administraÃÃo de capsaicina e mentol, porÃm nÃo apresentou atividade na nocicepÃÃo induzida por cinamaldeÃdo. TambÃm reduziu a nocicepÃÃo induzida pela administraÃÃo intraplantar de glutamato. Para o estudo dos mecanismos de aÃÃo da Riparina IV foi utilizada somente a dose de 50 mg/kg da substÃncia. Na avaliaÃÃo da participaÃÃo dos canais de potÃssio ATP-dependentes, o prÃ-tratamento com glibenclamida nÃo foi capaz de reverter a aÃÃo antinociceptiva da Riparina IV, descartando-se o seu envolvimento; da mesma forma, o prÃ-tratamento com ioimbina, um antagonista α2-adrenÃrgico, e pCPA, um depletor das reservas de serotonina, tambÃm nÃo foram capazes de reverter tal aÃÃo, nÃo havendo envolvimento com o mecanismo de aÃÃo da Riparina IV. O prÃ-tratamento com L-arginina, um precursor do Ãxido nÃtrico, reverteu a aÃÃo antinociceptiva da Riparina IV, sugerindo, em parte, a participaÃÃo da via do Ãxido nÃtrico no seu mecanismo de aÃÃo. Os resultados mostraram que essa substÃncia nÃo alterou a atividade locomotora no teste do campo aberto, nem diminuiu o nÃmero de quedas no teste do rota Rod, descartando a possibilidade de haver sedaÃÃo ou incoordenaÃÃo motora por parte da Riparina IV. Em sÃntese, os resultados demonstraram que a Riparina IV possui uma atividade em modelos animais de nocicepÃÃo, possivelmente envolvendo os receptores TRPV1, TRPM8, glutamatÃrgicos e a via do Ãxido nÃtrico. / Riparin IV, an alkamide synthesized from Aniba riparia, was tested in standard animal models of pain, as well as the possible mechanisms of action involved. It was used Swiss mice (20-30g), and Riparin IV was administred acutely in all tests, at the doses of 25 and 50 mg/kg, by gavage. It was used the tests of abdominal writhing induced by acetic acid, hot plate test, formalin test, mechanical hypernociception induced by carrageenan, nociception test induced by capsaicin, cinnamaldehyde and menthol, nociception test induced by glutamate, as well as models of behavior that ruled out the possibility of a muscle relaxing activity or induce false-positive results in previous models, such as the open field test and the rota Rod test. The results showed that Riparin IV has an antinociceptive activity at the model of visceral nociception induced by acetic acid. Riparin IV did not show any activity at the hot plate thermal nociception model. Pretreatment with Riparin IV reduced significantly the inflammatory nociception induced at the second phase of formalin test, but did not alter the neurogenic nociception induced at the first phase of formalin test. The animals pretreated with Riparin IV also exhibited a significant reduction at the mechanical hypernociception induced by carrageenan. Related to the participation of the Transient Potential Receptors (TRP), Riparin IV showed an activity at the models of nociception induced by capsaicin and menthol, but did not show any activity at the nociception induced by cinnamaldehyde. Also reduced the nociception induced by administration of glutamate at the rind paw. To study the mechanisms of action of Riparin IV, it was used only the dose of 50 mg/kg of the substance. At the evaluation of participation of the ATP-dependent potassium channels, pretreatment with glibenclamide was not able to reverse the antinociceptive action of Riparin IV, discharging its involvment; at the same way, pretreatment with yohimbine, an a2-adrenergic antagonist, and pCPA, a depletor of the serotonin reservations, were not able of reverse such action, not having any involvement with the mechanism of action of Riparin IV. Pretreatment with L-arginine, a precursor of Nitric Oxide, reversed the antinociceptive action of Riparin IV, suggesting, in part, the participation of nitric oxide pathway at the mechanism of action. The results showed that this substance did not alter the locomotor activity at the open field test, neither diminished the number of falls at the rota Rod test, discharging the possibility of sedation or incoordination by Riparin IV. In summary, the results showed that Riparin IV has an action in animal models of nociception, possibly involving the receptors TRPV1, TRPM8, glutamatergic receptors and the nitric oxide pathway.

A técnica de Mobilização Neural (MOB) é um método não invasivo que demonstrou tanto na pesquisa básica, como na pesquisa clinica ser eficaz na redução da sensibilidade à dor. O presente, estudo visa examinar os efeitos da MOB na disfunção locomotora, na força muscular, nas alterações morfológicas no nervo isquiático e nas alterações moleculares induzida pela constrição crônica (CCI) do nervo isquiático de ratos Wistar. Para analisar a disfunção locomotora utilizamos o índice funcional do nervo Isquiático (IFC). Para analisar a força muscular, o sistema Biopac System. A ultraestrutura do nervo foi analisada pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão e as alterações moleculares por meio de ensaios de Western blot. Ao finalizarmos os tratamentos com MOB os animais foram eutanasiados e os tecidos como, nervo isquiático, gânglios das raizes posteriores (DRG L4-L6) e Susbtância Cinzenta Periaquedutal (PAG) foram retirados. Os DRG´s foram processados pela técnica de Western Blot para a detecção da substância P (SP), receptor de potencial transitório vanilóide tipo I (TRPV1) e receptores opióides dos tipos µ (MOR), δ (DOR) e k (KOR). Com relação a PAG, analisamos somente os receptores opióides por Western Blot. Nossos resultados demonstraram uma reverção da disfunção locomotora induzida pela CCI após a MOB e aumentou 172% a força do músculo tibial anterior nos animais tratados quando comparado com os animais do grupo CCI. Nossos estudos sobre a ultraestrutura do nervo isquiático demonstraram intenso processo de degeneração Waleriana após a CCI e regeneração após a MOB. Podemos sugerir um papel importante da MOB na modulação da expressão da SP e do TRPV 1. Sobre os receptores DOR e KOR no DRG, não encontramos alterações estatísticas entre os grupos, mas observamos um aumento da expressão de MOR após a MOB. Na PAG, nós observamos uma diminuição de DOR e KOR no grupo CCI e aumento após a MOB. Por outro lado, não encontramos alterações estatíticas para o receptor MOR. Baseado nestes achados, podemos sugerir que a MOB reverte a disfunção locomotora, aumenta a força muscular, induz a regeneração do nervo isquiático, modula a SP e TRPV 1 e aumentou a expressão de MOR no DRG´s. Sugerimos ainda que, a analsegia induzida pela técnica de MOB possa ter um envolvimento também com o sistema inibitório descendente de dor resultando na inibição da transmissão do estímulo nociceptivo aferente e assim, diminuindo a dor neuropática devido influência da MOB sobre os opióides na PAG. / Neural mobilization technique (MOB) is a noninvasive method that demonstrated to be effective in reducing pain sensitivity in both clinical and research study. The present study aims to examine the effects of MOB in locomotors dysfunction, muscle strength, morphological changes in sciatic nerve and molecular changes induced by chronic constriction (CCI) of the sciatic nerve in Wistar rats. To analyze locomotors dysfunction we used the Sciatic nerve functional index (SFI). To analyze muscle strength, was used Biopac System. The nerve morphology was analyzed using electron microscopy and molecular changes through western blot assays. After MOB treatments, animals were euthanized and tissues such as, sciatic nerve, the posterior root ganglions (DRG L4-L6) and substance periaqueductal gray (PAG) were removed. The DRG were processed by western blot for detection of substance P (SP), transient receptor potential vanilloid type I (TRPV1) and opioids receptors (MOR, DOR, KOR). Regarding PAG, we analyze only opioids receptors. Our results demonstrated a full reversal of locomotors dysfunction-induced by CCI after MOB treatment and an increase of 172% on maximal tetanic muscle strength in animals treated with MOB when compared to the CCI group. Our studies on photomicrography of sciatic nerve showed an intense Wallerian degeneration process in CCI animals and an intense regeneration of myelinated fibers. In western blot assays, we identified, in DRG, an increase of SP and TRPV1 expression after CCI and a decrease of optical density after MOB treatment. Regarding opioid receptor, we did not identify statistical changes on DOR and KOR in DRG, but we observed an increased expression of MOR in CCI after MOB treatment group. In PAG analyses, we observed a decrease in DOR and KOR expression after MOB treatment when compare with CCI animals. On the other hand, we did not identify any changes on MOR receptor. Based on our findings, we suggest that treatment with neural mobilization technique it is able to reverses the locomotors dysfunction and increases maximum tetanic force of the tibialis anterior muscle after CCI. Furthermore, the same treatment was also able to induce a severe regeneration in the sciatic nerve after treatment. Still, we can suggest an important role of MOB in modulating SP and TRPV 1 expression. We suggest that antinociceptive effect induced by MOB technique can also be involved with descending pain inhibitory system resulting in inhibition of the transmission of afferent nociceptive stimulus and thereby reducing neuropathic pain because of the influence of MOB opioids in the PAG.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Protium heptaphyllum March (Burseraceae), a medicinal plant commonly found in the Amazon and in the Northeast regions of Brazil, releases an oil-resin rich in pentacyclic triterpenes, such as the binary mixture of alpha- and beta- amyrin, that manifests antiinflamatory, antinociceptive and gastroprotective properties. This work was aimed to evaluate the antinociceptive effect of the alpha- and beta- amyrin mixture in the cyclophosphamide (400 mg/kg), acetic acid (0,6%, 10mL/kg, i.p.) and mustard oil-induced visceral nociception models in mice and to establish the likely mechanism(s) of action. In the cyclophosphamide-induced visceral pain model, pretreatment of mice with triterpene mixture at the oral doses of 10, 30 and 100 mg/kg significantly reduced (p<0.001) the pain-related behavioral expression time (59,7; 75,5 e 92,3%, respectively, versus the cyclophosphamide-treated group 12,25 +/- 2,98 min) in a dose-dependent manner. Suppression of visceral painârelated behaviors was also evidenced to the triterpenoid mixture (10 mg/kg) in the intraperitoneal acetic acid- and intracolonically injected mustard oil-induced test models of visceral nociception 50,4% e 61,1%, respectively compared to the acetic acid-treated group (42,33 +/- 3,78 abdominal constrictions/20 min) in the writhing test and to the control in the mustard oil (0,75%, 50 mcL/animal) experiment (39,28 +/- 3,26). In these tests, the maximal suppression of visceral pain was observed at 10 mg/kg. The possible mechanisms involved in the antinociceptive action of alpha- and beta- amyrin (10 mg/kg) were analyzed in the mustard oil-induced visceral pain model. In the evaluation of the opioid receptor involvement, both the triterpene mixture and morphine (5 mg/kg, s.c.) effectively inhibited (p<0.001) the number of pain-related behaviors, which could be significantly reversed by pretreatment of animals with an opioid antagonist naloxona (2mg/kg, i.p.), suggesting the opioid participation in the alpha- and beta- amyrin mechanism of action. In the study of the alpha2-adrenoreceptor involvement, the triterpene mixture as well as clonidine (0.1 mg/kg, i.p.), a known alpha2 agonist, inhibited (p<0.001) the nociceptive behavioral expression. However, when the animals were pretreated with yohimbine, an alpha2-adrenoreceptor antagonist, only the inhibitory action of clonidine was reversed, suggesting the non-participation of alpha2- adrenoreceptor in the antinociceptive action of alpha- and beta- amyrin. In the evaluation of TRPV1 receptor involvement, mice pretreated with either the alpha- and beta- amyrin, ruthenium red, a TRPV1 non-competitive antagonist, (3 mg/kg, s.c.) or their combination induced a significant and similar inhibition (p<0.001) of the number of nociceptive behaviors. The degree of inhibition with no potentiation or antagonism suggests that alpha- and beta- amyrin may act as a TRPV1 non-competitive antagonist, like ruthenium red. In order to evaluate a possible sedative, motor impairment and motor incoordination effects related to alpha- and beta- amyrin, the penthobarbitone-induced sleeping time, open-field and rota-rod tests were performanced, respectively. The data indicated that the treatment of animals with the alpha- and beta- amyrin mixture (10 mg/kg) was unable to cause sedation, motor impairment or motor incoordination effects (p>0.05), being even able to reverse (p<0.05) a mustard oil-induced motor impairment in the open field test. The results taken together strongly suggest the therapeutic potential of alpha- and beta- amyrin in oblitering visceral nociception through the mechanisms that involve the opioids and TRPV1 receptors. / O Protium heptaphyllum March. (Burseraceae), uma planta medicinal encontrada na regiÃo AmazÃnica e Nordeste do Brasil, produz uma resina rica em triterpenos pentacÃclicos, como a mistura binÃria alpha- e beta- amirina, que apresentam atividade antiinflamatÃria, gastroprotetora e antinociceptiva. Este trabalho objetivou investigar a atividade antinociceptiva de alpha- e beta- amirina em modelos de dor visceral induzida por ciclofosfamida, Ãcido acÃtico e Ãleo de mostrada em camundongos, alÃm dos possÃveis mecanismos de aÃÃo envolvidos. No modelo de nocicepÃÃo visceral induzida por ciclofosfamida (400 mg/kg, i.p.), a mistura de triterpenos nas doses de 10, 30 e 100 mg/kg, v.o., reduziu (p<0,001) de forma dose-dependente o tempo de expressÃo dos comportamentos relacionados à dor visceral (59,7; 75,5 e 92,3%, respectivamente, versus o controle ciclofosfamida 12,25 +/- 2,98 min). Realizou-se o estudo nos modelos de contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico (0,6%, 10mL/kg, i.p.) e dor visceral induzida por Ãleo de mostarda (0,75%, 50 mcL/animal) intracolÃnico. Os resultados indicaram uma inibiÃÃo do nÃmero de comportamentos de dor expressos pelos animais, sendo o maior nÃvel de inibiÃÃo (p<0,001) encontrado na dose de 10 mg/kg da alpha- e beta- amirina 50,4% e 61,1% comparados respectivamente ao controle Ãcido acÃtico (42,33 +/- 3,78 contorÃÃes/20min) no teste de contorÃÃes abdominais e ao controle Ãleo de mostarda (39,28 +/- 3,26) no modelo de dor visceral por Ãleo de mostarda. Para o estudo do possÃvel mecanismo de aÃÃo de alpha- e beta- amirina foi utilizada a dose de 10 mg/kg da mistura de triterpenos no modelo de nocicepÃÃo por Ãleo de mostarda. Na avaliaÃÃo da participaÃÃo do sistema opiÃide, a mistura dos triterpenos e a morfina (5 mg/kg, s.c.) inibiram significativamente (p<0,001) o nÃmero de comportamentos de dor expressos, havendo uma reversÃo da antinocicepÃÃo (p<0,05) quando prÃ-tratados com naloxona (2 mg/kg, i.p.), sugerindo a participaÃÃo opiÃide no mecanismo da alpha- e beta- amirina. No estudo do envolvimento do sistema adrenÃrgico, a mistura de triterpenos e a clonidina (0,1 mg/kg, i.p.), um agonista alpha2-adrenÃrgico, inibiram (p<0,001) a expressÃo dos comportamentos nociceptivos. PorÃm, com o prÃ-tratamento com ioimbina, um antagonista alpha2, houve reversÃo (p<0,05) da antinocicepÃÃo induzida pela clonidina, mas nÃo da alpha- e beta- amirina, sugerindo o nÃo envolvimento deste receptor na antinocicepÃÃo da mistura de triterpenos. No estudo do envolvimento do receptor TRPV1, o prÃ-tratamento dos animais com alpha- e beta- amirina, vermelho de rutÃnio (3 mg/kg, s.c.), um antagonista nÃo competitivo deste receptor, ou com a combinaÃÃo da mistura de triterpenos com vermelho de rutÃnio, houve uma inibiÃÃo (p<0,001) semelhante, para todos os tratamentos, dos comportamentos de dor. A nÃo potencializaÃÃo, ou antagonismo, do efeito antinociceptivo de alpha- e beta- amirina pelo vermelho de rutÃnio sugere que a mistura atue como um antagonista nÃo-competitivo TRPV1. Para avaliar a existÃncia de um efeito sedativo, de um impedimento locomotor ou de uma incoordenaÃÃo motora, foram utilizados os testes do tempo de sono induzido por pentobarbital, teste do campo aberto e o teste do rota rod, respectivamente. Os dados indicaram que o tratamento com a mistura de triterpenos (10 mg/kg) nÃo induziu (p>0,05) sedaÃÃo, impedimento locomotor ou incoordenaÃÃo motora nos animais, sendo ainda capaz de reverter (p<0,05) o impedimento locomotor induzido pelo Ãleo de mostarda no teste do campo aberto. Em conjunto os dados revelaram a efetividade da mistura de alpha- e beta- amirina em modelos de nocicepÃÃo visceral possivelmente envolvendo receptores opiÃides e TRPV1.