Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La angiogénesis es la generación de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Fisiológicamente, se produce sólo en casos excepcionales (inflamación crónica, ciclo menstrual, cicatrización, etc.), y es un mecanismo fundamental para el crecimiento de un tumor, desde los 2 mm3. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. CRT humana (HuCRT) y su dominio N- terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis, inhibiendo así la proliferación de células endoteliales. Anteriormente, en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), se ha descrito que CRT de Trypanosoma cruzi (TcCRT) es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo (CAM). Estas propiedades también son expresadas por TcCRT y su dominio N-terminal, en ensayos ex vivo e in vitro, en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies de mamíferos, Rattus rattus y Homo sapiens sapiens. Este efecto se correlaciona, en experimentos in vitro, con la inhibición de la morfogénesis capilar, la proliferación y la migración de las células endoteliales y con la internalización de TcCRT por estas células, también descrito en el LIAM. El objetivo general de este estudio fue validar los resultados antiangiogénicos de TcCRT obtenidos in vivo en aves, así como los generados in vitro y ex vivo, con varias especies de mamíferos, usando ahora un ensayo in vivo en un modelo mamífero. Esto se basa en la posibilidad de que las moléculas que regulan la angiogénesis pueden actuar de forma diferente en diferentes especies. Matrigel es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Entre los ensayos in vivo descritos para medir la angiogénesis, está el ensayo de tapón de Matrigel, que se utilizó en esta investigación, que se basa en la siguiente hipótesis: Dadas las propiedades antiangiogénicas que TcCRT expresa en una variedad de ensayos in vitro, ex vivo, en células mamíferas y, también in vivo en aves, entonces, TcCRT inhibirá la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en mamíferos (Mus musculus). Los objetivos específicos para satisfacer esta hipótesis, fueron: 1. Estandarizar el ensayo de tapón de Matrigel in vivo para medir angiogénesis, 2. Estandarizar la concentración de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) por tapón de Matrigel, 3. Determinar la presencia de TcCRT recombinante (rTcCRT) y HuCRT recombinante (rHuCRT) en extracto proteico de tapones de Matrigel, y 4. Cuantificar el efecto de rTcCRT y rHuCRT sobre la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en ratón. 500μl de Matrigel, que contiene 300ng de bFGF (para promover la infiltración de células endoteliales), fueron inoculados por vía subcutánea a ratones C57BL/6. Siete días más tarde, fue posible diseccionar y analizar los tapones, tanto inmunológica e histológicamente. Además, los anticuerpos mono y policlonales, anti-TcCRT y anti- HuCRT reconocieron las proteínas recombinantes en extracto proteico de tapón de Matrigel. rHuCRT y rTcCRT inhibieron la proliferación de células endoteliales promovido por bFGF en los tapones de Matrigel. En síntesis, se demostró que TcCRT inhibe la migración de células endoteliales a una matriz fisiológica semisólida, tal como el Matrigel ubicado subcutáneamente en ratones. Dado que la migración de células endoteliales es un pre-requisito para la morfogénesis capilar, es muy probable que este ensayo se correlacione con la capacidad de inhibición que la molécula parasitaria ejerce in vivo sobre el crecimiento tumoral. Este es el primer estudio que define un efecto antiangiogénico para la calreticulina parasitaria, in vivo en mamíferos. Aun cuando, más indirectamente, este efecto podría correlacionarse con las propiedades antitumorales de T. cruzi, reportadas por otros laboratorios, y recientemente confirmadas en el LIAM

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es producida por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es endémica en Chile y tiene una compleja diversidad genética (enumeradas de TcI a TcVI) con distintas características clínicas y ecogeográficas. Se analizaron 164 muestras de sangre de 9 especies de micromamíferos silvestres (Abrocoma bennetti, Abrothrix longipilis, Abrothrix olivaceus, Octodon sp, Oligorizomys longicaudatus, Phyllotis darwini, Rattus norvegicus, Rattus rattus y Thylamys elegans) infectados por este protozoo, provenientes de 6 localidades de la zona centro-norte de Chile. Se utilizó la técnica de DNA blot con hibridación para la detección de la región hipervariable de los minicírculos del kDNA a través de sondas especificas marcadas para los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI. Los resultados fueron sometidos a análisis estadístico. TcI resultó el linaje más predominante en todas las especies de micromamíferos y en todas las localidades, seguido de TcII, TcVI y TcV respectivamente. Octodon sp y P. darwini fueron las especies más abundantes en el estudio, con un 85% de muestras positivas a la hibridación. Por otro lado, Til-Til (Región Metropolitana) fue la localidad con mayor número de hibridaciones positivas y mayor cantidad de infecciones mixtas, lo cual fue confirmado estadísticamente con el test de Fisher. En último lugar, se obtuvieron casi cuatro veces más hibridaciones positivas e infecciones mixtas en muestras provenientes de la temporada de invierno, lo cual también fue estadísticamente significativo. Este estudio confirma la presencia de los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI en la zona centro-norte de Chile, demostrando por primera vez una gran proporción de infecciones mixtas y únicas en la temporada de invierno, así como en las especies Octodon sp y P. darwini, y especialmente en la localidad de Til-Til, donde se analizan sus posibles causas y efectos / Proyectos Fondecyt 1100339 y 1120122

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Química / Gracias al descubrimiento de las aplicaciones anticancerígenas del cisplatino, el interés por estos compuestos y sus propiedades ha aumentado, dando altas expectativas en la farmacéutica. En esta tesis se propuso que complejos de paladio, platino o rutenio poseen una acción doble, antineoplásica y tripanocida, a través de la presencia de dos ligandos bioactivos diferentes: 5 nitrofurano derivados de tiosemicarbazonas y PTA (1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano). Para verificar esta posibilidad, se realizaron estudios fisicoquímicos y biológicos de los complejos, entregando alentadores resultados. En voltametría cíclica se observó una disminución en el potencial medio de la generación del radical nitro, lo que se traduce en una facilidad en generar dicho radical. En el estudio por espectroscopía de resonancia de espín electrónico, se caracterizó los complejos, siendo los de paladio y platino los de menor deslocalización, comparado con los de rutenio. Con respecto a los estudios biológicos, estos mostraron que ciertos complejos presentan un valor de IC50 inferior al del ligando libre contra tripomastigotes y células neoplásicas, sin afectar su selectividad. Por otra parte, también se realizaron estudios de inhibición de cruzipaína e inducción de apoptosis. Aunque la inhibición de cruzipaína no fue significativa, se observó una tendencia que correlaciona con los demás resultados. Además, los complejos estudiados mostraron resultados que sugieren una muerte celular por inducción de apoptosis, lo que los hace atractivos como potenciales antineoplásicos / Thanks to the studies of the anticancer applications of cisplatin, the interest in these compounds and their properties has increased significantly, delivering high expectations for pharmacopeia. In this thesis it is proposed that complexes of palladium, platinum and ruthenium have a double action, antineoplastic and trypanocidal, by the presence of two different bioactive ligands: 5 nitrofuryl, a thiosemicarbazone derivate and PTA (1,3,5-triaza-7-phosphaadamantane). To verify this possibility, physicochemical and biological studies were performed on the complexes, providing encouraging results. In cyclic voltammetry studies, the results showed a decrease in the half potential of the nitro radical generation, which in turns translates in an easy production of that radical. In the studies of palladium and platinum complexes the electron paramagnetic resonance spectroscopic studies showed that the radical was more localized that ruthenium. With regard to biological studies, they showed that certain complexes, presented an IC50 value lower than the free ligand against trypomastigotes and neoplastic cells, without affecting its selectivity. Although cruzipain inhibition was not significant, a trend was observed that correlates with the other results. Moreover, the results obtained for the complexes studied in this work suggest cellular death by apoptosis induction. This makes these compounds particularly attractive as potential antineoplastic agents / Conicyt; Mecesup

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / La calreticulina recombinante de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) aplicada tóipicamente es más efectiva que su contraparte humana en inducir proliferación y migración fibroblástica in vitro, correlacionándose con los efectos in vivo de esta proteína, la cual estimula un cierre acelerado de heridas en piel de ratas. Para estudiar una de las posibles vías por la cual podría ocurrir este proceso, se analizó la influencia directa de rTcCRT sobre la diferenciación a fibroblastos a partir de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) subcutáneo, adyacente a la herida. Para esto, se propuso detectar la expresión de genes fibrogénicos específicos en ADSC, en presencia de rTcCRT, in vitro. Las ADSC de rata fueron aisladas y cultivadas para comprobar el potencial multilinaje a linaje osteogénico, adipogénico y fibrogénico. La diferenciación a cada linaje a través de tinción histoquímica y RT-PCR, a las cuatro semanas. Por otro lado, se cultivaron ADSC en medio de cultivo suplementado con rTcCRT para observar el potencial efecto diferenciador a fibroblastos. Su detección se realizó a través tinción tricrómica de Mallory luego de cuatro semanas, revelando la presencia de fibras colágenas, con patrones similares a aquellos obtenidos en los controles positivos de fibroblastos dérmicos de rata. Se utilizó RT-PCR para identificar la expresión de genes fibrogénicos, mostrando una significativa expresión de genes fibrogénicos en las ADSC suplementadas con rTcCRT y una expresión no detectable en las ADSC control sin suplementar. / Recombinant Trypanosoma cruzi calreticulin (rTcCRT) topically applied is more efficient than its human counterpart on its capacity to increase fibroblastic proliferation and migration in vitro, and correlates with an accelerated rat skin wound healing process in vivo. To study one of the possible pathways by which this process occurs, the direct influence of rTcCRT in the differentiation to fibroblasts of the subcutaneous population of rat adipose derived stem cells (ADSC) surrounding the wound, was analyzed. For this purpose, we detected the expression of specific fibrogenic genes in rTcCRT-supplemented ADSC, in vitro. Rat ADSC were obtained and cultured to analyze their multilineage potential to osteogenic, adipogenic and fibrogenic lineages. The differentiation was detected through histological staining and RT-PCR, after four weeks of culture. On the other hand, ADSC were cultured in supplemented growth medium supplemented with rTcCRT to observe the fibroblast differentiation-effect. The detection was accomplished by Mallory's trichrome staining direct histology after four weeks of culture, revealing the presence of collagen fibers with similar staining patterns to those obtained with rat skin fibroblasts primary cultures as positive controls. RT-PCR was also used to identify the expression of fibrogenic genes, showing significative expression of fibrogenic genes in the rTcCRT-supplemented ADSC and no detectable expression in ADSC negative control cultures. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1130257 y Proyecto U-INICIA 2036.

The unicellular eukaryote Trypanosoma brucei causes African Sleeping sickness and multiplies extracellularly in the bloodstream of the infected host. The parasite evades antibody-mediated lysis by switching its Variant Surface Glycoprotein (VSG) coat. Blocking VSG synthesis results in an abrupt growth inhibition and a precise pre-cytokinesis cell cycle arrest, with an accumulation of cells with two nuclei and two kinetoplasts. Additionally, induction of VSG RNAi triggers a global block in translation, which is not due to a general decrease in transcript levels. The mechanism behind this translation arrest was investigated. It was observed that it correlated with a decrease in polysomes, indicating that translation was blocked at the level of initiation. It was also shown that the VSG RNAi-triggered growth inhibition was reversible, which suggests that this is not a lethal phenotype. The VSG221 RNAi-induced growth arrest could be alleviated if a second different VSG (VSG117), which was not recognised by the VSG221 RNAi, was expressed immediately downstream of the promoter of the active VSG221 Expression site. Further, it was possible to delete the telomeric VSG221 in these VSG double-expressors, leaving the cells completely reliant on the second complementing VSG117 gene. VSG117 expressed from a promoter-adjacent position in the active Expression site was shown to form a functional surface coat that protected the parasites from complement-mediated lysis in vitro. Transiently transfecting cells with anti-VSG221 morpholino oligonucleotides allowed us to specifically block translation of VSG221 mRNA without degrading it. This resulted in a pre-cytokinesis cell cycle arrest similar to that induced by VSG221 RNAi. This indicates that the VSG RNAi-triggered growth inhibition was due to a lack of VSG protein or its synthesis rather than the ablation of the abundant VSG mRNA. In addition, it was shown that blocking VSG synthesis reduced the rate of surface VSG internalisation in cells that were stalled precytokinesis, but had no effect on other endocytic markers. These experiments give us further insight into the importance of the protective VSG coat for pathogenicity in T. brucei.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, como agente etiológico de la enfermedad de Chagas, es uno de los principales problemas de salud pública en diversos países latinoamericanos. De acuerdo con la Organización Panamericana de la Salud (OPS), existirían alrededor de 18 millones de personas infectadas en el continente. A su vez, la Organización Mundial de la Salud (OMS) indica que en el cono sur alrededor de 50 millones de personas están expuestas al riesgo de infectarse. El conocimiento de la magnitud de la infección chagásica, su repercusión sobre la salud y la economía de los países latinoamericanos, varía grandemente, en especial, sus formas clínicas. La caracterización genética de las variedades de T. cruzi es de suma importancia, debido a la considerable heterogeneidad genética y biológica en las poblaciones de este parásito. Se han descritos previamente dos linajes filogenéticos importantes, ambos muy heterogéneos; T.cruzi I y T.cruzi II. En la presente memoria se han caracterizado nueve cepas a través de la secuenciación del gen para citocromo b y su posterior análisis filogenético, el cual se realizó junto al total de cepas descritas en GenBank para citocromo b de T. cruzi. Los resultados obtenidos muestran una topología que divide las diferentes cepas en tres Clados principales (Clado A, B y C), lo cual reafirma resultados obtenidos en diversos estudios previos. Las muestras chilenas se distribuyen en los tres clados, pero principalmente en el Clado A, cuyas cepas están clasificadas como T. cruzi I según la nomenclatura internacional

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se infectaron dos grupos de ratones de la cepa Balb/c, de dos y ocho meses de edad con 2000 tripomastigotes sanguíneos del clon Dm28c de Trypanosoma cruzi. Los resultados mostraron que este modelo, una vez transcurrido los 4 meses post infección, provoca un 100% y 60% de mortalidad en los ratones de dos y ocho meses de edad, respectivamente. El nivel máximo de parasitemia alcanzado por el grupo de mayor edad fue de 3,2 x 105 parásitos/mL, mientras que la máxima parasitemia en los ratones de menor edad fue de 5,1 x 105 parásitos/mL. A nivel histopatológico en los ratones de ocho meses las mayores alteraciones se localizaron en tejido cardiaco, y se observó que al transcurrir el tiempo de infección, en estas lesiones se inducían fenómenos de reparación. Por otro lado, en los ratones de dos meses las mayores alteraciones se ubican en músculo esquelético y no se observó ningún tipo de reparación en el tejido dañado. Estas diferencias observadas dentro de una misma cepa de ratón nos indica que la edad sería un factor importante en el desarrollo de la infección con T. cruzi, puesto que se ha postulado que la muerte del animal sería el resultado de la activación de mecanismos autoinmunes y probablemente al disminuir la efectividad del sistema inmune con la edad, se favorecería la supervivencia de los animales infectados de mayor edad

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Enfermedad de Chagas, o tripanosomiasis americana, es causada por el parásito protozoario intracelular Trypanosoma cruzi, transmitido por insectos vectores pertenecientes al orden Hemíptera, familia Reduviidae, género Triatoma. Se estima que en la actualidad hay aproximadamente quince millones de personas infectadas por T. cruzi en Latino América, incluido Chile. En nuestro país, la zona endémica se extiende desde la Región de Arica y Parinacota (XV) hasta la Región del Libertador General Bernardo O’Higgins (VI), siendo consideradas hiperendémicas las regiones de Atacama (III) y Coquimbo (IV). Vectores triatominos procedentes de las distintas regiones podrían ser portadores de diferentes clones de T. cruzi debido, posiblemente, a un proceso de selección de clones del parásito que triatominos de las distintas zonas geográficas podrían albergar. Este hecho favorecería la aparición de diferencias genéticas entre los clones, estructurándose así distintas poblaciones de T. cruzi en vectores de regiones diferentes. Actualmente, las poblaciones de T. cruzi se agrupan en seis unidades de tipificación discreta (DTUs) o linajes, denominados TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV y TcVI, los cuales se podrían comportar de un modo distinto en el hospedero humano, como ya se ha sugerido respecto de su infectividad. Con el fin de aportar información al conocimiento de la estructura poblacional de T. cruzi, el objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar genotípicamente los clones del parásito presentes en el contenido intestinal de vectores Triatoma infestans provenientes de tres regiones endémicas de Chile. Se utilizaron métodos de genética de poblaciones y tres marcadores microsatélites para analizar 109 muestras de poblaciones de T. cruzi obtenidas de 21, 62 y 26 triatominos, provenientes de las regiones de Atacama (III), Valparaíso (V) y Metropolitana (RM), respectivamente. Estos triatominos fueron colectados por el Programa de Erradicación de la Infestación Domiciliaria de T. infestans, llevado a cabo por el Ministerio de Salud de Chile durante el periodo 2005-2007. El 56,8% de las poblaciones de T. cruzi analizadas estaba compuesto por uno (33%) o dos clones (23,8%) y, estas últimas fueron mayoritarias entre las muestras multiclonales. Respecto del linaje, los más frecuentemente detectados fueron TcI y TcIII, en el total de muestras analizadas. Ademas, los resultados obtenidos en este estudio indicaron que las poblaciones de T. cruzi presentes en triatominos de las tres regiones de Chile eran genéticamente diferentes en base a sus frecuencias alélicas. Así, los resultados de este trabajo sugieren que el ciclo de transmisión de T. cruzi y el intercambio genético entre sus poblaciones se habría limitado posiblemente por una disminución de su tamaño poblacional debido al Programa de Erradicación de la Infestación Domiciliaria de T. infestans / FONDECYT N° 1070837

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se compararon los partidores kinetoplastídicos (121-122) y nucleares (Tc1-Tc2), en la detección de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en el binomio madre-recién nacido (RN). Se analizó una muestra de 40 madres chagásicas crónicas y sus RN, procedentes de Provincia de Choapa, Región de Coquimbo, de quienes se extrajo sangre periférica en pre-parto y de cordón umbilical al momento del parto, respectivamente. Las madres se seleccionaron según resultados serológicos para enfermedad de Chagas realizados en el primer trimestre del embarazo mediante Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y ELISA IgG. Se conformaron grupos de estudio en base a los resultados de PCR kinetoplastídico (PCRk) aplicado a las madres previo al parto y se aplicó PCR con partidores nucleares (PCRn) a la totalidad de madres y RN, con el fin de determinar la utilidad de estos últimos en la pesquisa de T. cruzi. Los resultados fueron analizados mediante la prueba de Mc Nemar de muestras asociadas a través del programa SRSS. Se observó que en el 82,5% de las muestras correspondientes a madres con parasitemia positiva o negativa al pre-parto con PCRk, PCRn fue positivo. Considerando sólo las madres negativas a PCRk, PCRn detectó positividad en el 65% de los casos. En los 40 RN en estudio, PCRk fue positivo en el 7,5% de los casos, mientras que PCRn lo fue en el 50%. Dos casos congénitos, confirmados mediante serología convencional antes del año de vida, fueron positivos para ambos partidores (Indice de sensibilidad PCRk y PCRn 100%; índice de especificidad PCRk 100% y PCRn 50%). Estos resultados nos permiten concluir que los partidores nucleares Tc1-Tc2, detectan en el 42,5% de la sangre de cordón de RN, hijos de madres chagásicas, una banda de 166 pb que podría corresponder a trazas de ADN de T. cruzi, evidencia que debe ser confirmada por técnicas de secuenciación y/o PCR Tiempo Real. Se concluye además, que la parasitemia materna, no sería un factor relevante en la transmisión congénita de T. cruzi, puesto que de 20 madres con parasitemia evidente antes del parto, sólo en dos casos se confirmó la transmisión. En ausencia de diagnóstico parasitológico directo en el RN, la técnica de PCR es una alternativa para el diagnóstico de Chagas congénito, no obstante, este estudio confirma que el estudio serológico posterior a los 8 meses de vida en los hijos de madres chagásicas, es la estrategia más recomendable y factible de llevar a cabo en los centros asistenciales de la zona endémica de nuestro país / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1080445, 1100768 y proyecto 06/2009 Regón Valona de Bruselas-Bélgica

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas existe desde tiempos remotos en el continente americano y constituye un problema de salud pública en países latinoamericanos. En los últimos años, la emigración masiva de personas de América Latina a otras partes del mundo ha hecho que la enfermedad se convierta en un problema mundial. El protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, corresponde al agente etiológico de esta zoonosis, que desde el punto de vista médico veterinario, afecta a animales de hábitos intra y peridomiciliarios, los cuales son un factor de mantenimiento en la transmisión vectorial. En Chile, el área de endemia de la enfermedad se extiende desde el paralelo 18° LS por el norte, hasta el paralelo 34,5º LS por el sur. La Secretaría Regional Ministerial (SEREMI) de Salud de la Región Metropolitana aplica el Programa de Control del Triatoma infestans, vector intradomiciliario del parásito de mayor importancia epidemiológica en Chile; gracias a este programa se detectó en viviendas de comunas rurales de Calera de Tango y Til Til, la presencia reiterada de ejemplares adultos de este insecto. Por ello, esta investigación planteó como objetivo principal pesquisar infección chagásica en los integrantes de estos grupos familiares y sus perros mascota. De un total de 269 personas examinadas, (159 de la comuna de Calera de Tango y 110 de Til Til), fueron confirmados cuatro casos provenientes de Til Til serológicamente positivos a T. cruzi que correspondieron a personas adultas del género masculino, cuyas edades fluctuaron entre los 33 y los 73 años. Además, fue detectada infección por T. cruzi en dos perros provenientes de esta misma comuna. Sin embargo, no existió relación de positividad a T. cruzi entre integrantes de estos grupos familiares y los perros positivos detectados / Financiado por el Instituto de Salud Pública de Chile y la Secretaría Regional Ministerial de Salud Región Metropolitana