Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc. / Salmonella Typhimurium infections represent an important threat both to the swine industry and public health since pig is also a reservoir for human infections. Multiresistance to antimicrobial agents is often associated with S. Typhimurium belonging to phage type (PT) 104, and these isolates can cause septicemia in fattening pigs. It is thus necessary to control the infection at the herd level to avoid meat contamination by these isolates. However, in order to develop more efficacious control measures, it is important to characterize isolates, better understand the pathogenesis of infection and identify virulence factors. The main objective of this study was to characterize isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine and to compare them to isolates recovered from healthy pigs. Isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine (CS) were compared to isolates recovered from healthy animals at slaughterhouses (WCS). The phage type of each isolate was identified and these isolates were characterized by antimicrobial resistance, SDS-PAGE and immunoblotting, and PFGE. Among the CS isolates, PT 104 represented 36.4% of isolates while it represented 51.5% of WCS isolates. Resistance to as many as twelve antimicrobial agents was found in isolates from CS and WCS. However, it was not possible to associate any particular protein to septicemic isolates. Multiple genetic profiles were identified among the isolates of PT 104. Different steps of the pathogenesis of Salmonella infection were evaluated, in particularly the ability to adhere to and invade intestinal epithelial cell lines by CS and WCS isolates. The isolates recovered from diseased animals invaded intestinal epithelial cell lines at a higher rate than isolates from healthy pigs (P=0.003). Some isolates were selected according to their invasion rate and some analysis, using flow cytometry were done to evaluate phagocytosis, induction of apoptosis, and adhesion to intestinal mucus. The survival in monocytes was evaluated and the MATS method was used to evaluate the bacterial surface properties, measuring interactions with solvents. Isolates from WCS were more phagocytized than isolates fom CS at 15 minutes (P=0.02). We found no significant difference for the other methods used. Using SSH, we also compared the genome of a CS isolate (#36) to that of a WCS isolate (#1), for the identification of putative virulence factors. Clones with chromosome and plasmids homology were obtained. It was therefore decided to analyze the plasmid profiles of all isolates. Two profiles (PL14 and PL20) were more frequently observed in the PT 104 isolates than in the isolates belonging to other phage types (P=0.01 and P=0.01, respectively). Various profiles were found in both isolates from septicemic pigs and those from healthy pigs. An interesting plasmid of the CS isolate was sequenced. This plasmid possesses genetic information for replication as well as a beta-galactosidase-α. It would be needed to characterize the role of these putative virulence factors in the future. Our work suggests that isolates from septicemic pigs may be distinguished from isolates from healthy pigs by their better ability to invade intestinal cells as well as by a lower rate of phagocytosis in the early steps of infection. This study increased our knowledge on the pathogeny of S. Typhimurium infection in pigs.

Les salmonelles sont l’une des premières causes d’infections bactériennes d’origine alimentaire. Depuis le début des années 1990, l’isolement de salmonelles multirésistantes aux antibiotiques a considérablement accru avec l’émergence des souches épidémiques Salmonella Typhimurium DT104 qui sont, pour la majorité, résistantes à l’ampicilline, le chloramphénicol, la streptomycine, les sulfamides et les tétracyclines. Les gènes codant ces résistances sont regroupés sur un intégron complexe de classe 1 nommé In104, localisé lui-même sur un îlot génomique de 43 kb désigné Salmonella Genomic Island 1 (SGI1). Depuis sa première identification chez S. Typhimurium DT104, SGI1 a été identifié à travers le monde chez plusieurs sérovars de Salmonella, et plus récemment chez Proteus mirabilis. Chez ces souches, la multirésistance aux antibiotiques est liée, soit à l’îlot SGI1 dans sa forme initialement décrite, soit à des variants de SGI1 correspondant à la structure initiale de SGI1 comportant des modifications au niveau de l’intégron complexe In104. L’îlot génomique Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) représente une préoccupation importante car le phénotype de multirésistance qu’il confère aux souches bactériennes est souvent responsable d’échecs thérapeutiques pouvant entrainer des complications importantes, voire la mort. Dans ce contexte, le travail de thèse a été centré sur l’enjeu sanitaire majeur représenté par cette diffusion épidémique du clone S. Typhimurium au cours des années 1990 chez l’homme et les bovins. Les travaux entrepris dans le cadre de la thèse ont eu, en premier lieu, l’objectif d’apprécier l’évolution moléculaire de SGI1 dix années après l’émergence de ces souches en élevage bovin, puis d’évaluer la diffusion de SGI1 chez des souches naturelles appartenant à d’autres genres bactériens que Salmonella. Il a ainsi été dressé un bilan de la multirésistance aux antibiotiques chez les souches de S. Typhimurium isolées de bovins malades en France de 2002 à 2007 et une recherche de la présence de SGI1, chez d’autres espèces bactériennes que Salmonella, et par sondage à partir de leurs phénotypes de résistance, a été mise en œuvre. Les résultats obtenus ont indiqué un faible pouvoir évolutif de SGI1 qui semble en contradiction avec les capacités moléculaires majeures de recombinaison et de transfert démontrées tant in vitro qu’in vivo. Les études menées ont toutefois permis la première description d’un nouveau variant, nommé SGI1-T, qui résulte d’une recombinaison intramoléculaire. Le deuxième grand objectif de la thèse a été de contribuer à une meilleure connaissance du rôle que pourrait avoir SGI1 dans la virulence bactérienne. Une première stratégie de modélisation expérimentale (salmonellose systémique murine) a ainsi été conduite, qui visait à comparer le pouvoir virulent in vivo de souches isogéniques ne se distinguant que par la présence ou l’absence de SGI1. Une seconde approche a été également menée, qui a consisté en une évaluation du rôle de SGI1 dans la formation de biofilms, l’organisation en biofilms favorisant une meilleure colonisation bactérienne, qui peut constituer à son tour un élément d’efficacité du pouvoir virulent final. Les résultats obtenus ont confirmé le rôle positif de SGI1 dans la formation de biofilms, et plus généralement son implication dans la signalisation cellulaire du Quorum Sensing. / Salmonella is a major cause of food-borne outbreaks. Since the early 1990s, isolation of multidrug-resistant Salmonella has increased with the emergence of epidemic Salmonella Typhimurium DT104 strains which are mostly resistant to ampicilin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides and tetracyclines. The genes coding these resistances are clustered on a complex class 1 integron (MDR region) located on a genomic island of 43 kb designated SGI1. Since its first identification in S. Typhimurium DT104, SGI1 has been identified worldwide in other Salmonella serotypes, and more recently in Proteus mirabilis. For these strains, multidrug resistance is conferred, either to the classical structure of SGI1, or to related variants of SGI1 corresponding to the initial structure of SGI1 with modification of the complexe integron In104. The Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) constitutes a great concern since it confers a multidrug resistance phenotype often responsible of therapeutic failures which may cause important complications, or even death. In this context, the work has been focused on the major health issue represented by the epidemic diffusion of the Salmonella Typhimurium clone in the course of 1990s in human and cattle. As a first objective, the work allowed to appreciate the molecular evolution of SGI1 in the course of time and to assess the diffusion of SGI1 to other bacterial strains than Salmonella in natural conditions. Therefore, an overview of the multidrug resistance in Salmonella Typhimurium strains isolated from diseased cattle in France from 2002 to 2007 was carried out and a screening of natural strains from other bacterial species than Salmonella that may harbor SGI1 was undertaken. The results indicated weak molecular evolutions of SGI1, which seems in contradiction with the great capability of SGI1 to recombine and transfer, as attested in vitro as in vivo. Nevertheless, this study allowed the first description of a new SGI1 variant, named SGI1-T, which is the result of intra-molecular recombination events. Another second objective of the thesis was to contribute to a better knowledge of the role of SGI1 in bacterial virulence. A strategy of experimental modeling (murine systemic salmonellosis) was first set up to compare the levels of virulence conferred by isogenic strains differing only by the presence or the absence of SGI1. A second approach was also carried out to evaluate the role of SGI1 in biofilm formation. Indeed, the organization in biofilm facilitates bacterial colonization, which constitutes in turn an element of effectiveness of the final virulence. A positive role of SGI1 in biofilm formation was demonstrated in the framework of this study, and more generally, questions the role of SGI1 in the Quorum Sensing regulation system.

Flagelina, a subunidade estrutural dos flagelos bacterianos, pode ser empregada em estratégias vacinais como carregadora de epitopos antigênicos fusionados ou como adjuvante. Neste trabalho avaliamos a imunogenicidade e o potencial vacinal das flagelinas Salmonella enterica sorovar Typhimurium em camundongos BALB/c após administração pelas vias oral ou intraperitoneal. Os resultados indicam que animais imunizados pela via oral com linhagens flageladas de S. Typhimurium não desenvolvem respostas de anticorpos, sistêmicos ou secretados, anti-flagelina, por outro lado, ativam respostas celulares específicas para as flagelinas em função da via de administração utilizada. Observamos ainda que as diferentes flagelinas testadas apresentam efeito adjuvante quando co-administradas pela via nasal com a fímbria CFA/I de ETEC. Em suma, os resultados apresentados contribuem para um melhor conhecimento sobre as propriedades imunológicas e adjuvantes das flagelinas de S. Typhimurium e agregam informações para o uso racional dessas proteínas em formulações vacinais. / Flagellin, the structural subunit of bacterial flagella, can be used in vaccine development as a fused antigenic epitope carrier or as an adjuvant. In this work we evaluated the immunogenicity and vaccine approach of S. Typhimurium flagellin in BALB/c mice after administration by oral or intraperitoneal route. Our results indicate that mice immunized by oral route with flagellated S. Typhimurium strains do not develop any anti-flagellin antibody response, be it serum or secreted. On the other hand, specific anti-flagellin cellular response was observed depending on the chosen route of immunization with S. Typhimurium attenuated strain. Furthermore, all flagellins tested proved to be efficient adjuvants when co-administrated with CFA/I fimbriae by nasal route. Together, these results contribute to a better understanding of the immunological and adjuvant properties of S. Typhimurium flagellins and also provide information on the rational use of these proteins in vaccine development.

ZUSAMMENFASSUNG Haukur Lindberg Sigmarsson PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen. Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h. sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und wenn positiv auch mittels PCR untersucht. Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten Woche post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch und wie erwartet wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc. / Salmonella Typhimurium infections represent an important threat both to the swine industry and public health since pig is also a reservoir for human infections. Multiresistance to antimicrobial agents is often associated with S. Typhimurium belonging to phage type (PT) 104, and these isolates can cause septicemia in fattening pigs. It is thus necessary to control the infection at the herd level to avoid meat contamination by these isolates. However, in order to develop more efficacious control measures, it is important to characterize isolates, better understand the pathogenesis of infection and identify virulence factors. The main objective of this study was to characterize isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine and to compare them to isolates recovered from healthy pigs. Isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine (CS) were compared to isolates recovered from healthy animals at slaughterhouses (WCS). The phage type of each isolate was identified and these isolates were characterized by antimicrobial resistance, SDS-PAGE and immunoblotting, and PFGE. Among the CS isolates, PT 104 represented 36.4% of isolates while it represented 51.5% of WCS isolates. Resistance to as many as twelve antimicrobial agents was found in isolates from CS and WCS. However, it was not possible to associate any particular protein to septicemic isolates. Multiple genetic profiles were identified among the isolates of PT 104. Different steps of the pathogenesis of Salmonella infection were evaluated, in particularly the ability to adhere to and invade intestinal epithelial cell lines by CS and WCS isolates. The isolates recovered from diseased animals invaded intestinal epithelial cell lines at a higher rate than isolates from healthy pigs (P=0.003). Some isolates were selected according to their invasion rate and some analysis, using flow cytometry were done to evaluate phagocytosis, induction of apoptosis, and adhesion to intestinal mucus. The survival in monocytes was evaluated and the MATS method was used to evaluate the bacterial surface properties, measuring interactions with solvents. Isolates from WCS were more phagocytized than isolates fom CS at 15 minutes (P=0.02). We found no significant difference for the other methods used. Using SSH, we also compared the genome of a CS isolate (#36) to that of a WCS isolate (#1), for the identification of putative virulence factors. Clones with chromosome and plasmids homology were obtained. It was therefore decided to analyze the plasmid profiles of all isolates. Two profiles (PL14 and PL20) were more frequently observed in the PT 104 isolates than in the isolates belonging to other phage types (P=0.01 and P=0.01, respectively). Various profiles were found in both isolates from septicemic pigs and those from healthy pigs. An interesting plasmid of the CS isolate was sequenced. This plasmid possesses genetic information for replication as well as a beta-galactosidase-α. It would be needed to characterize the role of these putative virulence factors in the future. Our work suggests that isolates from septicemic pigs may be distinguished from isolates from healthy pigs by their better ability to invade intestinal cells as well as by a lower rate of phagocytosis in the early steps of infection. This study increased our knowledge on the pathogeny of S. Typhimurium infection in pigs.

Most of the chemical reactions of living cells are catalyzed by protein enzymes. These enzymes are very efficient and display a high degree of specificity with respect to the reaction catalyzed. Cellular activities depend critically on the precise three-dimensional structure and function of thousands of enzymes. Many enzymes require binding of metal ions or small organic molecules for their function. The organic molecules that are indispensible components of catalysis by proteins are called coenzymes. Pyridoxal 5ʹ-phosphate (PLP) is a versatile coenzyme found in all living cells. PLP-dependent enzymes play a key role in the function of most of the enzymes catalyzing reactions in the metabolic pathways of amino acid synthesis and degradation. The enzyme pyridoxal kinase serves to make available the co-enzyme PLP to apo-PLP dependent enzymes. Because of their key role in cellular function and their medical importance, the structure and function of PLP-dependent enzymes have been extensively investigated. In the past decade, detailed investigations on the structure and function of several PLP-dependent enzymes have been carried out in our laboratory. The enzymes studied are B. subtilis serinehydroxymethyl transferase (SHMT), S. typhimurium acetylornithine aminotransferase (AcOAT), S. typhimurium and E. coli diaminopropionate ammonia lyase (DAPAL), S. typhimurium D-serine dehydratase (DSD), S. typhimurium D-cysteine desulfhydrase (DCyD) and S. typhimurium arginine decarboxylase (ArgD). The extensive studies conducted on PLP-dependent enzymes in our laboratory during the past decade has not only resulted in deeper understanding of their structure and function but also raised several new questions regarding substrate recognition, reaction specificity, role of active site residues in the catalytic reaction, mechanism of catalysis and potential applications of these enzymes. This thesis is an attempt to answer some of these questions. The thesis also presents the structure and function of a new protein, Salmonella typhimurium pyridoxal kinase, the enzyme that provides PLP for PLP-dependent enzymes. Single crystal X-ray diffraction technique is the most powerful tool currently available for the elucidation of the three-dimensional structures of proteins and other biological macromolecules and for revealing the relationship between their structure and function. X-ray diffraction studies have provided in depth understanding of the topology of secondary structural elements in the three-dimensional structures of proteins, the hierarchical organization of protein domains, structural basis for the substrate specificity of enzymes, intricate details of mechanisms of enzyme catalyzed reactions, allosteric regulation of enzyme activity, mechanisms of feed-back inhibition, structural basis of protein stability, symmetry of oligomeric proteins and their possible biological implications and a myriad of other biochemical and biophysical properties of proteins. The work reported in this thesis is primarily based on X-ray diffraction studies. X-ray crystal structure investigations are complemented by spectral and biochemical studies on the catalyzed reactions. The thesis begins with an introduction to PLP-dependent enzymes and presentation of a brief summary of the earlier work carried out in our laboratory on PLP-dependent enzymes (Chapter 1). A brief description of earlier functional classification of PLP-dependent enzymes and the more recent classification of these enzymes into the four groups based on their three-dimensional structure is provided. Although enzymes belonging to these four structural classes have evolved from independent evolutionary lineages, they share some common features near their active sites and in the mode of PLP binding. Earlier work carried out elsewhere on pyridoxal kinase and its key role in maintaining PLP at a low concentration in the cytosol is presented. Different mechanisms that have been proposed for the transfer of PLP from pyridoxal kinase to other apo PLP-dependent enzymes are briefly described. The experimental procedures and computational methods used during the course of these investigations to obtain the results reported in chapters 3-6 are presented in Chapter 2. Most of these methods are applicable to the isolation of plasmids, cloning, over expression, protein purification, mutant construction, crystallization, X-ray diffraction data collection and processing, structure elucidation and refinement, validation and structural analysis presented in the next three chapters. Various programs and protocols used for data processing, structure determination, refinement, model building, structure validation and analysis are also briefly described. In chapter 3, the role of a number of active site residues in the reaction catalyzed by EcDAPAL, a fold type II PLP-dependent enzyme, the structure of which was determined earlier in the laboratory is explored by mutational, biochemical and structural analyses. Earlier studies had established the probable role of Asp120 and Lys77 in the reaction leading to the breakdown of D-DAP and L-DAP, respectively (Bisht et al., 2012). To further validate the earlier observations, a number of active site mutants were generated for Asp 120 (D120N, D120C, D120S and D120T), Asp 189 (D189N, D189C, D189S and D189T), Lys77 (K77T, K77H, K77R and K77A), His 123 (H123L) and Tyr 168 (Y168F). The structure of D120N mutant crystal obtained after soaking in crystallization cocktail containing D-DAP revealed the presence of an intact external aldimine complex at the active site supporting the earlier proposal that Asp120 is the base abstracting the Cα proton from the D-isomer of DAP. Biochemical and structural observations suggested that none of the Asp189 mutants may bind PLP and were catalytically inactive suggesting an essential role for Asp189 in catalysis. In contrast to type I PLP-dependent enzymes, none of the Lys 77 mutants of EcDAPAL could bind PLP either covalently or non-covalently and were inactive with both the isomers of DAP. Thus, Lys77 appears to be important for both PLP binding and catalysis. H123L mutant formed an external aldimine with D-DAP and a gem-diamine complex with L-DAP indicating that this residue is also crucial for catalysis. These studies have provided additional support to the catalytic mechanism of EcDAPAL proposed earlier. The next Chapter 4 explores the structure, function and catalytic mechanism of Salmonella typhimurium DAPAL (StDAPAL). The protein was purified from a construct carrying a hexa-histidine tag at the C-terminus by Ni-NTA chromatography. The purified protein was demonstrated to be homogeneous by SDS-PAGE and MALDI-TOF. Crystals of StDAPAL belonging to the C-centred monoclinic space group (C121) with four molecules in the asymmetric unit were obtained by the micro batch method and used for collecting X-ray diffracting data. The crystal structure was determined by molecular replacement using the homologous enzyme from E. coli (PDB code 4D9M, Bisht et al., 2012), which shares a sequence identity of 50% with the S. typhimurium enzyme as the phasing model in the program Phaser (McCoy et al., 2007) of the CCP4 suite. The model was refined with Refmac5 of CCP4 suite to R and Rfree values of 25.5% and 30.9%, respectively. A superposition of the structure so obtained over EcDAPAL revealed that the two structures are very similar. A sulfate molecule bound to the active site of StDAPAL could be located. The position of the sulfate corresponds to that of the carboxyl group of aminoacrylate intermediate of EcDAPAL (4D9M). The PLP was bound to Lys78 as an internal aldimine. Since the active sites of the two protomers in fold type II PLP-dependent enzymes are independent, it might be possible to obtain functional monomers of EcDAPAL. With this view, mutation of a conserved Trp (Trp399) present in the dimeric interface resulted in the destabilization of the dimeric interface and partial conversion of the dimeric protein to a monomeric protein. However, the monomeric species of EcDAPALW399R was unable to bind PLP and hence did not possess any catalytic activity. This highlights the importance of dimeric organization for efficient binding of PLP as well as for the activity of the enzyme. A remarkable difference between EcDAPAL and StDAPAL is the absence of a disulfide bond between residues Cys271 and Cys299 in StDAPAL equivalent to the bond formed between Cys265 and Cys291 in EcDAPAL. Mutation of Cys265 and Cys291 of EcDAPAL to Ser did not affect the activity of the enzyme towards either of the isomers of the substrate indicating that the disulfide bond is not crucial for enzyme activity. The stability of the loop corresponding residues 261-295 of EcDAPAL was believed to be promoted by the disulfide bond. However, the equivalent loop was found to be ordered in StDAPAL even though the disulfide bond is absent. In contrast to StDAPAL, EcDAPAL did not show any metal dependent activity. The previous two chapters dealt with fold type II PLP-dependent enzymes. In contrast, Chapter 5 deals with revisiting the structure and function of a fold type I PLP-dependent enzyme, Salmonella typhimurium arginine decarboxylase (StADC). ADC is a very large polypeptide in comparison with other fold type I enzymes. It is induced when the bacterium is subjected to low pH and plays a major role in protecting the cells from acid stress. The structure of StADC was determined but not satisfactorily refined by Dr. S. R. Bharat earlier. The X-ray diffraction data collected by Bharat needed to be improved and the structure needed to be further refined and compared with the homologous E. coli enzyme. Therefore, the entire process of data processing, structure solution and refinement was repeated. The refined structure of StADC was found to correspond to the apo form of the enzyme with only a phosphate molecule occupying the position equivalent to that of 5’ phosphate of PLP observed in EcADC holo enzyme structure. This allowed examination of structural changes that accompany PLP binding and formation of an internal aldimine. The apo to holo transition in StADC involves the movement and ordering of two loops consisting of residues 151-164 and 191-196 which are in the linker and PLP binding domains of the protein, respectively. Phosphate binding by itself appears to be insufficient for these structural changes. These two loops are close to the PLP binding site of the other protomer of the dimer. Hence, these movements are probably important for the catalytic function of the enzyme. Holo ADC has been found as a decamer in other studies. The decameric form of the apo-StADC suggests that PLP binding may not be essential for the oligomeric state of the protein. ADC appears to reduce proton concentration inside the cell in two ways; (i) by surface charge neutralization and (ii) by arginine decarboxylation by extracting a proton from the cytoplasm. The resulting product agmatine is exchanged for extra cellular arginine by arginine-agmatine antiporter. The low sequence identity and lack of structural similarity of the inducible and constitutive forms of ADC from S. typhimurium shows that these are unlikely to be products of divergent evolution. The final chapter 6 of the thesis presents the work carried out on S. typhimurium pyridoxal kinase (PLK). In the salvage pathway of pyridoxal 5’phosphate (PLP), PLP is produced as the product of the reaction catalyzed by PLK using PL, PN and PM as substrates. Thus, PLK plays the critical role of ensuring availability of PLP to the large number of PLP-dependent enzymes. S. typhimurium PLK was purified to homogeneity, crystallized in its native as well as ligand bound forms. It was necessary to circumvent an unusual problem caused by spots arising from a contaminant crystal to obtain the structure of the native crystals of PLK that belonged to the P212121 space group with two protomers in the crystal asymmetric unit. It was then straight forward to determine the ligand bound structures of StPLK (space group P43212) obtained by co-crystallization with ATP, PL and Mg2+ by molecular replacement using the wild type structure as the phasing model. The structures obtained by co-crystallization revealed the presence of ADP, Mg2+ and a PL bound to the active site Lys233 via a Schiff base (internal aldimine). This is the first structure in which the presence of an internal aldimine in the active site of PLK has been observed. Formation of the internal aldimine might be one way to prevent the release of excess PLP and protecting the cell from PLP induced toxicity. The enzyme was shown to be inhibited by the product which will also help in maintaining PLP concentration at low levels. It was also demonstrated that PLK interacts with apo-PLP-dependent enzymes. This observation supports possible direct transfer of PLP from PLK to PLP-dependent enzymes. The thesis ends with an appendix where the work carried out during the course of the thesis work but not as part of the thesis is briefly described.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Juliana Lacerda Dissertacao.pdf: 580972 bytes, checksum: afedaefa404680a1d528d495b7558c61 (MD5) Previous issue date: 2011-02-26 / The objective of this study was to verify the physical, chemical and microbiological quality of Japanese quail eggs artificially contaminated with Salmonella Typhimurium, sanitized and stored at different temperatures (between 5 and 25 ºC) for 27 days. We used 768 eggs with opaque shells (Experiment 1) and bright shells (Experiment 2) with typical pigments of the species and average weight of 11 g. The experimental design was completely randomized in a 2x2x2 factorial arrangement (contamination x sanitation x cooling) with six replications, with one egg per experimental unit. The eggs were contaminated by handling with 1.5 x 105 colony forming unit (CFU) of Salmonella Typhimurium / mL and according to the treatments, sanitized with 5ppm Cl a solution, and stored at 5 or 25 ° C. The physical (egg weight, specific gravity, shell thickness, yolk, albumen and shell ratio, Haugh unit, yolk albumen index), chemical (pH of yolk and albumen) and bacteriological (bacterial count in eggshell and egg content) qualities were analyzed. Results of Experiment 1 showed a inear regression of sorage time (P <0.05) of storage time (up to 27 days) worsening the variables of egg weight, albumen and yolk index and albumen ratio. A quadratic effect (p <0.05) of storage time worsening the pH of albumen and Haugh units. There was an interaction for the yolk pH variable between sanitation and refrigeration (p <0.05) after 27 days, while those for non refrigerated eggs the best result was for sanitized eggs, showing the importance of sanitization. In Experiment 2 (eggs with bright shells) there was a linear effect (P <0.05) of storage time (27 days), worsening the variables of egg weight, albumen ratio and Haugh units and quadratic effects (p <0.05) worsening albumen index and pH. These results indicate that eggs with opaque or bright, had a poorer quality with increasing internal storage time, especially at 25 ° C. Quail eggs with opaque or bright shell, stored up to 27 days, should be sanitized (5 ppm of chlorine) and cooled to 5 ° C during storage to maintain physical and chemical qualities, regardless of bacterial contamination. The sanitization (5 ppm Cl) and cooling (5 º C) are effective in reducing the growth of Salmonella in experimentally infected quail eggs. / Objetivou-se com este estudo verificar a qualidade física, química e microbiológica de ovos de codornas japonesas contaminados artificialmente com Salmonella Typhimurium, sanitizados e armazenados a diferentes temperaturas (5 e 25 ºC) durante 27 dias. Foram utilizados 768 ovos com cascas opacas (Experimento 1) e brilhantes (Experimento 2) com pigmentos típicos da espécie e com peso médio de 11 g. O delineamento empregado foi inteiramente casualisados com esquema fatorial 2x2x2 (contaminação x sanitização x refrigeração) com seis repetições, sendo um ovo a unidade experimental. Os ovos foram contaminados pelo manuseio com 1,5 x 105 unidade formadoras de colônias (UFCs) de Salmonella Typhimurium/mL e de acordo com os tratamentos foram sanitizados com solução com 5ppm de Cl e armazenados a 5 ou 25 ºC. Foi analisada a qualidade física (peso do ovo, gravidade específica, espessura de casca, percentagem de gema, albume e casca, unidade Haugh, índices de gema e albume), química (pH de gema e albume) e bacteriológica (contagem de bactérias na casca e no conteúdo do ovo). Os resultados de peso do ovo, uH, índice de gema e de albume e pH de gema e de albume, quando contaminados experimentalmente com Salmonella Typhimurium prejudicou a qualidade física do ovo a partir de 18 dias de armazenamento. Com relação a qualidade bacteriológica do ovo, a sanitização com 5 ppm de Cl pode ser uma alternativa simples e de baixo custo para reduzir a possibilidade de contaminação por Salmonella em ovos de codornas. Pode-se afirmar, que o tempo de estocagem dos ovos e a temperatura de armazenamento influenciaram a qualidade interna dos ovos de codornas em todas as variáveis estudadas. Esses resultados indicam que ovos com cascas opacas ou brilhantes, apresentaram pior qualidade interna com o aumento do tempo de armazenamento, principalmente na temperatura de 25 ºC. Ovos de codornas com casca opaca ou brilhante, armazenados até 27 dias, devem ser sanitizados ( 5 ppm de cloro) e refrigerados a 5 ºC durante a estocagem para manter a qualidade física e química, independentemente da contaminação por bactérias. A sanitização (5 ppm de Cl) e a refrigeração (temperatura de 5 ºC) são eficientes na redução do crescimento da Salmonella em ovos de codornas contaminados experimentalmente.

Flagelina, a subunidade estrutural dos flagelos bacterianos, pode ser empregada em estratégias vacinais como carregadora de epitopos antigênicos fusionados ou como adjuvante. Neste trabalho avaliamos a imunogenicidade e o potencial vacinal das flagelinas Salmonella enterica sorovar Typhimurium em camundongos BALB/c após administração pelas vias oral ou intraperitoneal. Os resultados indicam que animais imunizados pela via oral com linhagens flageladas de S. Typhimurium não desenvolvem respostas de anticorpos, sistêmicos ou secretados, anti-flagelina, por outro lado, ativam respostas celulares específicas para as flagelinas em função da via de administração utilizada. Observamos ainda que as diferentes flagelinas testadas apresentam efeito adjuvante quando co-administradas pela via nasal com a fímbria CFA/I de ETEC. Em suma, os resultados apresentados contribuem para um melhor conhecimento sobre as propriedades imunológicas e adjuvantes das flagelinas de S. Typhimurium e agregam informações para o uso racional dessas proteínas em formulações vacinais. / Flagellin, the structural subunit of bacterial flagella, can be used in vaccine development as a fused antigenic epitope carrier or as an adjuvant. In this work we evaluated the immunogenicity and vaccine approach of S. Typhimurium flagellin in BALB/c mice after administration by oral or intraperitoneal route. Our results indicate that mice immunized by oral route with flagellated S. Typhimurium strains do not develop any anti-flagellin antibody response, be it serum or secreted. On the other hand, specific anti-flagellin cellular response was observed depending on the chosen route of immunization with S. Typhimurium attenuated strain. Furthermore, all flagellins tested proved to be efficient adjuvants when co-administrated with CFA/I fimbriae by nasal route. Together, these results contribute to a better understanding of the immunological and adjuvant properties of S. Typhimurium flagellins and also provide information on the rational use of these proteins in vaccine development.

Einleitung: Salmonellen und Yersinien haben als zweit- und dritthäufigste Verursacher bakterieller Gastroenteritiden in Deutschland und Europa im Jahr 2017 eine große Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. Übertragen werden sie hauptsächlich durch den Verzehr roher, unzureichend gekühlter oder ungenügend erhitzter Schweinefleischerzeugnisse (Schweinemett, Hackepeter, kurz gereifte Rohwürste). Der Eintrag in die Lebensmittelkette erfolgt über symptomlose Trägertiere, die am Schlachthof in der Lebendund Fleischuntersuchung nicht als solche identifizierbar sind. Durch Kreuzkontaminationen kann es zur Verschleppung der Erreger auf die Schlachttierkörperoberflächen eigentlich gesunder Tiere kommen. Die vorherrschenden Hygienemaßnahmen am Schlachthof haben bisher nicht zu einer Verringerung des Auftretens dieser Bakterien geführt. Alternativ könnte gepulstes Licht (GL) als zusätzliches Dekontaminationsverfahren zum Einsatz kommen. Dessen antimikrobielle Wirksamkeit wurde bereits in zahlreichen Studien nachgewiesen. In der Literatur fehlten jedoch bislang Daten zur Inaktivierung von Salmonella ssp. auf Schwarte und Schweinelachs. Bezüglich Yersinia ssp. lagen noch gar keine Studien vor. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war es, die Inaktivierung beider Erreger auf oben genannten Matrices zu testen und, unter Berücksichtigung chemischer und sensorischer Attribute der Produkte sowie die Eignung des Verfahrens für die Praxis abzuschätzen. Material und Methoden: Für die Untersuchungen mit künstlich inokulierten Schwarte- und Schweinefleischproben wurden die humanpathogenen Bakterien S. Typhimurium und Y. enterocolitica (Biotyp 4) verwendet. Die antimikrobielle Wirkung von GL wurde bei Fluences zwischen 0,52 und 19,11 J/cm² geprüft. Farb- bzw. Temperaturveränderungen auf der Probenoberfläche wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers (CM 600 d, Konica Minolta) respektive eines Infrarotthermometers (104 IR, Testo) ermittelt. Zur Beurteilung der Lipidoxidation wurde die TBARS-Methode angewandt und die Proben maximal 10 Tage bei 4° C gelagert. Veränderungen bezüglich des Geruchs wurden bei Fluences von 0.52, 4.96 und 12.81 J/cm² mittels eines Konsensprofils beurteilt. Ergebnisse: Auf Schwarte konnten innerhalb von Sekunden Reduktionen von 1,73-3,16 log (S.) und von 1,48-4,37 log (Y.), auf Schweinelachs hingegen 1,7 log-Stufen für beide Mikroorganismen erreicht werden. Moderate bis starke Behandlungsregime (≥7,36 J/cm²) führten zu einer deutlich wahrnehmbaren Farbveränderung (E*ab ≥ 3) von Schwarte, ab 9,66 J/cm² zu einem signifikanten Verlust des roten Farbanteils von Schweinelachs. Zur Bewertung einer forcierten Fettoxidation wurde Malondialdehyd (MDA) in den Proben quantitativ bestimmt. Keine der getesteten Einstellungen hatte eine Überschreitung des Grenzwertes von 0,5 μg/g, ab dem Testpersonen die Produkte als ranzig wahrnehmen, zur Folge. Eine Überprüfung des Geruches erfolgte anhand von drei getesteten Fluences, die eine niedrige (0,52 J/cm²), moderate (4,96 J/cm²) und starke (12,81 J/cm²) Behandlung repräsentieren sollten. Mit 0,52 J/cm² bestrahlte Schwarte wurde von den Panel-Mitgliedern als weniger nach Schwein und weniger fettig riechend bewertet und somit als angenehm empfunden, ansonsten wurden chemische Gerüche wahrgenommen. Schlussfolgerungen: Aus den erzielten Daten geht hervor, dass sich gepulstes Licht in niedrigen Dosen (≤0,52 J/cm²) zur Dekontamination von Schwarte eignet. Praktisch umsetzbar wäre dies am Schlachthof als geschlossene Behandlungskammer, unmittelbar nach der Eviszeration. Somit könnte der noch nicht geteilte Schlachtkörper oberflächlich behandelt werden, ohne das unter der Haut befindliche Fleisch zu erreichen und die oben genannten Veränderungen hervorzurufen. Notwendig ist hierbei die Gewährleistung des Arbeitsschutzes. In diesem Zusammenhang muss entstehendes Ozon unschädlich beseitigt werden und das Tragen einer UV-Schutzbrille in der unmittelbaren Umgebung des Gerätes angeordnet werden. Abschließend ist hervorzuheben, dass das GL als zusätzliche, unterstützende Maßnahme zur Bekämpfung von Lebensmittelinfektionserregern zu sehen ist und keine bestehenden Hygienemaßnahmen (gute Hygienepraxis) ersetzen darf. Aufgrund der geringeren Wirksamkeit auf Schweinelachs und den damit verbundenen geruchlichen Veränderungen ist eine Applikation auf Schweinefleisch ohne weiterführende Untersuchungen nicht zielführend.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72 / Introduction: Since Salmonella ssp. and pathogenic Yersinia ssp. were the second and third most frequent causes for bacterial gastroenteritis in Germany and throughout Europe in 2017 they are of high significance as foodborne infectious agents. They are mainly transmitted by consumption of raw, inadequately cooled or insufficiently heated pork meat products (ground pork, minced pork, shortly ripened raw sausages). Subclinically infected pigs, so-called “carriers”, cannot be detected during ante- and post-mortem inspection in the slaughterhouse. Cross-contamination can lead to bacterial dissemination onto actually S.- or Y.-free carcasses. Prevailing hygienic measures could not reduce bacterial prevalence in the abattoir so far. Thus, pulsed light (PL) may be used as an additional decontamination procedure. Its antimicrobial potential was proven in numerous studies. However, there are no data in the scientific literature about inactivation of Salmonella ssp. on pork skin and loin. Moreover, no experiments with Yersinia in connection with pulsed light have been performed until now. Aim of this study: Hence, the aim of this work was to investigate the inactivation of both microorganisms on above-mentioned matrices and to assess the suitability of the PL treatment for implementation in a slaughterhouse considering chemical and sensory alterations of the products. Materials and Methods: For experiments with artificially inoculated pork skin and loin samples human-pathogenic bacteria S. Typhimurium and Y. enterocolitica (Biotype 4) were used. The antimicrobial effect of PL was tested at fluences between 0.52 and 19.11 J/cm². Color and temperature changes on the sample surface were determined by means of a spectrophotometer (CM 600 d, Konica Minolta) or an infrared thermometer (104 IR, Testo). The TBARS method was used to assess lipid per-oxidation and the samples were stored at 4° C for a maximum of 10 days. Odor changes were appraised at fluences of 0.52, 4.96 and 12.81 J/cm² using consensus profiling. Results: On pork skin reductions of 1.73-3.16 log (S.) and of 1.48-4.37 log (Y.) were achieved within seconds. In contrast, on pork loin only 1.7 log of both microorganisms were maximally inactivated. Moderate to strong treatments (≥7.36 J/cm²) led to distinct color changes (E*ab ≥ 3) in pork skin, fluences above 9.66 J/cm² to a significant loss of red color in pork loin. For evaluation of possible accelerated lipid peroxidation malondialdehyde (MDA) was analyzed quantitatively in samples. None of the tested parameter combinations resulted in threshold value exceedance of 0.5 μg MDA/g which is the point where panel members start to perceive products as rancid. Odor appraisal was carried out using three fluences representing a mild (0.52 J/cm²), moderate (4.96 J/cm²) and strong (12.81 J/cm²) treatment. Pork skin treated with 0.52 J/cm² was assessed as less porky, less fatty and, thus, pleasant by panel members, apart from that chemical odors were perceived. Conclusions: From the available data it appears that pulsed light could be used in mild doses (≤0.52 J/cm²) for pork skin decontamination. Practically, a PL-unit could be designed as a closed chamber, implemented directly after the evisceration in the abattoir. This way, the not yet separated carcass could be treated superficially without reaching the meat surface preventing the above-mentioned alterations. Guarantee of safety at work also plays an important role. Emerging ozone must be evacuated safely and UV-protection glasses should be worn in direct proximity to the PL-system. Finally, one needs to consider, that PL should be regarded as an additional, supportive measure to control foodborne pathogens and not as a replacement for existing hygiene standards (good hygiene practice). An application on pork meat does not seem to be conducive because of its lower effect on pork loin and the associated odor changes.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72

ZUSAMMENFASSUNG Haukur Lindberg Sigmarsson PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen. Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h. sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und wenn positiv auch mittels PCR untersucht. Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten Woche post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch und wie erwartet wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.